PLoS Genetics, 2005; 1(1): (más artículos en esta revista)

Cell-cerebelar Autónoma muerte de las neuronas de Purkinje con la autofagia de Niemann-Pick tipo C, la enfermedad

Biblioteca Pública de la Ciencia
Dennis C Ko, Ljiljana Milenkovic, Steven M Beier, Manuel Hermogenes, JoAnn Buchanan, Mateo P Scott [*]
Resumen

Niemann-Pick tipo C es una enfermedad neurodegenerativa de almacenamiento lisosomal causada por mutaciones en uno de dos genes, npc1 y npc2. Las células que carecen de Npc1, que es una proteína transmembrana relacionados con el receptor Hedgehog actualizados, o Npc2, que es secretada colesterol-proteína de unión, han aberrante tráfico de orgánulos y se acumulan grandes cantidades de colesterol y otros lípidos. Aunque el Npc proteínas son producidas por todas las células de Purkinje del cerebelo neuronas son especialmente sensibles a la pérdida de la función Npc. Desde Niemann-Pick tipo C, la enfermedad implica que circulan moléculas como esteroles y esteroides y una robusta respuesta inflamatoria en el parénquima cerebral, es fundamental para determinar si los factores externos que afectan a la supervivencia de las células de Purkinje (PC). Hemos investigado la base de la neurodegeneración en ratones quiméricos que han funcional npc1 en sólo algunas células. La muerte de las células mutantes npc1 no fue impedido por los vecinos de tipo salvaje células, y de tipo salvaje PCs no eran envenenados por rodean npc1 células mutantes. PC sometidos a la degeneración de células autónomas-tienen características compatibles con autophagic muerte de la célula. Quimérico ratones mostraron una notable demora y la reducción de la ataxia y la emaciación a pesar de su gran cantidad de mutantes de tejidos y las células mueren, que revela un sólido mecanismo que compensa en parte por la muerte masiva de PC.

Introducción

Niemann-Pick tipo C (NPC) es una devastadora enfermedad neurodegenerativa autosómica recesiva caracterizada por la acumulación de colesterol y otros lípidos en las vísceras y el sistema nervioso central. La presentación clínica generalmente incluye ataxia progresiva, distonía, demencia y, en primer lugar la presentación en la primera infancia y, en última instancia condujo a la muerte en el comienzo de la adolescencia [1]. NPC es una de más de 40 conocidos trastornos lisosomales de almacenamiento (revisado en [2, 3]], que en conjunto tienen una incidencia de uno de cada 8000 nacidos vivos [4]. Las moléculas específicas que se acumulan en cada enfermedad varían, pero la mayoría de los trastornos comparten la característica prominente de los síntomas neurológicos. Aunque se han logrado grandes avances en la caracterización de los defectos bioquímicos y genéticos en estas enfermedades, de las vías que conducen de estos defectos a la disfunción de células y tejidos están mal comprendida.

La disminución de la función neurológica en los pacientes NPC es causada por mutaciones en cualquiera de los npc1 o npc2 gen [5 - 7]. Npc1 es un múltiplo de la membrana de la tarde que abarca endosomal / lisosomales proteína que puede unirse colesterol [8], y actúa como una bomba cuando transmembrana expresada en bacterias [9]. El Npc1 tiene una secuencia de las proteínas relacionadas con la "esterol de detección de dominio" de conocidos reguladores de metabolismo del colesterol (SCAP y de la HMG-CoA reductasa) y actualizados, un receptor para la proteína secretada desarrollo de señalización Hedgehog. La función exacta de Npc1 en la regulación de la homeostasis de los lípidos y en el mantenimiento de la función neurológica está lejos de ser clara. Menos aún se sabe de Npc2, el pequeño de colesterol-proteína de unión [10 - 12] responsable de una minoría (<5%) casos de NPC.

Fenotipos similares a los humanos NPC son vistos en dos cepas de ratón, C57BLKS / J spm [13] y BALB / c npc1 nih [14], los cuales albergan mutaciones espontáneas en npc1 [6]. El más sorprendente y bien documentado cambios histológicos en npc1 ratones es la pérdida progresiva de las células de Purkinje del cerebelo (PC) [15, 16]. Estereotáxica conteo de células confirmó que el PC es el tipo que exhibe el mayor porcentaje de pérdida en npc1 ratones (<10% restante a las 10 semanas), pero sorprendentemente reveló que neuroglia en el cuerpo calloso temprana tienen una mayor reducción en el número (48% de neuroglia Versus el 13% de los PC, a las 3 semanas) [17]. Este primer descenso de la neuroglia y de la detección de la proteína Npc1 en astrocytic procesos [18] llevó a la idea de que la función primaria de la proteína puede ser Npc1 neuroglia y en el que la pérdida de neuronas PC y otros puede ser una consecuencia secundaria de la disfunción glial [ 17, 19]. Sin embargo, Npc1 ARNm es suficientemente presente en las neuronas, así como neuroglia en todo el cerebro [20]. Por lo tanto, no está claro que las células del cerebro requieren Npc1 proteína y por qué los PC degenerar en ratones que carecen de Npc1.

Cuatro grandes categorías de las posibles explicaciones para la PC degeneración han surgido (Figura 1]. (1) Npc1 se requiere dentro de los PCs y la pérdida de la proteína resulta en la degeneración como consecuencia de la acumulación de lípidos tóxicos. Las altas concentraciones de colesterol unesterified puede causar la muerte celular por alteración de la membrana rigidez, la formación de cristales intracelulares que pueden interferir con la función de orgánulos, o eventos de señalización desencadenar apoptosis [21]. (2) Npc1 se requiere dentro de los PCs y la pérdida de la proteína causa una deficiencia en lugares específicos subcelulares. En este modelo, la acumulación de colesterol y otros lípidos no es perjudicial en sí misma, sino la disminución de la capacidad de transporte o de estas otras moléculas a los lugares correctos dentro de la célula lleva a la degeneración. (3) Se requiere Npc1 neuroglia o dentro de otro tipo de células en el cerebelo, o en un órgano distante, como una glándula secretora, y la pérdida de la proteína resulta en la degeneración de los PC a través de una deficiencia en una molécula secretada. Este podría ser un factor trófico o incluso de colesterol en sí, ya que los estudios han demostrado que la neuroglia derivados de colesterol es necesario para la sinaptogenesis [22]. (4) Pérdida de la función Npc1 resultados en la liberación de tóxicos / pro-inflamatorios en el entorno local o de la circulación sistémica, provocando la degeneración de PC.

En este estudio, se emplearon ratones quiméricos que ayude a resolver el misterio fundamental de por qué las neuronas degeneran en la enfermedad de NPC. Este poderoso enfoque puede distinguir intrínseca y extrínseca causas de la muerte de las células, pero muy pocas ocasiones ha sido utilizado para el estudio de las enfermedades neurodegenerativas humanas [23, 24]. Los resultados indican que la pérdida en PC npc1 - / - mutantes de células-es un proceso autónomo, es decir, Npc1 función es fundamental dentro de los PC. Análisis bioquímicos y ultraestructurales de apoyo a la idea de que esta pérdida de células autónomas-se debe a la activación de un programa genético, la autofagia, que conduce a la muerte celular.

Resultados
Plan de cerebeloso Degeneración en npc1 Ratones

Como primer paso es importante para observar y medir la pérdida progresiva de PC. PC pérdida en el vermis cerebeloso progresado en un anterior (lóbulo I) a la posterior (lóbulo X), de barrido, como en el informe anterior [15, 16] (Figura 2 Ay 2 B). Hubo un número normal y la densidad de PCs en cerebelosa secciones a partir del 30-d de edad npc1 - / - ratones. A 50 d, en la mayoría de los PC lóbulos I-III ya no se presente. Por 70 d, sólo lóbulo X PC se mantuvo intacta.

Hemos investigado si Bergmann próximo neuroglia se ven afectados en npc1 - / - ratones. Bergmann neuroglia appose la PC soma y ampliar los procesos en la capa molecular que vainas de los árboles PC dendríticas (revisado en [25]]. La pérdida o disfunción de estos neuroglia y precipitado podría preceder a la pérdida de PC. En contraste con la degeneración y pérdida de la PC, Bergmann neuroglia teñidas con anti-S100 β mantener su densidad y su característica morfología radial, incluso a 70 d, en todos los lóbulos (Figura 2 C). Oligodendrocitos, la neuroglia que myelinate axones, fueron normales en la distribución de células y la morfología del cuerpo (Figura 2 D). Tinción de la mielina reveló axonal esferoides como se informó anteriormente (Figura 2 S) [15, 26]. Gránulo células, las más abundantes neuronas en el cerebelo, también se basa en una burda normales anti-GABA α6 tinción (datos no presentados). Esto indica que la pérdida de PCs en npc1 ratones no se debe secundariamente a la pérdida u otras Daño Articular morfológicas evidentes de estos otros tipos de células. Sin embargo, estas observaciones no descartan la posibilidad de que un más sutil disfunción en estas células contribuye a la degeneración de los PC en npc1mice npc1mice.

El anterior-a-posterior gradiente de pérdida PC ofrece la oportunidad de determinar cómo los cambios en la acumulación de colesterol en relación con los PCs. Si la acumulación intracelular de colesterol es tóxico para los PC, se espera una correlación entre la cantidad de colesterol y de la tasa o la gravedad de la degeneración. En lugar de ello, nos encontramos con que al 30 d, la acumulación intracelular de colesterol se observa incluso en el lóbulo X PC (que no degeneren npc1 normal durante la vida útil del ratón). No encontramos ninguna diferencia consistente en filipin tinción de colesterol entre los diferentes lóbulos cerebelosa npc1 en ratones (Figura 2 F). Por lo tanto, lisosomales acumulación de colesterol per se no es suficiente para explicar el modelo de la PC de muerte.

PC Degeneración en npc1 ¿Ratones Autónoma Cell -

PC para determinar si la pérdida se debe a la disfunción dentro de los PCs, alteraciones en el entorno neuroglia y microambiente, o una combinación de ambos, generado ratones que contengan una mezcla de npc1 mutante y de tipo salvaje células. Morulas derivados de apareamiento npc1 heterocigotos (BALB / c npc nih / +) y proveniente de la cruza de los ratones de tipo salvaje homocigotos para una doquier expresó proteína verde fluorescente (GFP) gene (FVB.Cg-Tg (GFPU) 5Nagy / J; [27 ]) Fueron agregados para formar embriones quiméricos. Una cuarta parte de los embriones de npc1 / + padres deben npc1 homocigotos para la mutación, pero estos embriones no pueden ser distinguidos en el momento de morula aislamiento, por lo que los embriones resultantes de la agregación tuvo que ser analizadas para determinar más tarde que son las quimeras útil . También se crearon quimeras en el que las células mutantes npc1 fueron marcados con las buenas prácticas agrarias (75% antecedentes genéticos FVB/25% BALB / c; ver Materiales y Métodos de cruces), asegurando que los resultados fueron independientes de los antecedentes genéticos. De 33 ratones quiméricos generados, siete son del genotipo deseado, según lo determinado mediante el análisis de PCR (dos npc1 - / - BALB / c ↔ GFP, dos npc1 - / - 75% FVB/25% BALB / c ↔ CD-1, tres Npcl - / - 75% FVB/25% BALB / c ↔ C57BL6 / J) (Figura 3 A). Estos siete ratones de tipo salvaje había contribuciones que van de 11% a 61% sobre la base de piel de fluorescencia, de células granulares, y lóbulo X PC que cuenta. De tipo salvaje contribuciones estimadas a partir de la piel de fluorescencia así siempre correspondió al valor determinado de células, los números difieren en un 4% -22% (ver Tabla 1]. La fiabilidad de la piel y de fluorescencia de células granulares como estimaciones de la cantidad total de quimerismo porcentaje fue validado por más de dos npc1 examen heterocigotos quimeras que demostró quimerismo porcentaje similar si determinada por la piel, de células granulares, o, lo que es más importante, cuenta con PC (cuadro 1] . Para cada quimérico ratón, todas las PCs en cinco secciones sagital de la vermis cerebeloso fueron contados y cada célula del genotipo se determinó sobre la base de buenas prácticas agrarias de fluorescencia. Características de los ratones se resumen en la Tabla 1.

Los datos de los siete ratones demostró que en la degeneración PC npc1 - / - ratones es ante todo un proceso autónomo de la célula. PC reveló que cuenta con la presencia de un medio que es más de un 60% de tipo salvaje fue insuficiente para evitar la pérdida npc1 PC. En los dos más antiguos ratones analizados (190 días), quimeras 4,4 y 4,8 (C4.4 y C4.8), casi todos los PCs npc1 había degenerado, incluidos los de lóbulo X. En estos ratones, la naturaleza de tipo contribuciones se estima que Ser el 54% y el 61%. Mutant npc1 PC se observaron en densidades de 0,5 y 0,6 PC / mm en los ratones, notablemente menor que lo esperado a densidades de 12 y 10 PCs / mm en caso de que no se había producido la degeneración (Figura 3 B). PC densidades previstos, en el supuesto de no degeneración, se calcula multiplicando la densidad observada en 30 d npc1 - / - ratones por el porcentaje de quimerismo. Se hicieron mediciones similares en las siete quimeras. Dos ratones sacrificados a una edad más temprana (120 d; C2.1 y C5.8) han perdido casi todos los npc1 PC, que fueron principalmente en lóbulo X. Los resultados demuestran que en torno a las células de tipo salvaje son incapaces de impedir npc1 PC Degeneración. Estos cuatro ratones también demuestran que las PC lóbulo X eventualmente degenerar; se retrasa su pérdida en lugar de evitarse por completo.

Tres ratones quiméricos se analizaron a 70 d, al final de la vida útil normal de npc1 - / - ratones. Uno de esos tres ratones tenían una sustancial contribución de tipo salvaje (33%; C1.4), pero no importante la prevención o el retraso de la degeneración npc1 PC se observó (Figura 3 C). La gran mayoría de los PC mutante (excepto los de lóbulo X), degeneró a pesar de la presencia de una importante fracción de las células de tipo salvaje (Figura 3 Dy 3 E).

En contraste con el mutante PC, PC de tipo salvaje no degenerar en la mayoría de los ratones quiméricos. La observó de tipo salvaje PC densidades de acuerdo con la densidad de espera basada en la naturaleza de la contribución de cada tipo de ratón (Figuras 3 y F 3 G). La solitaria excepción se produjo en los dos ratones con el 11% y el 13% de tipo salvaje contribución. Estos ratones se espera que tengan un muy bajo número de ordenadores personales de tipo salvaje, pero hay incluso menos de lo esperado. No silvestres disminución significativa en la densidad de tipo PC se observó en los otros cinco ratones quiméricos, incluyendo C2.1, que se espera que tengan sólo un poco mayor contribución de tipo salvaje (15%). Aunque la fluctuación en la forma en que un pequeño número de células de tipo salvaje se distribuyen y la consiguiente variabilidad de las secciones analizadas proporcionar una explicación probable, otra interpretación es que, cuando muy pocos de tipo salvaje células están presentes, todo el cerebelo comienza a romper durante las últimas etapas de Degeneración cerebelosa. Toxinas liberadas por las células que mueren podría contribuir a la pérdida de la PC, pero claramente no son la causa principal de la neurodegeneración.

Otras características histológicas de los ratones quiméricos npc1

Examen de las relaciones de otros tipos de células de los PCs en las quimeras una prueba más para la célula de carácter autónomo de PC degeneración. Microglia se han observado en el cerebelo de npc1 - / - ratones, pero su papel en la degeneración de PC no está claro [28]. Microglia son las células fagocíticas del sistema nervioso central, y su presencia es indicativa de un proceso inflamatorio. La aparición de microglia en el cerebelo sigue el patrón anterior-posterior muerte de la PC. En los ratones de tipo salvaje o npc1 ratones mutantes al 30 d, casi no se observan microglia (datos no presentados). En el 50-d de edad npc1 ratones mutantes, muy pocos microglia están presentes en lóbulo X (Figura 4 A). El otro cerebelosa lóbulos tienen numerosos microglia en la sustancia blanca del tracto capa de células granulares y antes de la pérdida de la PC (Figura 4 B). Después de la pérdida más extensa de PC (lóbulos I-IV d en el 50 y I-IX a 70 d), microglia también aparecen en el PC y capas moleculares (Figura 4 C). Así, la llegada de microglia coincide con la pérdida de PC. Sin embargo, la infiltración de numerosos microglia no es suficiente para desencadenar la degeneración PC. Microglia estaban presentes en todos los ratones quiméricos (aunque en menor medida, en los ratones se sacrificaron a una edad más avanzada) y se encontraban muy próximos a los PC de tipo salvaje (Figura 4 D, flechas blancas). A pesar de esta estrecha colaboración, no hay disminución de los de tipo salvaje en el PC densidad quimeras excepción de los dos arriba citados. Además, si inespecífico microglial asesinato de los PC fueron el principal mecanismo de pérdida de la PC, luego de tipo salvaje y mutante PCs deben demostrar disminución porcentajes comparables. Este no es el caso en ninguna de las quimeras.

Mutant PC, incluso con la pérdida de tipo salvaje Bergmann neuroglia en la vecindad inmediata. En las quimeras, los PC son asombrosamente ausentes en las regiones que contienen abundantes de tipo salvaje neuroglia (Figura 4 E, de flecha). Por el contrario, los PC de tipo salvaje (Figura 4 F, flechas blancas) sobrevivieron incluso cuando rodeado de mutantes neuroglia (Figura 4 F, de flecha). Oligodendrocitos de ambos genotipos fueron dispersas en la sustancia blanca del cerebelo de los ratones quiméricos (Figura 4 G). La pérdida de mutantes PC es poco probable que se deba a la falta de un factor secretado de las células de apoyo. Si Npc1 se considere necesaria para la correcta secreción de este hipotético factor de supervivencia, y luego en torno a la naturaleza neuroglia tipo debería haber sido capaz de proporcionar a la molécula mutante PCs. El curso de la degeneración npc1 mutante PCs rodeado por un alto porcentaje de las células de tipo salvaje indica que las células autónomas de los mecanismos de desempeñar el papel principal en la muerte de PC.

Prevención de la Ataxia y Pérdida de Peso en Chimeric Ratones

A pesar de la pérdida de npc1 PC, algunos ratones quiméricos mostradas ataxia mínimo y no la pérdida de peso. Ataxia se evaluó a través de la medición de la agilidad de una balanza [29] y por cuantificar dimensiones de los pasos de andar en un ensayo [30]. En 190 días, más del doble de la vida útil normal de npc1 ratones, los dos quimeras con más de 50% de las células de tipo salvaje (C4.4 y C4.8) no mostró signos de emaciación y un mínimo de ataxia (Figura 5]. Aún más impresionante fue el ratón con sólo el 15% de las células de tipo salvaje (C2.1), que había reducido de manera significativa los síntomas. El fondo genético de las células mutantes que parece influir en la tasa de progresión de la enfermedad. Tardía síntomas no se observó en C5.2 y C5.6, que había sólo un poco menos de tipo salvaje contribución que C2.1. El npc1 células mutantes en el C5.2 y C5.6 ratones se deriva de un 75% FVB/25% BALB / c ↔ GFP + / + antecedentes, y los ratones mutantes de este fondo genético demostró una más rápida progresión de la enfermedad en comparación con la Mutación en el BALB / c de antecedentes de C2.1 (vida promedio de 67 ± 5 d versus 81 ± 8 d). Es notable que un 40% de los PCs puede morir sin que origina una grave ataxia o pérdida de peso, y que incluso los más pequeños números de células de tipo salvaje (15%) proporcionan una protección temporal contra la emaciación, ataxia, y la muerte.

Activación de Autophagy en Degenerating PC

Las pruebas de los ratones quiméricos de relieve la importancia de las posibles células autónomas de los mecanismos de degeneración PC. Necrosis, la apoptosis y la autofagia de los PC se producen en todos los modelos de ratones de la neurodegeneración (revisado en [31]]. El mecanismo de muerte celular en el trabajo en el CNP es desconocida, aunque un informe muy reciente de manifiesto la tinción de TUNEL y el aumento de los niveles de caspasa-8 en npc1 - / - cerebelo, el apoyo a un papel de la apoptosis en la neurodegeneración en la Comisión de Planificación Nacional [32]. Hemos tratado esta cuestión por ultraestructurales de la comparación de tipo salvaje y npc1 PC usando microscopía electrónica (EM). No apoptosis cuerpos fueron identificados por EM, ni nos identificamos cualquier TUNEL-positivas PC utilizando inmunofluorescencia etiquetado de los artículos del 48-d de edad npc1 - / - ratones (datos no presentados).

Por el contrario, numerosas estructuras con características compatibles con autophagic vacuolas (AVs) se identificaron en npc1 PC por EM. Anteriores estudios de EM npc1 PC [13, 16] tomó nota de la aparición de "laminar cuerpos de inclusión." Estas estructuras son compatibles con la activación de la autofagia, aunque en nuestro conocimiento no ha habido informes de la Comisión de Planificación Nacional en la autofagia. AVs pueden clasificarse como autophagosomes o autolysosomes basa en criterios morfológicos [33, 34]. Autophagosomes están vinculados por dos o más membranas aparentemente inalterados, y contienen componentes citoplásmica. El autophagic convergen las vías endocítica y siguientes de la fusión autophagosomes con fines endosomes y posteriormente con lisosomas [35]. Estos eventos de fusión resultado en autolysosomes, orgánulos envueltos por una única membrana limitante degradantes con las membranas celulares y componentes dentro. Numerosos AVs se encuentran en los PCs de 48-d de edad npc1 ratones homocigotos (Figura 6 A-6 E). Estas estructuras son raramente visto en el 48-d de edad, los ratones de tipo salvaje (Figura 6 F-6 H). Desde el CNP se acumulan lípidos dentro de las células que contiene orgánulos tarde endocítica y marcadores lisosomales, las estructuras que hemos identificado como AVs podría ser aberrante endosomes tarde o lisosomas, sin autofagia involucrados. Sin embargo, podemos identificar claramente el contenido citoplásmico (gratuito ribosomas, retículo endoplasmático [ER] cisternas, y las mitocondrias) dentro de estas estructuras, un diagnóstico de AVs. Cuantificación de los AVs en el tipo salvaje y npc1 PC demuestra que estas estructuras ocupan 15 veces más espacio en npc1 PC (Figura 6]. Rara vez, el cuerpo celular de una PC npc1 llenaban casi por completo con autolysosomes (Figura 6 E). PC npc1 degenerando en ratones tienen claramente características morfológicas compatibles con autophagic muerte de la célula.

El aumento de modificación de una proteína marcadora que autophagosomal una prueba más para la activación de la autofagia en npc1 cerebelo. Durante la autofagia inducida por el hambre o rapamycin, a la luz de cadena 3 (LC3), la proteína sufre modificación de lípidos por un ubiquitin-como el sistema de conjugación [36, 37]. Este lípidos-forma modificada de la proteína (LC3-II) se asocia con autophagosome membranas, y los niveles de LC3-II en correlación con la cantidad de autophagosome formación [38]. En adultos la corteza cerebelosa, LC3 proteína se informa, está presente principalmente en los PC, en base a estudios de inmunofluorescencia [39]. La cantidad de proteína LC3-II en npc1 - / - cerebelo aumenta enormemente con la edad (Figura 7 A). Cuando 22-d de edad, los ratones se comparan, LC3-II niveles son casi equivalentes. En los ratones de tipo salvaje, el nivel sigue siendo el mismo o puede disminuir ligeramente en el 50 - y 67-d de edad, los ratones. En el npc1 - / - ratones, hubo un 7 - y 11 veces más en LC3-II en comparación con los controles pareados por edad de las respectivas edades. Así, criterios morfológicos y bioquímicos muestran que se activa en la autofagia degenerando npc1 - / - cerebella.

Para determinar si la pérdida de npc1 es suficiente para inducir la autofagia en todos los tipos de células, se examinaron las células CT60, una línea celular albergar una pérdida de la función de la mutación en npc1 [40]. No elevación de LC3-II se detectó, aunque LC3-II acumulación claramente puede ser inducido en el ovario de hámster chino (CHO) con células rapamycin tratamiento (Figura 7 B). La falta de activación en una autofagia npc1 línea celular y en cerebella del 22-d de edad npc1 - / - autofagia ratones sugiere que se activa sólo en npc1 - / - células activamente en la degeneración.

Discusión

Neurodegeneración es una de las más devastadoras y teme tipos de enfermedades humanas. No existen tratamientos que detener la neurodegeneración y muy pocos incluso proporcionar alivio sintomático transitorio [41]. La enfermedad de Alzheimer, la causa más común de demencia, afecta a casi 12 millones de personas en todo el mundo [42]. Incluso en el caso de la enfermedad de Alzheimer la fisiopatología no está clara. Aún es controvertido si extracelulares o intracelulares depósitos de beta-amiloide son responsables de la mayor parte de la neurotoxicidad [43, 44], y la importancia de la inflamación de la progresión de la enfermedad es desconocida [45, 46]. Para la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas, la cantidad de la pérdida neuronal se puede atribuir a la célula-autónomo o no de células autónomas de los factores es desconocida. Hemos examinado esta cuestión crucial en los trastornos neurodegenerativos NPC.

Las personas que nacen con la enfermedad NPC de forma progresiva disminución de la función neurológica que puede incluir ataxia, temblor, distonía, demencia y epilepsia. Como la ataxia prominente sugiere, cerebelosa participación, incluida la degeneración de PC, ha sido bien documentado [47 - 49]. El modelo de ratón NPC recoge fielmente muchos de los síntomas humanos, la pérdida y el PC funciona como una medida fácilmente cuantificables de la neurodegeneración. La participación de las moléculas circulantes, tales como los esteroides y esteroles, y el ubicuo expresión de los genes NPC tanto, que la determinación de cuándo y dónde los genes son el CNP requiere un primer paso clave en la comprensión de la neurodegeneración. Un estudio anterior puso de relieve la importancia de los acontecimientos en el sistema nervioso central, como expresión de Npc1 impulsada por el promotor prión podría prevenir la neurodegeneración incluso sin completar el rescate del fenotipo hepático [30]. En este estudio hemos encontrado que los más prominentes neurodegenerativas caso, la muerte de la PC, se debe a la pérdida de Npc1 función dentro de las células y distintivo a una respuesta celular programada, la autofagia.

Cell-PC Autónoma de muerte en la Comisión de Planificación Nacional de Enfermedades

Hemos demostrado que la pérdida de los PC en el modelo murino de la Comisión de Planificación Nacional, que tiene un gen mutante npc1, es principalmente una célula autónoma de defecto. Este hallazgo pone limitaciones a los posibles mecanismos de degeneración en PC NPC enfermedad, y permite al futuro de las investigaciones se centran en el tipo de células que importa. Como se describe en la introducción, varias líneas de evidencia indicó que la neurodegeneración en la enfermedad de NPC podría ser una célula no-autónomo proceso. Sin embargo, la incapacidad de un entorno natural, incluida la de tipo silvestre que rodea neuroglia, para evitar npc1 - / - PC pérdida indica que la degradación de las computadoras personales no se debe a la pérdida de un factor secretado como neuroglia derivados de esteroles, neurotrophins , O Npc2 proteína. De acuerdo con este, dos estudios muy recientes no se detecta una diferencia en los niveles de secreción de colesterol de tipo salvaje versus npc1 - / - neuroglia [50, 51].

Además de las células gliales rodean, la salud de los PC podrían verse afectados por sus objetivos axonal en el núcleos profundos del cerebelo. La expresión de GFP es muy baja en las neuronas de los núcleos profundos del cerebelo en el GFP ratones (datos no presentados), por lo que no hemos podido evaluar el genotipo de estas células en las quimeras. Durante la migración de los equipos, sus axones no siguen apegados a su futuro post-sináptica objetivos [52]. Si npc1 PC muerte en ratones fue provocada por la pérdida de un objetivo derivado del factor, entonces la ausencia de un objetivo genotípica partido entre las neuronas y que significaría que los PC de tipo salvaje y npc1 PC debe ser igualmente afectados. Esto no es lo que observamos. Además, privan por completo de su PC axonal objetivos por axotomía no causa la degeneración PC incluso hasta un año después de axotomía [53, 54]. Así, Daño Articular cerebelosa profundo de los núcleos es poco probable que se causan degeneración PC en la Comisión de Planificación Nacional.

Secretan moléculas tóxicas o puestos en libertad no son también responsables de la muerte de PC. Microglia producen pro-inflamatorias y citotóxicas compuestos que incluyen citoquinas, proteasas y radicales libres [55 - 57] y en la actualidad son más altos de lo normal en los números de la NPC mutante cerebelo [28]. Un robusto respuesta inflamatoria pueden desempeñar un papel en la neurodegeneración progresiva visto en la Comisión de Planificación Nacional, pero no es el principal factor de pérdida neuronal en el origen: en la mayoría de los ratones quiméricos silvestres de tipo PC no degenere aún cuando en medio de numerosas microglia. Nuestros experimentos no excluyen una más-de células de microglia papel específico en el PC la muerte. Microglia podría ayudar a desencadenar la muerte celular por interacciones moleculares específicos con las PC susceptibles, como se propone que se producen durante la muerte PC normalmente visto en el día postnatal 3 [58]. Un mecanismo basado en microglia requeriría una célula autónoma-componente de las PC que expresan receptores de la membrana adecuada-y no de células de microglia-componente autónomo para llevar a cabo el engulfment dirigida sólo a los de las células.

Factores internos en la neurodegeneración

PC pueden degenerar ya sea (1) debido a que la acumulación de esteroles y otros lípidos, o de otras sustancias desconocidas, venenos o el PC (2) porque el tráfico defectos resultantes de la pérdida Npc1 afectan a la supervivencia celular. Aunque el exceso de colesterol puede tener efectos tóxicos [21], los niveles intracelulares de colesterol dentro de los PC no se correlaciona con la pérdida de estas células: lóbulo X PC acumular colesterol y no degenerar durante los 70 d que normalmente constituyen la npc1 ratón vida. Más sutiles diferencias entre los lóbulos, de esterol en masa o localización subcelular de colesterol, es poco probable que se detecte con filipin tinción. En cualquier caso, el bloqueo de la acumulación de lípidos es insuficiente para frenar la pérdida neuronal, de nuevo argumentando en contra de la idea de que la muerte celular se produce debido a la acumulación de lípidos. Cruce de los npc1 a un ratón knockout mouse-GalNAcT incapaz de sintetizar la compleja gangliósidos sphingolipids disminuye los niveles de colesterol y sin ningún efecto sobre la neurodegeneración [59]. Cruce de los npc1 ratón a un receptor de las lipoproteínas de baja densidad también knockout no neurodegeneración lento [60]. Aunque ambos de estos experimentos tienen sus debilidades-posible acumulación de sphingolipids menos complejo en el experimento y GalNAcT posible redundancia en las lipoproteínas de receptores en la lipoproteína de baja densidad de receptores eliminatorias-al menos, las conclusiones sugieren que la toxicidad intracelular debido a la acumulación de lípidos no es el mecanismo principal PC de la muerte.

Defectos en el tráfico de lípidos es probable que tengan efectos perjudiciales sobre todo en los procesos sintéticos que dependen de los lípidos como substratos. Un estudio reciente demuestra que neurosteroid síntesis se reduce en ratones npc1 y administración de allopregnanolone de vida y aumenta la supervivencia neuronal [61]. PC pérdida de injerencia en la producción de neurosteroids actuando de una manera paracrina o endocrino es insostenible a la luz de nuestros hallazgos. Un mecanismo de acción autocrina, con los PC de toma sustancias que actúan en la producción de células, todavía es plausible y debe estudiarse más a fondo. PCs diferentes neurosteroids sintetizar y expresar los receptores de progesterona [62]. PC son únicos en tener una extensa buen ER, el "hypolemmal cisternas", que es "tan bien desarrollados en los PC que se puede considerar una característica específica… ya que se extiende bajo el plasmalemma de células de todo el cuerpo, el árbol dendríticas, y El axón "[63]. Palay y Chan-Palay [63] También tomamos nota de que las mitocondrias se encuentran a menudo en contra de la superficie interior de la cisterna hypolemmal. Deterioro de la trata de colesterol a la mitocondria y el buen ER puede dar lugar a una deficiencia en estos lugares, la reducción de la producción de neurosteroids.

Autofagia en NPC PC muerte

Pérdida de la función dentro de los PC npc1 conduce a un aumento de la autofagia y la muerte celular. La apoptosis también pueden estar involucrados en la muerte de las neuronas de la Comisión de Planificación Nacional enfermedad; ambos procesos es probable en el trabajo en el CNP degenerando cerebro. En contraste con la apoptosis, que se ha demostrado en muchos casos de la neurodegeneración (revisado en [31]], activado autofagia se ha demostrado en sólo unos pocos casos, pero sobre todo, incluida la muerte de los PC en Lurcher ratones [64]. El papel de la autofagia en las enfermedades neurodegenerativas se extiende a la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson [65 - 67]. Estas enfermedades neurodegenerativas difieren de la Comisión de Planificación Nacional en el sentido de que son trastornos de la agregación de la proteína. Formación de agregados insolubles de Huntingtin o alfa-sinucleína es un evento temprano en la progresión de la enfermedad [68 - 71]. Autofagia puede ser activadas por las células a fin de disponer de los agregados. Deliberadamente el aumento de la degradación de los agregados de la proteína desencadenante autofagia en modelos animales de enfermedad de Huntington puede atenuar los efectos de la enfermedad [67]. No agregación de la proteína se ha informado en la Comisión de Planificación Nacional, sino un mecanismo similar podría ser en el trabajo: durante las primeras semanas de vida, puede activar las células para degradar la autofagia anormal de lípidos cargados de lisosomas y permitir la supervivencia de los PC. Si esto es cierto, entonces las células cargadas de lípidos con lisosomas autophagic deben tener alta actividad. Esta predicción está claramente en contradicción con nuestros datos: activación de la autofagia es visto sólo en los mayores, degenerando PC, y npc1 células no sometidos a la muerte celular, que no presentan mayores niveles de la autophagic marcador LC3-II.

¿Por qué entonces es la autofagia inducida degenerando en PC? Autofagia es normal, celular, proceso que está regulado por el estado nutricional y de las hormonas. Pérdida de npc1 conduce a la captura de los lípidos de membrana aberrantes dentro de los compartimentos, lo que puede inducir a una "respuesta de los lípidos de la inanición" análoga a la bien caracterizada autophagic respuesta a la privación de aminoácidos. De hecho, ya hay pruebas de que ese tipo de respuesta se da en homocigosis npc1: a pesar de la aparente exceso de colesterol en npc1 - / - células, la SREBP vía de señalización se activa. Esto se traduce en el aumento de la síntesis de colesterol y de lipoproteínas de baja densidad de receptores de actividad [72]. Así, la Comisión de Planificación Nacional células actúan como si lo son "colesterol hambre". NPC células, por lo tanto, puede tener tres formas para adaptarse a la escasez de esteroles y otros lípidos: aumento de la síntesis de lípidos, el aumento de la absorción de lípidos, y la autofagia. Microarray SREBP análisis de los objetivos en el hígado [73] no reveló aumento de la transcripción de los genes autofagia, pero los objetivos pueden ser diferentes entre los tejidos, o el reglamento pueden ocurrir en el nivel post-transcripcional. En células de la Comisión de Planificación Nacional, la autophagic respuesta sería inútil ya que los sistemas de transporte son dañados. En lugar de rescatar a la célula, la autofagia podría acelerar la muerte de la célula por secuestrar y reducir aún más los lípidos disponibles.

Destructivas en la autofagia NPC mutante PC también puede, o en lugar de ello, ser estimulado por hormonas. En los mamíferos, la autofagia es inhibida por la insulina [74], y, en los insectos, los esteroides regulan la autofagia de las neuronas por un mecanismo autónomo de la célula [75, 76]. En Manduca (esfíngidos tabaco) y de las neuronas motoras en las glándulas salivales y de la grasa corporal de Drosophila, los esteroides ecdysone desencadena la autofagia en vez de puntos específicos de desarrollo. Nos inferir una relación diferente de reglamentación en la Comisión de Planificación Nacional de mamíferos. Neurosteroids inhiben la autofagia podría en el PC y cuando su síntesis se ve gravemente disminuido, al igual que en la Comisión de Planificación Nacional [61], autophagic la muerte de las células pudieran derivarse de ello. Neurotrophins también pueden estar implicados en la regulación de PC autofagia. PC autophagic cultivadas de someterse tras la muerte de las células neurotrophin retiro [77]. Estos resultados son pertinentes a la Comisión de Planificación Nacional, porque las neuronas de ratones CNP han disminuido de respuesta a neurotrophins [78].

Los niveles de participación en el Cerebelo Chimeric npc1 - / - Ratones

Los ratones quiméricos también proporcionar información acerca de la progresión de la enfermedad. Homocigotos npc1 ratones en el 70 d son incapaces de mantener la postura de la balanza de incluso unos pocos segundos y con un peso de sólo la mitad que los controles. Sorprendentemente, algunas quimeras había un mínimo de ataxia y no malgastar, a pesar de la pérdida de aproximadamente el 40% de los PC. El mínimo ataxia fenotipo, que se manifiesta ocasionalmente como se desprende de la balanza de inflexión en tanto, dejó de avanzar por aproximadamente 140 d. En esta edad, casi todos los mutantes ordenadores, incluidos los de lóbulo X, había muerto. Presumiblemente ataxia empeora hasta que todos los PCs mutantes mueren, momento en el que el fenotipo se estabiliza.

Con tantos ordenadores perdido, en otras regiones del cerebro, cerebelo otras células, o el resto de PCs pueden compensar. Cambios morfológicos que se han observado en el resto de npc1 neuronas, como la aparición de espinas dendríticas ectópico y meganeurites [26, 79] y el aumento de ancho de la dendríticas árbol [80], pueden ser las manifestaciones físicas de los restantes PCs asumiendo funciones de Sus homólogos fallecido. La indemnización también puede ocurrir en otras regiones del cerebro. En el pcd y Lurcher modelos de ratones, mecanismos de compensación en el eferentes objetivos de los PCs, los núcleos profundos del cerebelo, han sido considerados responsables de la ataxia leve que se produce a pesar de las graves pérdidas de PC [81]. Lurcher ratones quiméricos, en la que los PC Someterse a la pérdida de células-autónoma, no tienen alteraciones de comportamiento, incluso cuando tienen algunas células de tipo salvaje [82]. Estudios recientes utilizando este modelo de PC degeneración han definido un número mínimo de los equipos necesarios para el control motor normal entre 1000-7000, o aproximadamente el 1% -5% de la cantidad normal de los PC [83, 84]. Así, la pérdida de los PC puede ser considerablemente mejorado con todavía-a-ser-identificado mecanismos, y reduce la disminución de la PC mediante cualquier mecanismo puede permitir el aumento de la indemnización. Algunos de los fenotipos de la npc1 - / - ratón es probable que se deba a la pérdida o Daño Articular de otras células, como determinadas poblaciones de neuronas en el tálamo [85] o ganglionares de la raíz dorsal [86]. Parece que existe un umbral crítico de la contribución de tipo salvaje entre el 30% y el 60% requerido para casi completa de rescate de ambos ataxia y pérdida de peso. El retraso en la progresión de verse con un bajo nivel de las células de tipo salvaje (aproximadamente 15%) es bastante alentador con respecto a la posibilidad de que las terapias que preservar incluso algunas de las celdas.

Varias preguntas acerca de la pérdida de los PC en CNP han sido respondidas en el estudio. De cuatro posibles mecanismos de la pérdida de PC (véase la figura 1], los ratones quiméricos demostrar que las dos células estrictamente no-autónomo modelos no son válidas. De los dos modelos de células autónomas, frente a la toxicidad interna subcelulares deficiencia, que favorecen la última sobre la base de los defectos observados en el tráfico de orgánulos npc1 cultivos celulares [87, 88], la falta de correlación entre los niveles de colesterol y PC pérdida, la disminución de los niveles De la esteroidogénesis npc1 en ratones [61], y los estudios anteriores transgénicos diseñados para disminuir el colesterol o sphingolipid acumulación [59, 60]. Prevemos que, en respuesta a la propuesta de la deficiencia intracelular, las células compensar el aumento de la síntesis endógena de colesterol, por endocitosis, y / o por la autofagia. En las células con una alta demanda de los lípidos y la insuficiencia de la oferta, la autofagia aumentos y se produce la muerte celular. Es posible que una serie de eventos similares-defectuoso tráfico subcelulares deficiencia conduce a la muerte celular y autophagic-ocurre en muchas otras enfermedades de almacenamiento lisosomal. A nuestro entender, Danon enfermedad, causada por la deficiencia de la proteína de membrana lisosomal LAMP-2, es el único otras enfermedades lisosomales de almacenamiento que tiene un demostrado aumento de los AVs [89]. El patrón de degeneración que estallan en cada enfermedad sería determinado por la respuesta específica de células-de ser privados de un particular molécula o clase de moléculas. PC parece ser muy sensible a la insuficiencia de los niveles de esteroles o esterol metabolitos (y quizás también a sphingolipid deficiencia, ya que la PC es importante en la pérdida de Niemann-Pick tipo A y [90, 91]].

Nuestros resultados son particularmente interesantes a la luz de las otras dos enfermedades neurodegenerativas humanas que se han analizado con modelos de ratones quiméricos. En la esclerosis lateral amiotrófica, en torno de tipo salvaje no puede impedir que las células neuronales la degeneración de las neuronas motoras SOD1 mutante, y el genotipo de las neuronas motoras sí parece que no guardan ninguna relación con su probabilidad de supervivencia [23]. En el mnd ratón, un modelo para ceroid lipofuscinosis neuronal, proteolipid almacenamiento de células-es autónomo, pero la degeneración retiniana equivalente a la mnd controles se observó en todos los ratones quiméricos [24]. El hecho de que tres de las enfermedades neurodegenerativas examinado este enfoque experimental con tres diferentes modos de exposición de la degeneración (no-autónomo de rescate celular para la esclerosis lateral amiotrófica, la célula de almacenamiento autónomo, pero no las células de la degeneración autónoma para ceroid lipofuscinosis neuronal, y células, autónomo autophagic Muerte por NPC) demuestra la notable diversidad en los mecanismos de la degeneración neuronal y pone de relieve cómo aún hay mucho que aprender acerca de la biología de la neurodegeneración.

Materiales y Métodos
Apoyo a la Información

Damos las gracias a la Ara Parseghian Medical Research Foundation por su apoyo a esta investigación. Damos las gracias a Marlene Rabinovitch y Lihua Ying para la LC3 anticuerpo policlonal de conejo. Damos las gracias a Nat Heintz, Zhenyu Yue, y William Jackson útil para los debates sobre la autofagia. Damos las gracias a xun Emily Huang y Ray para comentarios sobre el manuscrito. DCK con el apoyo de una Beca de Formación Médica Scientist. MPS es un investigador del Howard Hughes Medical Institute.