Proteome Science, 2005; 3: 7-7 (más artículos en esta revista)

Afines péptido-ligando del receptor de la cartografía dirigida por fagos pantalla

BioMed Central
Thomas Stratmann (thomas.stratmann @ ub.edu) [1], Angray S Kang (askpom@adelphia.net) [1]
[1] Departamento de Biología Molecular, The Scripps Research Institute, 10550 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, EE.UU.
[2] Universidad de Barcelona, Departamento de Fisiologia, Diagonal 645, 3 º, 08028 Barcelona, España

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Resumen
Antecedentes

Un método de visualización rápida de fagos para el esclarecimiento de péptido afines ligando específico para los receptores se describe. El enfoque puede ser fácilmente integrada en la interfaz de estudios genómicos y proteómicos para identificar ligandos biológicamente relevantes.

Métodos

Una biblioteca de fragmentos de genes de la gripe capa de proteína hemaglutinina (HA) de genes fue construido por el tratamiento de HA con cDNA DNAse I para crear 50 - fragmentos de 100 pb. Estos fragmentos fueron clonados en el plásmido pORFES IV y en el marco de las inserciones han sido seleccionados. Estas en el marco de fragmentos insertos posteriormente fueron clonados en un vector de visualización fagos filamentosos JC-M13-88 para mostrar como fusiones superficie a una copia del gen sintético VIII. Dos anticuerpos así caracterizado, mAb 12CA5 y pAb 07431, dirigido contra distintas regiones conocidas de HA se utilizaron para mover la biblioteca.

Resultados

Dos epítopos lineales, HA péptido 112 - 126 y 162-173, reconocido por mAb 12CA5 y pAb 07431, respectivamente, fueron identificados como los epítopos afines.

Conclusión

Este enfoque es una útil alternativa a los métodos convencionales, como el cribado de la superposición de péptido sintético bibliotecas de genes o fragmentos de expresión bibliotecas en la búsqueda de interacciones proteína péptido precisa, y puede ser aplicada a la proteómica funcional.

Antecedentes

Los enfoques convencionales para dilucidar las interacciones proteína péptido incluyen la proyección de la superposición de péptidos sintéticos secuencial [1, 2], péptido fragmentos creados por digestión enzimática [3] o fragmentos de genes expresados creada por las tecnologías del ADN recombinante [4]. Durante más de una década, la tecnología de visualización de fagos se ha aplicado a dilucidar las interacciones proteína-proteína. Random péptido bibliotecas han sido útiles para predecir epítopo imita secuencia de ligandos desconocido. Los epítopes de los anticuerpos se han pronosticado el consenso de las secuencias de motivos derivados de la alineación original de la proteína con la secuencia de interés [5, 6]. Cuando el ligando original no se conoce, es posible predecir posibles secuencias consenso vinculante. Castaño y colegas predijeron un motivo vinculante para CD1 murino utilizando un 22 aminoácidos azar biblioteca [7]. En algunos casos, el ligando y el receptor se conocen y precisa la interacción entre los dos puede ser determinada empíricamente, como se indica más arriba. Un semi-empíricos enfoque implica mostrar que se generan aleatoriamente fragmentos de los genes diana sobre fagos fd [8]. El método se ha utilizado para dilucidar epítopos para mAbs dirigidos contra el virus de la fiebre catarral ovina exterior cápside proteínas [9], humanos-inhibidor del activador del plasminógeno 1 [10], Drosophila subunidad grande de la RNA polimerasa II, p53 humano, y lo humano citoqueratina 19 [11 ].

En este estudio, se presenta la cartografía epítopo de un anticuerpos monoclonales y policlonales dirigidos contra la gripe capa de proteínas HA por un enfoque en dos etapas. En primer lugar, el objetivo de cDNA se digiere con DNAse I azar y clonado en una pre-selección plásmido Open Reading Frame Expresión y secreciones (pORFES IV), que se describe en la patente de EE.UU. 6586236 [12], entre el líder ompA secuencia y la β-lactamasas de genes . El líder dirige secuencia de péptido-β-lactamasas a la fusión de E. periplásmico Coli.

Fragmentos, que no restaurar el marco de lectura abierta de la β-lactamasas, así como la no-secretora de las inserciones, se eliminan por propagar selectivamente en presencia de carbenicilina. En segundo lugar, el seleccionado inserciones se transfieren a una superficie de visualización de vectores fagos JC-M13-88 [13, 14] para que se visualice en p8 (codificada por un gen de copia sintética VIII). El método permite la construcción de las bibliotecas de los sistemas complejos (mezcla de ADNc) o, posiblemente, el ADN genómico. El enfoque permite demostrado aquí rápida y precisa cartografía de los epítopos reconocidos por anticuerpos cDNA utilizando la codificación de la proteína objetivo de construir una biblioteca epítopo pantalla.

Resultados
Construcción de un fragmento al azar hemaglutinina epítopo biblioteca como β-lactamasas proteína de fusión

Un epítopo fragmento de la biblioteca de genes HA gripe (influenza X-31 [H3N2], [15]], se ha generado por azar HA digerir el ADN con DNAse I. Las condiciones generales se han ajustado con el fin de crear predominantemente 50 - 100 bp fragmentos que se Posteriormente clonado en el vector modificado pORFES [12]. El "vacío" pORFES IV contiene un vector ompA líder seguido por el gen β-lactamasas, que está fuera de cuadro, como se muestra en la Figura 1. Inserción de fragmentos de ADN en el sitio que NaeI restaurar el marco de lectura entre el líder y el ompA β-lactamasas de codificación de la secuencia, y permite la secreción de permisos para el uso positivo de selección de los antibióticos β-lactámicos. E. Coli XLOLR electrocompetent células fueron transfectadas con la ligadura de los productos. Después de 1 hora de recuperación a 37 ° C, alícuotas de las células se chapada en placas de agar LB que contiene cloranfenicol ya sea sola o en combinación con carbenicilina. Dado que el crecimiento de las células en presencia de carbenicilina requiere de la restauración de β-lactamasas marco de lectura, que crecen en colonias de cloranfenicol por sí solo sirvió como una representación de que el número total de sucesos de transformación, independientemente de la presencia o de la naturaleza de la inserción (es decir, que contiene tanto la libre - Ligated vector sin una inserción, el vector o ligated con una inserción, pero no necesariamente en el marco de β-lactamasas). Como era de esperar, aproximadamente 1 / 3 de sucesos de transformación como resultado el restablecimiento de la correcta marco de lectura. El tamaño de la biblioteca en la primaria HA pORFES fue determinado por enchapado en placas de agar que contiene carbenicilina y cloranfenicol.

Aproximadamente 1,7 × 10 6 clones independiente se generaron. Desde que se inserte podría tener una de las dos orientaciones posibles en tres marcos de lectura, y ya que algunos de estos fragmentos puede tener incluyen codones de parada, en teoría, menos de 1 / 6, de todos los clones que codifican péptidos afines HA. Sobre la base de esta hipótesis, el tamaño de la biblioteca de péptidos afines HA se estima contienen aproximadamente 2,8 × 10 5 clones independiente.

La clonación de los fragmentos de la hemaglutinina en la biblioteca JC-M13-88

La amplificación de la biblioteca HA fragmento en pORFES IV permitido la positiva selección de marcos de lectura abierta y proporcionó amplia información para la clonación direccional en la pantalla de vectores JC-M13-88. La única restricción de los sitios, XbaI-HindIII, facilitó la dirección en la transferencia de la biblioteca de pORFES IV en JC-M13-88. Estos XbaI-HindIII fragmentos contienen el sitio de unión de los ribosomas, la secuencia ompA líder seguido de la inserción al azar de la biblioteca. A pesar de que la digestión del ADN producido principalmente 50 - fragmentos de 100 pb, los fragmentos más grandes también se encuentran en el pORFES vector. Con el fin de obtener sólo péptidos de una longitud de alrededor de 15 a 30 aminoácidos, la XbaI HindIII fragmentos-se resolvieron en un gel de TBE y fragmentos de ADN con el tamaño adecuado eluyen. Clonación en las bibliotecas JC-M13-88 ofrece 6 × 10 6 clones independiente de la biblioteca HA fagos. Esta cifra es diez veces mayor que la original pORFES IV HA tamaño de la biblioteca. Este exceso de representación asegura que la mayoría de los miembros de la biblioteca se transfieren al sistema de visualización.

Desplazamiento de la hemaglutinina fragmento biblioteca contra mAb 12CA5

El bien caracterizado mAb 12CA5 que se une a la secuencia HA YPYDVPDYAS [16] se utilizó para la pantalla inicial HA biblioteca antes de paneo con el fin de determinar la frecuencia inicial de los fragmentos de péptidos afines. Aproximadamente 4100 placas de los ingenuos (es decir, antes de panning), la biblioteca se analizaron por sondaje filtro de los ascensores con mAb 12CA5. Inicialmente, sólo el 0,4% fueron inmunorreactivas placas. Este número aumentó con cada ronda de selección. La biblioteca fue sometido a 3 rondas de panning contra mAb 12CA5. La segunda ronda de panning dado lugar a un aumento de 12.000 veces eluyen de fagos (2300 veces más de fondo). Aproximadamente el 18% de las placas firmemente manchadas con mAb 12CA5. Este número aumentó a 42% después de la tercera ronda de selección (Figuras 2, 3, 4]. Fagos del 6 manchadas placas fueron aisladas e insertar la secuencia de ADN determinado. Los resultados se muestran en la Tabla 1 (ver archivo adicional 1]. La mitad de los clones son idénticos mientras que los otros 3 clones difieren unos de otros. Todos 6 clones YPYDVPDYAS figura el motivo.

Desplazamiento de la hemaglutinina fragmento biblioteca contra pAb 07431

Posteriormente, la biblioteca se evaluó utilizando un conejo IgG policlonal planteadas contra el péptido CKRGPDSGFFSRLNWLYKSG. Cuando placas 2400 de la primera biblioteca fue tamizada por el filtro de levantar inmunorreactivas clones, una mayor tinción de fondo se observó en relación con filtro ascensores manchadas de mAb 12CA5. Sin embargo, se encontró una placa firmemente a la mancha con la pAb 07431. Durante la selección, el número de fagos eluyen aumentó con cada ronda. Después de la tercera ronda, el 91% de placas obligado a pAb 07431 determinada por el filtro ascensores (Figuras 5, 6, 7]. Un análisis de secuencias de 16 clones reveló sólo el 3 secuencias diferentes, como se muestra en el Cuadro 2 (ver archivo adicional 2]. Todas las secuencias seleccionadas de la figura GFFSRLNWLTKS el motivo de que forma parte de los péptidos utilizados para la vacunación. El péptido inmunitario se deriva de la cepa de gripe X47 (HA1, [17]], y difieren por la sustitución de una sola T en Y de la genética utilizada para este estudio (derivados de la gripe X-31 [H3N2]), como se indica en la Tabla 2. A pesar de este punto, el enfoque de variación permitido la recuperación de la epítopo.

Curiosamente, sin embargo, los clones TSS 399 y 401-403 codifican secuencias adicionales resultantes de los cambios y de un marco de múltiples eventos de inserción. Una explosión de búsqueda de la secuencia de nucleótidos codificación de la SAT 399 péptido en fagos (5 '- ACT TGT GGG CCT CCG AGA GAG GCA ACA TTA GGT GCA ACA TTT GCA GAG TTT GGT TGT AGC TTT GGT TTC AGT AAC TGG AGA CTG TTG CAC TCA AAA -3 ') En GenBank (código de acceso V01103), reveló que nucleotide1-54 (que se muestra en negrita) alineados con los nucleótidos 1681-1734 de HA (marco incorrecta). Como era de esperar, una búsqueda con la codificación correspondiente péptido 18-mer (SCGPAREATLG ATFAFEC) no se suman en la HA polipéptido. 57-96 codificación de los nucleótidos afines epítopo HA nucleótidos alineados con 509-548 (en el marco).

Discusión

Aquí se describe un método para el mapeo de epítopos péptido lineal de los genes fragmentados por fagos pantalla. El procedimiento se diferencia notablemente de otros enfoques de fagos exhibición de fragmentos de genes orientados, como son las inserciones funcional preseleccionados antes de fagos pantalla. El vector pORFES IV (plásmido Open Reading Frame expresión y secreción, [12]], permite la selección de los fragmentos positivos que dan lugar a marcos de lectura abierta y permitir la expresión de β-lactamasas. El vector está diseñado de manera que ompA líder secuencia división se produce inmediatamente antes de la adición. La ventaja de este tipo de posicionamiento de la clonación y la división del sitio es que la codifica insertar el N-terminal del polipéptido está representada, no el vector. Esto puede ser importante si el ligando libre requiere una N-terminal para el receptor vinculante. Al seleccionar las bacterias en presencia de carbenicilina somos capaces de rescate plásmidos con inserciones funcional y la transferencia de fragmentos de tamaño deseado en la pantalla de vectores fagos. Convencionales fagos pantalla bibliotecas contienen una mezcla de funcional y no a lo largo de las inserciones con fagos sin insertos. La propagación de fagos sin insertos o no funcionales con inserciones se favorece, que afecta a la biblioteca de fagos composición, la reducción de la complejidad funcional de la biblioteca. Este paso cualitativo garantiza una mayor población de las primeras bibliotecas de fagos codificar y mostrar péptido. Aproximadamente el 87% de todos los eventos de transformación primaria se eliminaron utilizando este paso antes de la selección, lo que implica que sólo el 13% de los eventos fueron de transformación funcional. Esta cifra está de acuerdo con el número previsto de los posibles marcos de lectura abierta generados por este enfoque. Esto también pone de relieve el grado de redundancia en el cribado de las bibliotecas convencionales expresaron secuencias. La etapa de preselección no impide la aparición y acumulación de supresiones o cambios en el marco de fagos propagación. Sin embargo, desde la inicial a partir de biblioteca es altamente funcional (es decir, contiene sólo fagos mostrar péptidos), adquirido estas supresiones o cambios de marco no debe en gran impacto en la utilización posterior de la biblioteca.

Hemos validado el método semi-empíricos orientados a fagos pantalla por la construcción de una biblioteca de azar epítopo el gen que codifica la proteína HA del virus de la gripe. El ADN fue purificado y digerido por electroforesis en gel de agarosa para crear fragmentos de codificación péptidos, de 15 a 35 aminoácidos. Afinidad de selección se llevó a cabo utilizando un mAb y un pAb, que había sido creado por inmunizar a un ratón y un conejo, respectivamente, con péptidos sintéticos que representan a corto HA secuencias. Así, en la sobre-conjunto de estos experimentos, los epítopos reconocidos por estos anticuerpos eran conocidos. Sometiendo a la biblioteca de tres rondas de selección en contra de cualquiera de los anticuerpos, hemos sido capaces de recuperar las dos secuencias de la biblioteca. Desplazamiento contra mAb 12CA5 reveló un 13 aminoácidos larga secuencia de consenso, sólo el 3 aminoácidos más largo que el epítopo informó para este Ab. Cuando la biblioteca se panorámica contra pAb 07431, un consenso secuencia de 12 aminoácidos de longitud se encontró, en representación de la HA péptido 162-173, que figura por el péptido utilizado para la inmunización (AH 157-178).

Desde que recuperó dos epítopes de esta biblioteca epítopo azar, es razonable asumir que una gran representación de los marcos de lectura abierta se habían generado y se muestran. Además de seleccionar la pAb 07431 epítopo, clon 399 SAT también codifican secuencias adicionales que también produjo un marco en el péptido. BLAST simple análisis de las secuencias de nucleótidos y péptidos nos permitió identificar la fuente de la secuencia adicional. Las búsquedas BLAST reveló que dos inserciones en paralelo se había clonado en el vector, el primero fuera del marco y el segundo insertar inframe, lo que arroja un péptido quimérico que contiene la secuencia afines.

Random fragmento epítopo fagos pantalla bibliotecas en combinación con la selección de afinidad son herramientas muy útiles para encontrar ligandos afines a los anticuerpos monoclonales o policlonales, al menos para los epítopos lineales. El método aquí descrito utiliza una preselección paso de las secuencias para enriquecer con marcos de lectura abierta que son fácilmente secretada como proteínas de fusión con β-lactamasas, un requisito previo para su posterior visualización de fagos. Esto garantiza que una mayor proporción de la biblioteca de fagos no sólo codifica un polipéptido, sino que también tiene el potencial para mostrarlo. Este enfoque de la construcción de una biblioteca de fagos pantalla péptido tiene dos características principales: en primer lugar N-terminal del péptido está codificado está representada por la inserción, y en segundo lugar que la mostrada péptidos son unos 15-35 aminoácidos de longitud. Esto es fundamental para que la selección de péptidos de unión a MHC de clase I ó II moléculas. El enfoque se ha aplicado con éxito para la selección de epítopes péptidos derivados de la ovoalbúmina y la descarboxilasa del ácido glutámico específicos para las moléculas MHC de clase II [18, 19]. Esta tecnología podría muy bien ser extendido con éxito a los más complejos sistemas en los que varios ADNc de codificación hasta regulados los genes asociados tumor se procesan para epítopo detección de anticuerpos contra, MHC de clase I ó II moléculas [18], o en otras interacciones proteína-proteína.

Conclusión

Con la velocidad de generación de biblioteca genómica y de ADNc, ya sea superando el emergente campo de la proteómica, un retraso en correlacionar la función de genes a la cartografía y las interacciones proteína-proteína está creando un cuello de botella. En este sentido, en la pista de una posible vía para ayudar en la aclaración de los motivos que interactúan biológicamente relevantes directamente de ADN. El ejemplo descrito utilizaron dos anticuerpos (proteínas) y un antígeno de codificación de ácidos nucleicos (ADN) para desarrollar una prueba de concepto. Además, este enfoque se ha aplicado también a la elucidación del TAG péptidos vinculante a MHC de clase I-II Ag 7 moléculas [18]. Una vez que una proteína clave ha sido identificado, es posible que se pueda utilizar la información genética y selección para identificar ligandos afines.

El uso de pORFES IV para eliminar la "basura" secuencias mejora la calidad de la biblioteca está representada, lo que resulta en una mayor eficiencia paneo. Este enfoque ya se ha aplicado a la mejora de las bibliotecas de fragmentos de anticuerpos [14], y también puede ser aplicado a la creación de una mayor calidad de visualización al azar péptido bibliotecas.

Métodos
Anticuerpos monoclonales y policlonales

El mAb 12CA5 específicas para un péptido HA (YPYDVPDYAS) [16] y el suero policlonal de conejo contra el péptido 07431 (CKRGPDSGFFSRLNWLYKSG) derivados de la Gripe X-47 HA1 fueron amablemente proporcionados por el Dr RA Lerner (The Scripps Research Institute). La fracción IgG de conejo fue purificado a partir de la utilización de proteínas de suero de A-sepharose (Pierce, Rochford, IL, EE.UU.).

Plásmidos y cepas bacterianas

El plásmido Open Reading Frame expresión y secreción IV se basa en (pORFES) [12, 14] con una inserción modificación se muestra en la Figura 1. La pantalla de vectores fagos JC-M13-88 se ha descrito en otras partes [12 - 14]. El anfitrión de cepas de Escherichia coli XLOLR y XL1-Blue se compraron de Stratagene (La Jolla, CA, EE.UU.). Plásmido pCMU codificación HA cDNA (derivados de la gripe X-31 [H3N2], [15]] fue una especie de regalo del doctor G. Aichinger (Hammersmith Hospital, Londres, Reino Unido). Todas las enzimas fueron adquiridas de Boehringer-Mannheim (Indianápolis, IN, EE.UU.).

Hemaglutinina gen proceso de fragmentación

El plásmido pCMU (100 μ g) fue digerido con SmaI / XbaI poner en libertad a la codificación HA insertar. El gel-purificado inserciones (~ 10 μ g de ADN) fue digerido con 70 ng de DNAse en 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, que contenía 40 mM MnCl 2 (130 μ l) durante 4 minutos se sentó a 37 ° C, la reacción fue rescindido por Añadiendo EDTA a una concentración final de 70 mM. Después de la precipitación, los fragmentos fueron tratados con 0,001 unidades de frijol mungo nucleasa por μ g de ADN durante 5 minutos a 37 ° C. El resultado de las mezclas burdo terminado fragmentos fueron ligated entre ompA líder de la secuencia y la β-lactamasas de genes en pORFES IV que se ha digerido con NaeI y tratados con ternera intestino fosfatasa. La ligadura de los productos fueron transfectadas en la no represión de E. Coli XLOLR electroporación y propagado a través de la noche a la mañana en el Super Hermanos con 100 μ g / ml carbenicilina a 37 ° C. Las inserciones que restaurar el marco de lectura y que son fácilmente trasladadas en periplásmico junto con el fundido β-lactamasas β-lactámicos confieren resistencia a los antibióticos. La eficiencia de transfección fue supervisado por planchas de alícuotas sobre placas de agar que contiene 25 μ g / ml de cloranfenicol con o sin 100 μ g / ml carbenicilina. El pORFES IV biblioteca de ADN fue recuperado de la noche a la mañana la cultura y las inserciones liberados por digestión con XbaI y HindIII. Los fragmentos de 160-210 pb se resolvieron en un 3% en gel de agarosa TBE.

Preparación de M13 HA fragmento mostrar biblioteca

El 160-210 pb XbaI / HindIII fragmentos codificar un ribosome sitio de unión, el líder y el ompA HA derivados inserciones. Estos fueron direccional clonado en el vector de fagos JC-M13-88, entre un promotor y un lac copia del gen sintético VIII. La ligadura de los productos fueron transfectadas en XL1-Blue E. Coli células a través de la electroporación y la eficiencia de transfección supervisado por la placa de ensayo. Los fagos se propagó durante 16 horas a 37 ° C en Super Hermanos con 1 mM isopropílico-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) y PEG precipitaciones aisladas por dos veces siguientes métodos estándar [20]. Los pellets de fagos se resuspendido en buffer fosfato salino (PBS) y almacenados a 4 ° C.

Planificacion

La JC-M13-88 que contiene la biblioteca de fragmentos de genes HA se panorámica contra mAb 12CA5 y IgG policlonal de conejo 07431. Multi-así maixisorp tiras (Nalge Nunc Internacional, Naperville, Illinois, EE.UU.) fueron revestidos con 100 μ l de un 8 μ g / ml de anticuerpos en solución PBS o con 5 mg / ml de BSA en PBS (control negativo) a lo largo de la noche a 4 ° C. Los pozos se lavaron 3 veces con PBS que contenía 0,1% de Tween (PBST), bloquearon con 0,5% de BSA en PBS durante 1 h a 37 ° C y lavado como antes. Aproximadamente 10 10 unidades formadoras de placa (ufp) se agregaron en 100 μ l de PBS que contenga un 0,25% y el 0,05% de BSA Tween. El panning se llevó a cabo por duplicado. Después de la incubación durante 90 minutos a 37 ° C, los pozos fueron lavados 10 veces con PBST, los fagos eluye con 100 μ l de 100 mM glicina, pH 2,2, a la temperatura ambiente por 10 minutos y la solución neutralizada mediante la adición de 10 μ l de 1 M Solución Tris (pH no ajustado). Una alícuota de la solución se mantuvo para evaluar la producción de fagos, y el resto se utilizó para infectar E. Coli XL1-Blue células para su propagación, tal como se describe más arriba.

Filtrar ascensores

Para determinar la abundancia relativa de cada uno de los clones vinculante, filtro de los ascensores se llevaron a cabo en la biblioteca antes de panning, y posteriormente después de cada ronda de panning. Fagos placas fueron recubiertas con filtros de nitrocelulosa durante 10 minutos a 37 ° C. Los filtros fueron posteriormente retirados y bloqueados con 0,5% de BSA en PBS durante 1 h en RT y lavado 3 veces con PBST. El mAb 12CA5 y pAb 07431 se ajustaron a 2 μ g / ml PBST y los filtros se incubaron con la solución de Ab 1 h en RT. Los filtros se lavaron como antes y se incubaron con una cabra de anticuerpos anti-ratón (sur de la Biotecnología Associates, Inc, Birmingham, AL EE.UU.), o una cabra anti-conejo IgG F (ab) 2 fragmento (Estados Unidos Bioquímicas Corp, Cleveland , OH, EE.UU.) conjugado con fosfatasa alcalina. Ambos anticuerpos secundarios se diluyeron en PBST (1 μ g / ml concentración final), y los filtros se incubaron durante 1 h en RT. Después de lavar como antes, los filtros se tiñeron con 5-bromo-4-cloro-3-indolylphosphate (BCIP) y 4-nitro azul de cloruro de tetrazolio (NBT).

Análisis de cada uno de los clones

Fagos placas individuales fueron recogidos y crecido la noche a la mañana después de la infección con E. Coli XL1-Blue células [20]. El doble varados forma replicativa (RF) plantilla de la DNA fue secuenciado.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Renuncia

Las opiniones aquí expresadas son las del autor y no pretenden reflejar los de la Universidad de Barcelona.

Contribuciones de los autores

TS fue el investigador graduado en este proyecto. ASK era la PI.All autores leído y aprobado el manuscrito final.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Cuadro 1 - Aproximación de la hemaglutinina aminoácidos 112-133 con 6 péptido secuencias mostradas en JC-M13-88 después de panning contra mAb 12CA5.
Seis clones de la biblioteca HA fagos pantalla se analizaron después de tres rondas de paneo con mAb 12CA5. Todos los clones mostró una reacción positiva en un filtro usando mAb 12CA5 ascensor. Tres clones son idénticos, y todos los clones que figura la secuencia de consenso YPYDVPDYAS contra la que se dirige el mAb (en rojo negrita).
Archivo Adicional 2
Cuadro 2 - Aproximación de la hemaglutinina aminoácidos 157-178 con 15 secuencias de péptido muestra en la JC-M13-88 después de panning en contra de la IgG policlonal de conejo 07431.
15 clones de la biblioteca HA fagos pantalla se analizaron después de tres rondas de paneo con pAb 07431 planteadas contra la hemaglutinina péptido derivado CKRGPDSGFFSRCNWLYKSG. Todos los clones mostró una reacción positiva en el ascensor de un filtro utilizando pAb 07431. Varios clones son idénticos y 3 diferentes secuencias se identificaron. Todos los clones que figura la secuencia de consenso GFFSRLNWLTKS (en azul negrita).
Agradecimientos

Damos las gracias a Rener Xu (Universidad Fudan, China) para la determinación de la secuencia completa pORFES, Lucía Morkes, para la asistencia técnica y Luc Teyton útil para los debates. ASK es un destinatario de un Premio Investigadores del Instituto de Investigación del Cáncer / Partridge Fundación y este trabajo fue apoyado por la Fundación McKnight. Este artículo ha sido asignado manuscrito número 11514-MB de El Instituto de Investigación Scripps.