PLoS Computational Biology, 2005; 1(1): (más artículos en esta revista)

Lo que hace ribosome-transcripcional mediada atenuación sensible a los aminoácidos limitación?

Biblioteca Pública de la Ciencia
Johan Elf, Måns Ehrenberg
Resumen

Ribosome transcripcional mediada por mecanismos de atenuación son comúnmente utilizados para controlar la biosíntesis de aminoácidos operones en las bacterias. El ARNm líder de ese operón contiene un marco de lectura con el "regulador" codones, afines a los aminoácidos que se sintetiza por las enzimas codificadas por el operón. Cuando el aminoácido es corto en la oferta, la traducción de los codones de regulación es lenta, que permite la transcripción de continuar en los genes estructurales de la operón. Cuando la oferta es de aminoácidos en exceso, la traducción de los codones de regulación es rápida, lo que da lugar a la terminación de la transcripción. Utilizamos un discreto maestro ecuación enfoque para formular un modelo probabilístico para el emplazamiento de la RNA polimerasa y los ribosomas en el atenuador líder secuencia. El modelo describe cómo la tasa actual de la oferta de aminoácidos en comparación con la demanda en la síntesis de proteínas (la señal) determina la expresión de la biosíntesis de aminoácidos operón (respuesta). El foco de nuestro análisis sobre la sensibilidad de operón expresión de un cambio en el suministro de aminoácidos. Nos muestran que la atenuación de la transcripción pueden ser hiper-sensible por dos razones principales. La primera es que su respuesta depende del resultado de una carrera entre dos de varias etapas y con mecanismos sincronizados comienza: transcripción del líder del operón, y la traducción de su reglamentación codones. El cambio relativo en la probabilidad de que la transcripción se aborta (atenuados), por lo tanto, puede ser mucho mayor que el de los cambios relativos en el tiempo que le lleva a los ribosomas para leer un codón de reglamentación. La segunda es que los generales de utilización de las frecuencias de codones del tipo utilizado en el control de atenuación son pequeños. Un pequeño porcentaje disminución en la tasa de suministro controlado de los aminoácidos, por lo tanto, puede llevar a un porcentaje mucho mayor disminución en la tasa de lectura de un codón de reglamentación. Nos muestran que más de alta sensibilidad que requiere un determinado codón de reglamentación de la elección entre varios codones sinónimos para el mismo aminoácido. Nos demuestran la importancia de una alta fracción de los codones de reglamentación en el control de la región. Por último, nuestro modelo integrado explica cómo las diferencias en la secuencia de diseño líder de la trp y su operones de Escherichia coli y Salmonella typhimurium conducir a la expresión basal alta y baja sensibilidad en el primer caso, y al amplio rango dinámico y alta sensibilidad en el segundo. El modelo mecanicista y aclara cómo los aspectos de los sistemas biológicos el mecanismo de atenuación de contribuir a su sensibilidad general. También explica las diferencias estructurales entre el líder de las secuencias de su trp y operones en función de sus distintas funciones.

Introducción

Ribosome mediada atenuación de la transcripción [1] se utiliza comúnmente para el control de la expresión de la biosíntesis de aminoácidos operones en las bacterias [2]. Hay varios otros tipos de mecanismos de atenuación [3], pero "atenuación" en el presente documento se refiere específicamente a su ribosome mediada por la variante. Mediante este mecanismo, el destino de un iniciado ronda de la transcripción depende del resultado de una carrera entre la ARN polimerasa (RNAP), el líder de transcribir el operón regulado, y un ribosoma, la traducción de la transcripción líder. El marco de lectura abierta en el líder contiene dos o más codones de reglamentación afines al aminoácido que se sintetiza por las enzimas codificada por el ARNm de la operón [1]. Si el suministro de los aminoácidos es insuficiente para satisfacer la demanda por parte de la síntesis de proteínas, el ribosoma se ralentizó en estos codones y transcripción continuará en los genes estructurales. Si, por el contrario, la oferta es de aminoácidos en exceso, el ribosoma se moverá rápidamente en el regulador codones, lo que resulta en la formación de una horquilla de ARN que las señales de terminación (atenuación) de la transcripción. Ribosome-transcripcional mediada atenuación se encontraba por primera vez en el operón trp de Escherichia coli [1, 4], y la de su operón de Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella typhimurium) [5, 6]. Atenuación mecanismos Desde entonces se han identificado para el leu, través, ilvGMEDA, ilvBN, y pheA operones de E. Coli y S. typhimurium [2], así como para la biosíntesis de operones en muchos otros organismos [7].

Atenuación de los mecanismos de control-hasta operón expresión regular sólo en respuesta a una reducción de la velocidad de la traducción de los codones de reglamentación, que ha llevado a la idea de que estos mecanismos de control debe reducir la tasa de crecimiento de las bacterias. La razón es que la producción de aminoácidos comenzará a aumentar sólo cuando la tasa de alargamiento péptido y, en consecuencia, la tasa de crecimiento actual ya han caído por debajo de sus máximos valores. Esto es en contraste con los sistemas de represor controlado por aminoácidos piscinas, que puede regular la expresión génica sin reducción de la tasa de alargamiento de proteínas [8]. En su libro [9], Ingraham, Maaløe, y Neidhardt describir esto como una paradoja, y sugieren que la atenuación debe ser muy sensible, de modo que la tasa de síntesis de proteínas debe ser frenado sólo marginalmente para activar la expresión de la atenuación controlada operones . En el presente estudio muestran que, de hecho, la atenuación de la transcripción puede ser verdaderamente sensibles de acuerdo con sus expectativas.

Nuestro punto de partida es un régimen de consenso para la atenuación de la transcripción (figura 1], y modelo matemáticamente cómo la expresión génica responde a la limitación de aminoácidos. Tenemos en cuenta la observación de que la RNAP y los ribosomas iniciar su carrera de más de la transcripción líder en sincronía [10 - 12]. Este calendario, que nos demuestran es esencial para la atenuación de la sensibilidad, no se consideró a principios de los modelos de atenuación [13 - 15] y se presentó por primera vez en un estudio comparativo de represor y de atenuación de control de biosíntesis de aminoácidos operones [8]. Existen dos fuentes principales para la hiper-sensibilidad de atenuación [8]: uno relacionado con el carácter multi-paso de los ribosomas y los movimientos a lo largo de la RNAP operón líder, y el otro a la frecuencia de los aminoácidos en codones de hambre - Los mRNAs de todos los ribosomas de la célula. El primero es un mecanismo de la propiedad en sí, y la segunda es la propiedad del mecanismo en el contexto de un crecimiento de células. Aquí, vamos a aclarar y perfeccionar el modelo mediante la inclusión de la forma en que el cobro selectivo de tRNA isoacceptors [16] afecta a la sensibilidad de la atenuación. También vamos a ampliar el modelo para incluir el codón de uso mixto en la atenuación de control de la región, así como la modulación de la expresión a nivel basal a través de la liberación ribosomal en el codón de parada. Estos aspectos más concretos de la atenuación mecanismo de llegar a ser necesario para explicar la notable diferencia en el diseño de la trp y sus dirigentes en tanto E. Coli y S. Typhimurium.

Un sistema de control de la atenuación operón trp, basadas principalmente en el trabajo experimental por Yanofsky y compañeros de trabajo [2, 17], se muestra en la Figura 1. El líder secuencia contiene, a partir de los 5 'finales, el inicio codón (AUG) de ARNm traducción seguida de la región I, en la que hay m codones de reglamentación para el aminoácido que se sintetiza por las enzimas codificadas por el operón controlada. Región I es seguida de la región II y luego por una fuerte pausa sitio de la RNAP. Más abajo tenemos un número n de bases de ARN, incluyendo líder de las regiones III y IV. Mutuamente excluyentes estructuras horquilla puede estar formado por las regiones II: III o III: IV.

Cuando la RNAP ha llegado al sitio de pausa, se detiene y permanece allí hasta que se inicia un ribosome fusión estructura de la horquilla formada por las regiones Iy II [10 - 12]. Luego vuelve a la RNAP transcripción en sincronía con el movimiento de los ribosomas. Si el ribosoma es lento en la traducción de los codones de reglamentación en el control de la región I, que se mantendrán allí cuando termine la RNAP transcripción de la región IV (Figura 1]. En este caso, el II: III, pero no la III: IV, y la horquilla se forma la RNAP continuará en el marcos de lectura abierta de los genes estructurales. Cuando, por el contrario, los aminoácidos sintéticos actividad de las enzimas codificadas por el operón sustituye a la demanda, los ribosomas se mueven rápidamente en los codones de reglamentación en la región I, que impide la formación de anti-terminator bucle II: III. En este caso, la horquilla III: IV se forma cuando termina la transcripción de la RNAP región IV, que da lugar a la terminación de la transcripción. Si el ribosoma alcanza el codón de parada y la distancia de la líder de ARN antes de la horquilla III: IV, pero se forma después de horquilla II: III puede ser formado, luego de terminación puede ser abortado a pesar de la rápida traducción de los codones de reglamentación. La probabilidad de que este evento determina la expresión basal de la trp atenuador [18].

En las condiciones cuando la iniciación de la síntesis de péptidos líder está apagado, la RNAP eventualmente disocia espontáneamente de su estado y sigue deteniendo transcripción. En este caso, el líder de la transcripción preferentemente las formas I: la II y III: IV terminación de la estructura [17]. Este fenómeno, conocido como super atenuación, no es parte integrante de nuestro modelo, pero una de sus consecuencias será discutido.

Resultados
Modelamiento Matemático de Atenuación de Transcripción

Molecular detalles de la expansión de trabajo experimental que aquí se utiliza para analizar la sensibilidad de los ribosomas que dependen de atenuación de la transcripción en el cultivo de células de E. Coli y S. Typhimurium.

Deje que R (t) es la probabilidad de que el ribosoma en el momento t es en el control de la región con su líder mRNA m reglamentarios codones (Figura 1]. En el momento cero, la RNAP vuelve a la transcripción de su estado pausa por el enfoque de un ribosoma, de modo que RNAP ribosomas y despegar en la sincronía de las posiciones bien definidas sobre el líder. Let f (t) es la densidad de probabilidad para el tiempo t en la que deja la enésima RNAP enésima base, contados a partir de la pausa sitio (Figura 1]. La probabilidad Q, que la iniciación de la transcripción del líder del operón es seguido en sus genes estructurales, es la probabilidad de R (t), que el ribosoma permanece en el control de la región en cualquier momento t, cuando la RNAP pasa de la enésima enésima base Con densidad de probabilidad f (t), es decir,

Para simplificar, asumimos que cada uno de los codones m en la región de control se traduce con el de primer orden constante de velocidad k, que depende de la tasa de suministro de los aminoácidos controlados frente a la demanda ribosomal. Entonces, el movimiento de los ribosomas se define por un proceso de Poisson [19], donde la probabilidad Po (i, kt) de que el ribosoma es en el codón i en el momento t está dado por (kt) i e-kt / i!. En consecuencia, la probabilidad R (t) es

El primer tratamiento de los ribosomas estocástico movimiento durante ARNm traducción fue presentado por von Heijne et al. Hace casi 30 años [20]. Ellos examinaron los posibles efectos de mRNA estructuras secundarias en ribosomal paso veces, y sugirió que la horquilla formaciones podría ralentizar el movimiento de los ribosomas. Mediciones directas de los tiempos de paso en ribosomal E. Coli obstante, reveló que la tasa de codón traducción es sólo marginalmente afectados por la estabilidad de las estructuras secundarias en el marcos de lectura abierta de ARN mensajero [21]. Esto sugiere rápido deshielo de la I: II horquilla en la atenuación líder, la motivación de nuestra suposición de circulación sin trabas ribosoma durante la traducción de esta región.

Para simplificar aún más, también suponer que cada una de las bases n abajo de la pausa sitio se transcribe con la misma tasa de primer orden q constante, de modo que el movimiento de la RNAP es también un proceso de Poisson. Luego, la densidad de probabilidad f (t) para el tiempo t, cuando la base de las hojas RNAP n viene dada por

Este modelo es aparentemente similar a la Manabe [13], pero existe una diferencia importante. En este sentido, han representado para el experimentalmente identificado pausa sitio de la RNAP, que sincroniza los movimientos de RNAP y ribosomas [10 - 12]. La pausa sitio no se conocía cuando Manabe se formuló el modelo, pero es más adelante, en otros modelos de atenuación [14, 15]. Estos, sin embargo, perder el punto, que la RNAP activamente en libertad por el ribosome dependientes de la fusión de la horquilla estructura que define la pausa sitio (Figura 1]. Esta sincronización de la traducción y transcripción [10 - 12] es, de hecho, un requisito estricto de una hiper-sensible atenuación mecanismo [8].

La probabilidad de que continúe la transcripción en los genes estructurales a principios de los ribosomas terminación en el codón de parada en el marco de lectura abierta de la líder de secuencia [18] se describen a continuación, y sus efectos se examinará cuando comparamos la trp y sus mecanismos de atenuador.

Particionado de Hyper-Sensibilidad en un mecanicistas y un sistema de Factor-Dependent

La señal s de atenuación de la transcripción de los operones biosíntesis de aminoácidos es la tasa de aminoácidos suministro normalizado a ribosomal demanda [22]. La respuesta es la probabilidad Q en la ecuación 1, que la iniciación de la transcripción del líder conduce a la expresión de los genes estructurales del operón. El estado de equilibrio de sensibilidad se define como la ganancia o logarítmica, como equivalentes, la sensibilidad de amplificación una Qs [23, 24], es decir, el cambio relativo en Q normalizado a un cambio relativo en s:

La sensibilidad de un Qs puede dividirse en los factores a Qk y un ks. El primero es el cambio relativo en Q causada por un cambio relativo en la tasa k de la traducción de un codón de reglamentación en el marco de lectura abierta de la líder. El segundo es el cambio relativo en k causada por un cambio relativo en la señal s, es decir,

El primer factor de Qk depende de la atenuación mecanismo per se, y el segundo factor de ks es un parámetro de sistema, que se refiere la tasa de lectura de un codón de hambre a la tasa de suministro de sus afines de aminoácidos en una creciente célula bacteriana.

Hyper-Sensibilidad por Competir Multi-Paso Procesos

Para aclarar el origen de hiper-sensibilidad, relativa a un Qk en la ecuación 5, se considera en primer lugar, un mecanismo similar a la atenuación, cuando sólo hay un codón de regulación (m = 1), traducido con constante de velocidad k ', en el marco de lectura abierta MRNA de la líder y un solo tipo de limitación de paso (n = 1) con constante de velocidad q 'para la RNAP. Entonces, Q en la ecuación 1 es dada por la relación hiperbólica [19]

Y un Qk '

Qk uno de los enfoques asintóticamente su mayor valor absoluto, uno, cuando k 'aumenta más allá de límite y Q va a cero.

Luego, considere el caso cuando la RNAP transcribe muchas bases en la secuencia líder (n>> 1), mientras que el ribosoma traduce un único tipo de limitación de reglamentación codón (m = 1). Con q = nq ", la probabilidad es Q

Aquí, una Qk enfoques asintóticamente su mayor valor absoluto, n, cuando k 'Q aumenta indefinidamente y va a cero, como en el caso anterior. En el límite que n → ∞, Q = e-k '/ q' y un Qk '=-k' / q '(consulte el inserto en la figura 2]. En consecuencia, cuando un proceso de un solo paso compite con un proceso de pasos múltiples, la sensibilidad de amplificación pueden ser numéricamente muy grande, a costa de un pequeño Q [25].

En realidad los mecanismos de atenuación, sin embargo, tanto m y n son más grandes que uno, como lo demuestra la E. Coli caso, donde n = m = 50-100 y 2-16 [2]. Cuando m aumenta, la relativa incertidumbre (desviación estándar normalizado en el sentido) de las veces los ribosomas gasta en la región de control disminuye. Asimismo, cuando el tiempo en el que la base de las hojas n RNAP está bien definido, el tiempo durante el cual R (t) es en promedio de la ecuación 1 es corto. En consecuencia, cuando se hace un brusco R transición de cero a uno, el valor absoluto de la sensibilidad de amplificación pueden ser muy elevados, incluso para los Q valores cercanos a uno (Figura 2]. En el caso interesante cuando m, n → ∞, Q es una función de paso con infinita sensibilidad a los cambios en k para todos los valores de la Q en el punto de funcionamiento del mecanismo de control.

Hyper-Sensibilidad en Atenuación debido a la baja frecuencia de Regulación de Codons a granel mRNA

Para entender el origen de hiper-sensibilidad, relativa a un ks en la ecuación 5, uno debe tener en cuenta que el estado de equilibrio de la tasa de j aa abastecimiento de aminoácidos de la biosíntesis de aminoácidos, enzimas debe ser igual a la tasa de estado f [R] V de su consumo [8]. En el caso cuando hay un codón por aminoácido, f es su frecuencia de ocurrencia en la traducción de todos los ribosomas en la célula, [R] es la concentración de ribosomas, y v es la tasa media de la elongación de la proteína por los ribosomas. V La tasa es la inversa de la media hora de traducir los codones en traducir ribosomas, ponderado por el uso de sus frecuencias [16]. Para simplificar, tomamos 1 / k siendo el promedio de tiempo para traducir un codón de reglamentación y 1 / k max que se uniforme la hora de traducir todos los codones de otros [22], lo que da el saldo de flujos de relación [8]

La señal s se encuentra en la ecuación 9 es aa j dividido por la tasa máxima posible, f [R] k máx, de consumo controlado de los aminoácidos cuando se presenta en exceso. En consecuencia, s es igual a cero cuando el suministro de aminoácidos está apagado, y s es una saturación en la oferta. La sensibilidad parámetro un 5 ks en la ecuación sigue diferenciando el k en la ecuación 9 con respecto a s y multiplicando la derivada de s / k:

Porque es pequeño f [0.001-0.1], un ks contribuye con un factor en el intervalo 10-1000 a la sensibilidad de amplificación en un Qs Ecuación 5 para los valores de la señal s cerca y por debajo de uno. Este resultado puede explicarse de la siguiente manera. Cuando es un aminoácido limitante de la tasa de síntesis de proteínas, la tasa total de péptido elongación en la célula está determinada por su tasa de abastecimiento [8, 22]. S Cuando se aproxime a uno y el uso de la frecuencia f de la reglamentación codón es pequeño, una reducción de la tasa total de la síntesis de proteínas corresponde a la disminución de la rapidez de la traducción de sólo una pequeña fracción de la actualidad traducido codones. Por lo tanto, una disminución relativa en un valor s cerca de uno conduce a un 1 / f veces mayor reducción relativa de la tasa de lectura del codón de hambre. Cuando disminuye s, una creciente fracción de los ribosomas en la célula se programarán con el codón de hambre, de modo que el valor actual f aumentos de un pequeño valor hacia uno, momento en el cual el efecto desaparece (Figura 3].

El cobro selectivo de tRNA Isoacceptors y de la sensibilidad de Atenuación de Transcripción

Hasta el momento, hemos descuidado que el código genético es redundante [26], en la que suele haber varios codones afines a un aminoácido que se traducen por varios isoaccepting tRNAs [27]. Existe una fuerte tendencia entre los codones en la atenuación dirigentes [2], y se sugirió que los principios de este sesgo ha evolucionado para maximizar la sensibilidad de los mecanismos de atenuación de la elección de los codones raros en la atenuación de los dirigentes, con el operón leu como el ejemplo paradigmático [2]. Esta explicación, sin embargo, debe ser una simplificación excesiva, ya que el sesgo de atenuación en otros favorece a los principales dirigentes (por ejemplo, al igual que con el operón través CAC con ocho codones) codones o intermedio [16].

El misterio de la utilización sesgada de los codones de reglamentación en la atenuación líderes en E. Coli fue recientemente resuelto por la teoría de la imputación del selectivo isoaccepting tRNAs aminoácidos durante la hambruna [16]. Esta teoría, alimentada con datos experimentales sobre el total de las concentraciones de tRNA y el codón de uso en la traducción de ribosomas [28, 29], se utilizó para identificar a los reguladores en los codones atenuación líderes en E. Coli para los que la tasa de traducción es más sensible a la variación en la tasa de suministro de sus afines aminoácidos. En cada caso, el sesgo codón observados experimentalmente [2] favorece la reglamentación codón para que la tasa de traducción es más sensible a los aminoácidos de limitación [16].

Desde entonces, el selectivo de carga en Thr, Leu, y Arg tRNA isoacceptor familias ha sido verificada experimentalmente [30] que resultaron ser cualitativamente de acuerdo con la teoría [16]. La teoría ha predicho con éxito-por la forma en que pasa ribosomal [31] responde a la inhibición de la seryl-tRNA sintetasa, cuando el ribosomal Un sitio tiene un codón leído tanto por un Ser3 o un Ser5 isoacceptor [32].

La teoría de la tarificación selectiva supone que la tasa por el cual un acusado tRNA isoacceptor es deacylated es proporcional a la frecuencia por la que sus afines se producen en la traducción de los codones ribosomas, y que la tasa de aminoacilación de un isoacceptor es proporcional a la concentración de su Deacylated forma. De esto se desprende que un total de isoacceptor con alta concentración y baja codón uso seguirá siendo acusado de aminoácidos, mientras que un isoacceptor de la misma familia isoacceptor con baja y alta concentración total codón uso perderá la carga cuando el suministro de aminoácidos se convierte en su común para limitar La síntesis de proteínas [16].

Para ejemplificar, considere la posibilidad de un simple caso de dos diferentes isoacceptors (A y B), donde dice sólo un codón B dice a y b solo codón. Codón se produce una atenuación en el líder del ARNm que codifica las enzimas que sintetizan los aminoácidos afines a A y B. Cuando codones a y b ocurren en la traducción de los ribosomas con la misma frecuencia, la aminoacylated formas de isoacceptors AyB son consumidos por la misma tasa en la síntesis de proteínas. En el estado de equilibrio, esto también significa que las formas de deacylated A y B debe ser acusado de aminoácidos idéntica a los tipos. De esto se desprende además, que cuando el total de las concentraciones de A y B en la celda son diferentes, la concentración de sus formas aminoacylated pueden diferir enormemente cuando sus afines de aminoácidos es la tasa de limitación de la síntesis de proteínas. Esto se ilustra en la figura 4 A, que muestra las concentraciones de los aminoacylated formas de AyB cuando la concentración total de A es constante y la concentración total de B es variado, a un valor s (Ecuación 4] [22] de 0,95 con La igualdad de codón de uso de frecuencias de 2,5% a y b. Cuando la concentración total de B aumentos de los pequeños valores, la concentración de los acusados B aumenta, mientras que la concentración de los acusados una baja (Figura 4 A). Por lo tanto, en virtud de la limitación de aminoácidos, el acusado nivel de isoacceptor Un depende en gran medida de la concentración total de isoacceptor B, y esta dependencia se refleja también en la sensibilidad de la atenuación con un mecanismo de regulación como codones (insertar en la figura 4 A). Cuando la concentración total de B es pequeño, la sensibilidad de la atenuación es muy pequeño, pero aumenta bruscamente hacia su asíntota B con el aumento de la concentración. En la asíntota, B isoacceptors son completamente cargada, y b codones se leen con máxima tasa. En este límite, la sensibilidad se deduce de la ecuación 1, con el codón de frecuencia f definida por el uso de codones, es decir, el 2,5%, en este caso (Figura 4 B).

En los escenarios más realistas, varias isoacceptors puede leer el mismo codón, que conduce a la más compleja cinética [16], pero los mismos principios se aplican.

La Fracción de Codons de regulación en la Región de Control

En realidad los sistemas de atenuación, normalmente existe una mezcla de los reguladores y de otros codones en el control de la región, que se define como la región líder del mRNA de la posición en la que se libera la RNAP hasta el último codón donde ribosome estancamiento promueve anti-terminator conformación. La sensibilidad de los mecanismos de atenuación depende de la fracción de los codones de reglamentación en el control de la región. Para ver esto, tenemos en cuenta que las normas y otros codones se traducen con diferentes tarifas por uso de la ecuación maestra [33]

R (i, t) es la probabilidad de que el ribosoma es en el codón i en el momento t. La enumeración se define tal que la RNAP se libera cuando el codón i = 0 se trasladaron a la sede de la A ribosomas. Codón m 1 es la primera, y m 2 es el último codón donde ribosome estancamiento causas contra el codón de terminación y M es el codón de parada. K i es la tasa por la que se lee el codón i, y k es la tasa Disertación en la que el Ribosome desvincula del codón de parada (véase la sección siguiente). La probabilidad de que el ribosoma es en la parte de control de la región que promueva la lucha contra la conformación de terminación en el tiempo t es

Ecuación 12 generaliza la ecuación 2 para R (t), y debe utilizarse en la ecuación 1 cuando hay una mezcla de diferentes codones en la región de control o cuando ribosome estancamiento en sólo una parte de la región pueden promover el control anti-terminator conformación. Cuando todos los k i = k y m 1 = 0, m = m 2 - 1, entonces la ecuación 12 se reduce a la ecuación 2.

Si la fracción de los codones de reglamentación en la región el control es pequeña, la sensibilidad del mecanismo será comparativamente pequeña, por ejemplo, si m 'de los codones son m reglamentarios, la sensibilidad será más pequeño que un mecanismo con m' regulador de los codones De m 'codones en el control de la región. Figura 5 muestra cómo la sensibilidad del mecanismo de cambios cuando la fracción de los codones de regulación disminuye de 10 de los 10, (# 10 y # 10) a # 1 de # 10 (# 1 / # 10), mientras que la tasa de transcripción y el número de pasos RNAP son constantes. La traducción de la tasa no reglamentarias codones se toma 15s 15s -1. Cuando la traducción de las tasas regulatorias y no regulatorias codones son iguales en un control de la región con m codones, la sensibilidad es proporcional a la fracción del regulador codones multiplicado por la sensibilidad que se refiere cuando todos los codones son m reglamentarios. Esto se ilustra en la Figura 5 a la derecha-el punto de la mayoría de los eje "x", donde reglamentario, así como la no reglamentación codones tienen una tasa de traducción 15s 15s -1. Cuando la traducción de las tasas regulatorias y no regulatorias codones diferentes, o cuando hay diferentes codones en el control de la región, la comparación de diferentes casos con respecto a la sensibilidad requiere escalamiento de la tasa de paso q transcripcional. El objetivo de la ampliación es para igualar el Q-valores en los diferentes casos de la tasa especial (k) de la traducción de reglamentación codón-en la que se calcula la sensibilidad. Con esta normalización, que se considera que la sensibilidad es mayor cuando hay cinco reglamentarios y ningún otro codones, que cuando hay cinco reglamentarios y cinco no reglamentarias codones en el control de la región. Como la tasa de regulación de la traducción de los codones disminuye, el valor absoluto de la sensibilidad de amplificación en el codón mixtos caso aumenta la sensibilidad hasta converger (insertar en la Figura 5].

La Probabilidad de Lucha contra el Terminator Ribosome después de la etapa de conformación de la Stop Codon

Si el ribosoma alcanza el codón de parada y la distancia de la líder de ARN antes de la horquilla III: IV, pero se forma después de horquilla II: III puede ser formado, luego de terminación puede ser abortado a pesar de la rápida traducción de los codones de reglamentación. Q 2 La probabilidad de este evento es pequeña para los grandes, pero su atenuador de la trp atenuador, en el que se fija un nivel basal de expresión [18]. Deja que yo sea el momento integrante de la probabilidad de que la RNAP se encuentra en una región entre bases n 1 yn 2 en el momento t, cuando el ribosoma es en el codón de M con probabilidad r (M, t), de la que se desvincula con la De primer orden constante de velocidad k Disertación:

Bases n 1 y n 2 definir la región en la que la II: III horquilla (Figura 6 A) puede ser formado después de la disociación de los ribosomas del codón de parada. En consecuencia, n 1 es la última base en la región que pueden III par con la región II y n 2 como la base en medio de la región IV. Esto se debe a que la formación de horquilla II: III exige que la región está disponible III y IV región que ha No fueron completamente transcritas. Se ha supuesto que, cuando se reúnen estas condiciones, ya sea formación de horquilla I: II o horquilla II: III en el operón trp líder se producirán con un 50% de probabilidades, ya que su stabilities son similares [18]. Haremos uso de la misma para el supuesto de su atenuador. En consecuencia, la probabilidad Q 2 es igual a I / 2, y la probabilidad total Q tot que la polimerasa continuará en el genes estructurales de la operón está dado por Q + Q 2, donde Q se define en la ecuación 1.

El Partido Radical Transnacional y su Atenuadores

El atenuador mecanismos de la operón trp de E. Coli y la de su operón de S. typhimurium se han estudiado de forma exhaustiva (véase [2, 34] y las referencias en él).

El operón trp está bajo control transcripcional doble por un represor Trp-sensible [35] y un atenuador [36]. Durante un crecimiento equilibrado, el operón es represor controlado con un rango dinámico de alrededor de 70 [37]. Durante graves Trp hambre, la atenuación está desactivada, lo que resulta en más de 10 veces más en operón expresión [37, 38]. El doble control de la operón trp requiere un alto basal de la lectura a través de atenuador en el exceso de oferta de Trp. Esto se logra a un nivel de 10% -15%, debido principalmente a la terminación de la traducción y la liberación de los ribosomas codón de parada, antes región IV se dispone para formar la estructura con terminator región III ([18]; Figura 6]. Nuestro modelo predice un nivel basal de expresión alrededor del 8% (Figura 6], cuando los datos trp atenuador (leyenda en la figura 6] se insertan en Ecuaciones 1, 12, y 13. Sin embargo, ha sido sugerido que el nivel basal contiene también una contribución de un elemento intrínseco de lectura a través, no incluidos en nuestro modelo, de alrededor del 3%, según la estimación de atenuación de las condiciones bajo las superpotencias [18]. Tomando esta nueva lectura a través en cuenta hace que nuestro modelo de predicción (8 + 3 = 11%) incluso una mejor estimación de la estimación experimental (10% -15%).

El operón en su S. Typhimurium, en cambio, es sólo la atenuación controlada y el nivel de expresión basal en el exceso de oferta de Su que se supone que es más pequeño que el nivel basal de expresión de la trp atenuador [34]. Nuestro modelo sugiere inmediatamente dos diferentes estrategias para la aplicación de la baja basal lectura a través de los mecanismos de atenuación. Su característica común es que la decisión de formar el terminador transcripcional horquilla se produce mucho antes de la terminación de la traducción y la liberación de los ribosomas región II (véase la figura 1]. Esto puede lograrse ya sea colocando el codón de lejos abajo en la región II, a fin de que la terminación de la traducción se retrasa en relación a la formación de transcripcional Terminator III: IV, o el mismo efecto se puede lograr por la rápida formación de una estructura secundaria que Previene contra la conformación de terminación a menos que el ribosoma es en el control de la región. Esta última opción parece ser el principio de diseño de su operón. Aquí, un extra horquilla ha evolucionado RNAP pausa entre la horquilla y el terminador transcripcional (Figura 6 A). Esta horquilla formas extra rápidamente cuando la transcripción RNAP reanude tras la pausa, y el modelo sugiere que se trata de impedir la lectura a través de la traducción de su atenuador de la terminación y liberación ribosomas. Cuando, por el contrario, la horquilla adicionales se elimina de la estructura del modelo, el nivel basal de la lectura a través de saturar Su oferta aumenta de manera espectacular (Figura 6 C). A partir de esto, sugerimos que la horquilla extra sirve para reducir al mínimo basal lectura a través de la su atenuador para reducir el coste metabólico de Su Su síntesis cuando se suministra el exterior. El operón trp expresión, en cambio, se apaga por el represor Trp Trp cuando hay en el medio, y la adecuada acción de la doble sistema de control de la operón trp requiere un alto basal de la lectura a través del atenuador.

Nuestros modelos experimentales cuenta de las observaciones relativas a la trp (Figura 6 B) y la de su operón (Figura 6 C). Es, por ejemplo, claramente visto que el trp atenuador (Figura 6 B) requiere un planteamiento mucho más grave de aminoácidos limitación para el pleno de la represión-y tiene una gran parte basal un mayor nivel de lectura a través de la su atenuador (Figura 6 C) . We have also estimated the sensitivity ( a Qs ; see Equation 4 ) of gene expression to variation in the amino acid supply signal s for each one of these attenuators ( Figure 6 D). The his attenuator is much more sensitive due to the higher number and higher fraction of his codons in that control region.

Discusión

We have described two major sources of hyper-sensitivity of ribosome-dependent attenuation of transcription.

The first relates to the odds for selecting the winner of two competing multi-step (Poisson) processes with synchronized starts. One competitor is the RNAP, transcribing the leader of the operon, and the other is the ribosome, translating regulatory codons in that leader. Synchronous starts for transcription and translation in the attenuator are essential for hyper-sensitivity, and synchrony is achieved by the ribosome-dependent melting of the hairpin structure that makes the RNAP pause in the attenuator (see Figure 1 ). When the number of regulatory codons to be translated as well as the number of bases to be transcribed in the attenuator are large, hyper-sensitivity in the rate of gene expression to variation in the rate of amino acid synthesis emerges and can be combined with a high probability that initiation of transcription of the leader continues into the structural genes of the operon (see Figure 2 ). The importance of a large number of regulatory codons for sensitivity has been verified experimentally [ 39 ]. When, in contrast, there is competition between two single-step processes, the control is hyperbolic and lacks hyper-sensitivity [ 19 ]. Although competition between a single- and a multi-step process (exponential control) can lead to hyper-sensitivity, it is only at the cost of a very low probability for an initiation event to result in gene expression (see Figure 2 ; [ 19 ]).

The second source of hyper-sensitivity relates to the frequency (f) of occurrence of regulatory codons in the mRNAs of all translating ribosomes of the cell, just at the onset of amino acid starvation. A fractional decrease of amino acid synthesis is amplified by a factor of 1/f in the resulting fractional increase in the time to translate regulatory codons (see Figure 3 ). This effect is a direct consequence of the stoichiometric coupling that exists between the rates of deacylation in protein synthesis of all the cell's tRNAs [ 16 , 22 ]. When amino acid limitation becomes increasingly severe, an ever-larger fraction of all ribosomes will expose the starved regulatory codons in their A site, until f becomes one and this sensitivity amplification effect vanishes.

When the regulatory codons in an attenuator are read by a tRNA that belongs to a family of isoaccepting tRNAs, cognate to the same amino acid, then hyper-sensitivity requires that the concentration of the aminoacylated form of the regulatory codon reader is sensitive to amino acid deprivation [ 16 ]. In short, the condition is that the concentrations of other members of the isoacceptor family are large in relation to the usage of their codons on all translating ribosomes, as compared to the concentration of the regulatory codon-reading tRNA in relation to the general usage of those codons in translation. When this condition is met, the charged level of the regulatory codon reader is maximally sensitive to amino acid limitation, while the charged levels of the other isoacceptors are insensitive and remain high ([ 16 ]; see Figure 4 ). In this case, the frequency f ( Equation 4 ) refers to how often the regulatory and not all synonymous codons occur on translating ribosomes, which enhances the sensitivity at the onset of starvation. This is in line with results from experiments by Carter et al. [ 40 ], in which the three CUA codons, normally used in the S. typhimurium leu attenuator, were replaced by CUG codons. This led to reduced sensitivity, with total de-repression of the operon occurring only at severe Leu starvation. Our theory suggests that, for E. coli, CUA is the most suitable leu attenuator control codon, and that CUG is a less optimal but still a reasonable alternative [ 16 ]. On the assumption that the charged levels of Leu isoacceptors in E. coli and S. typhimurium react similarly to Leu limitation, our theory also predicts that if the CUA codons had been replaced by UUG or UUA codons, then the attenuator would have become even less sensitive to Leu limitation and the operon would not have been de- repressed even under severe Leu starvation.

Our modeling of the his and trp attenuators from S. typhimurium and E. coli, respectively, has reproduced available experimental data on these control circuits with respect to, in particular, regulatory range and basal expression levels. Furthermore, our simulations suggest that attenuation is close to fully relieved when the rate of Trp supply is about 70% of ribosomal demand, ie, when s = 0.7 ( Figure 6 D). An s value of 0.7 roughly corresponds to a 30% reduction in growth rate due to Trp starvation [ 8 , 16 , 22 ], and our result can therefore be compared to experimental data from Yanofsky and Horn [ 38 ]. These show a 4-fold, out of a maximally 6-fold, relief of attenuation of the trp operon when the growth rate is reduced by 20% ( s = 0.8) due to Trp limitation. These experimental data [ 38 ] are, therefore, in good agreement with our predictions ( Figure 6 D). For s values like these that are significantly less than one, the Trp as well as the Trp-tRNA Trp levels are expected to be very low compared to their values at adequate supply of Trp [ 8 , 16 , 22 ].

Our analysis has also led to a novel suggestion regarding the role of the extra hair pin structure that exists in the his -attenuator of S. typhimurium. Our model predicts that removal of this hair pin results in a much higher basal level expression from the operon , which suggests that the hair pin serves to lower the probability of anti-terminator formation caused by translation termination and ribosome release from the attenuator. Accordingly, the presence of the extra hair pin leads to an increase of the regulatory range of the his -attenuator and reduces the metabolic cost associated with redundant His-synthesis when there is His in the medium.

Our analysis has, finally, resolved the “Ingraham-Maaløe-Neidhardt paradox” which states that the controlling ability of attenuation mechanisms necessarily leads to reduced growth rate [ 9 ], by showing that attenuators can indeed be hyper-sensitive regulators of amino acid synthesis . We also suggest that further improvement of attenuator performance comes from burst-like expression from attenuator-controlled amino acid biosynthetic operons, so that total protein elongation in the cell is marginally limited by amino acid supply only a small fraction of the time. This hypothesis is now addressed experimentally (J. Elf, in preparation).

Supporting Information

This work was supported by the Swedish Research Council.