PLoS Genetics, 2005; 1(1): (más artículos en esta revista)

Un bucle de regulación HIF1 α Enlaces hipoxia mitocondrial y señales en feocromocitomas

Patricia L. M Dahia [1], N Ken Ross [2], Mateo E Wright [1], César Y Hayashida [3], Sandro Santagata [4], Marta Barontini [5], Andrew L Kung [6], Gabriela Sanso [5], James F Potencias [7], Arthur S Tischler [7], Richard Hodin [8], Shannon Heitritter [4], Francis Moore [4], Robert Dluhy [4], Julie Ann Sosa [9], I. Tolgay Ocal [9], Diana E Benn [10], Deborah J Marsh [10], Bruce G Robinson [10], Katherine Schneider [11], Judy Garber [11], Seth M Arum [12], Márta Korbonits [13], Ashley [13] Grossman, Pigny Pascal [14], p. A Sérgio [3] Toledo, Vania Nosé [4], Cheng Li [15], Charles Stiles D [1]
[1] Departamento de Biología del Cáncer, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América
[2] Broad Institute, Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos de América
[3] Universidad de São Paulo, Facultad de Medicina, São Paulo, Brasil
[4] Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América
[5] Centro de Investigaciones Endocrino, Hospital de Niños R. Gutiérrez, Buenos Aires, Argentina
[6] Departamento de Oncología Pediátrica, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América
[7] Tufts-New England Medical Center, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América
[8] Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América
[9] Universidad de Yale, New Haven, Connecticut, Estados Unidos de América
[10] Royal North Shore Hospital y Kolling Instituto de Investigaciones Médicas de la Universidad de Sydney, Australia
[11] División de Población de las Ciencias, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América
[12] Boston Medical Center, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América
[13] St Bartholomew's Hospital, Londres, Reino Unido
[14] Regional Hospital de la Universidad de Lille, Francia
[15] Departamento de Ciencias Biostatistical, Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, Estados Unidos de América
Resumen

Feocromocitomas son derivados de la cresta neural, tumores que surgen de mutaciones heredadas o esporádicas en al menos seis genes independientes. Las proteínas codificadas por estos genes regulan múltiples funciones distintas. Presentamos aquí un vínculo funcional entre los tumores con mutaciones BVS y aquellos con trastornos de los genes que codifican para succinate deshidrogenasa (SDH) subunidades B (SDHB) y D (SDHD). Una transcripción perfil de la reducción de oxidoreductase se detecta en todos los tres de estos tipos de tumores, junto con la angiogénesis / hipoxia perfil típico de la BVS disfunción. El oxidoreductase defecto, no detectado anteriormente en la BVS-null tumores, se explica por la supresión de la proteína SDHB, un componente del complejo mitocondrial II. La disminución de la SDHB se observó también en los tumores con mutaciones SDHD. Ganancia de la función y la pérdida de la función de los análisis muestran que el vínculo entre las señales de hipoxia (a través de la BVS) mitocondrial y señales (a través de SDH) está mediado por la HIF1 α. Estos resultados explican las características de los feocromocitomas compartida con la BVS y SDH mutaciones y sugerir un mecanismo adicional para HIF1 α aumento de la actividad en los tumores.

Introducción

Suprarrenal y feocromocitomas extra-adrenal (también conocido como paragangliomas) son los tumores secretores de catecholamine-derivados de células cromafines de la cresta neural origen [1]. Feocromocitomas pueden surgir como resultado de mutaciones en las siguientes enfermedades asociadas a los genes: RET en la neoplasia endocrina múltiple tipo 2 (MEN2); en la BVS de von Hippel-Lindau (BVS); NF1 en la neurofibromatosis tipo 1 (NF1) y deshidrogenasa succinate (SDH) subunidades B, C, D, o paraganglioma familiar en síndromes de tipo 4 (PGL4), tipo 3 (PGL3), y la tipo 1 (PGL1), respectivamente [2]. El feocromocitoma varios genes de susceptibilidad modulan una gran variedad de vías de señalización que son superficialmente sin relación el uno con el otro. Sin embargo, el uniforme fenotipo de los tumores que se derivan de estas diferentes lesiones genéticas sugiere la presencia de vínculos bioquímicos subyacentes.

La BVS gen supresor tumoral es un mediador clave de la respuesta a la hipoxia. Está dirigida a la hipoxia-inducible factor 1 subunidad α (HIF1 α) de la degradación mediada por ubiquitin-bajo condiciones normales de oxígeno [3]. HIF1 α ha demostrado ser crucial para el resultado de los efectos oncogénicos BVS mutaciones en determinados contextos celular [4, 5]. Otros dos genes relacionados con paraganglioma familiar, SDHB y SDHD, codifican subunidades de SDH, que compone la enzima mitocondrial complejo II [6, 7]. Esta enzima es a la vez un componente del ciclo de Krebs, por oxidantes succinate a fumarato, y de la cadena respiratoria mitocondrial, mediante la transferencia de electrones a la ubiquinona piscina [8]. Paragangliomas familiares asociados con SDHB y SDHD mutaciones parecen a la acción sobre el cuerpo carotídeo crecimientos que se producen como resultado de la hipoxia crónica de la exposición en las personas que viven a gran altura [6]. Estas observaciones clínicas y los hallazgos de una mayor expresión de HIF objetivos en los tumores con mutaciones SDH [9, 10] han sugerido la posibilidad de que la BVS y SDH síndromes se entrecruzan en el nivel molecular.

Como una pantalla de nivel de entrada para interactuar señales, que generó a nivel mundial expresión firmas de 76 hereditarias y esporádicas primaria feocromocitomas y paragangliomas. Mostramos aquí que con feocromocitomas BVS y SDHB o SDHD mutaciones formar un apretado grupo con una clara reducción de la hipoxia y oxidoreductase firma. Esta observación condujo a la identificación de proteínas SDHB reprimidas en los tumores con BVS mutación genética y la demostración de que este efecto es dependiente de HIF. Nuestros resultados feocromocitomas vínculo con mutaciones en distintos genes-BVS, SDHB, y SDHD-y sugieren que la inhibición mitocondrial complejo II contribuye al desarrollo de la BVS con feocromocitomas mutación.

Resultados
Expresión de perfiles de los vínculos con feocromocitomas BVS y SDHB o mutaciones SDHD

Sin supervisión de conglomerados jerárquico análisis de una cohorte de 76 feocromocitomas esporádicos y hereditarios (Dataset S1] identificó dos grupos dominantes de expresión (Figura 1; Dataset S2]. Grupo 1 comprende todas las BVS y SDH tumores. Grupo 2 figuran todos los MEN2 y NF1 feocromocitomas. El resto de familiares desconocidos tumores esporádicos y 37 muestras fueron dividirse en uno u otro de los dos grandes grupos. Grupo 1 figuran 12 de los 13 tumores extra-adrenal. Sin embargo, el bipartito distribución de conjuntos de tumor no es un simple reflejo de la ubicación anatómica del tumor, porque más de la mitad de Grupo 1 en los tumores de origen suprarrenal (Figura 1].

Para validar la expresión agrupaciones, que confirmó inicialmente la expresión diferencia entre los dos grupos cuantitativos por PCR en tiempo real o Western blot de los genes identificados por el análisis no supervisado (Dataset S3]. A continuación, todos los familiares las muestras secuenciadas y también 20 de los tumores esporádicos de mutaciones conocidas en los genes asociados con feocromocitoma. Hemos detectado novela BVS, SDHB, y RET mutaciones en seis muestras procedentes de cuatro familias independientes (Tabla 1]. En todos los casos, las mutaciones de los genes residen en el componente previsto por el grupo de distribución.

Todos los tumores de la BVS, incluyendo el recientemente identificado mutaciones en las muestras del Grupo 1, así como la MEN2 tumores de la Categoría 2, se utiliza para generar dos clases predictores (Dataset S4]. Asimismo, también fueron predictores de genes creado por la comparación de MEN2 y otro componente de la Categoría 1, SDH tumores (ambos inclusive SDHB y SDHD mutantes). Una extensa superposición fue visto entre los genes que discriminan MEN2 SDH de tumores y los que distinguir MEN2 BVS de los tumores (Figura 2; Dataset S4]. Más del 92% de toda la muestra correctamente cohorte fue asignado a una de las dos clases, de acuerdo con el agrupamiento no supervisado de distribución (Dataset S4]. Estos resultados esbozar las similitudes entre molecular de los tumores subcomponente Grupo 1 (BVS y SDH) y la validación de los dos grupos de expresión detectados por el análisis sin supervisión (véase la figura 1].

Suprimida SDHB expresión es una característica común de los tumores BVS y SDH

Grupo 1 tumores están asociados con un conjunto de programas biológicos que difiere notablemente de feocromocitomas Grupo 2 (Tabla 2, Figura 2; Dataset S4]. Estos tumores muestran una rica firma de la angiogénesis, la hipoxia, elementos de la matriz extracelular, y coordinada represión de los oxidoreductase enzimas. Los tres primeros componentes se han asociado con mutaciones en el gen BVS, cuyo producto es un conocido regulador de la actividad de HIF la vía [11]. De la nota, feocromocitoma fue la única manifestación en la BVS una de las familias de esta serie (155 y 156 tumores; véase la figura 1]. Estas características son indicativos de la BVS tipo 2C, que se ha considerado HIF-independiente [12, 13]. Estos tumores agrupado con el resto de la BVS muestras en el análisis de perfiles de expresión, lo que sugiere que la transcripción similitudes entre estos casos y los restantes BVS tumores son más numerosas que las diferencias que puedan soportar. Sin embargo, sólo a largo plazo de seguimiento, que no se dispone en esta parentela, puede definir con precisión estos tumores como la BVS tipo 2C. La transcripción similar perfil de feocromocitomas con mutaciones en subunidades SDH indica que el mecanismo por el que estos tumores también implica el desarrollo de la hipoxia-sensing pathway. Debido a la limitada cantidad de material tumoral, no hemos podido cuantificar HIF1 α α HIF2 y los niveles de proteína en nuestras muestras primarias.

Otro elemento de la firma Grupo 1-sincronizada supresión de las funciones mitocondriales-se observó principalmente por la reducción de la expresión de los componentes de la respuesta oxidativa del ciclo de Krebs y en tanto no supervisado y supervisado el análisis de estos tumores. Este perfil generado múltiples resultados significativos por la vía de enriquecimiento de métodos de análisis, el análisis de genes de enriquecimiento (GSEA) (Cuadro 2], que mide el grado de correlación inversa oxidativo de las vías de un rango de la lista ordenada de genes derivados de las comparaciones pairwise. Deprimido oxidoreductase función no ha sido previamente vinculado a un HIF mediada por la firma. Mitocondrial complejo II es un componente de la cadena de transporte de electrones, y SDHB o mutaciones de los genes SDHD que derogar la oxidoreductase función de los complejos II puede causar feocromocitomas [9, 14, 15]. Debido a la función de las subunidades SDH como supresores de tumor, que razonó que la firma oxidoreductase observado en feocromocitomas del Grupo 1 (Tabla 2] podría indicar que los trastornos complejos II podría contribuir a otros tumores además de los que tienen mutaciones SDH. Esto nos llevó a examinar el vínculo entre los feocromocitomas BVS y SDH con mutaciones en nuestra serie por determinar, en primer término la expresión de la proteína de la unidad catalítica de complejos II, SDHB. Encontramos que la expresión de SDHB se reduce en todos los tumores con SDH (SDHB y SDHD) mutaciones en la cohorte (Figura 3 A), lo que indica que bajo SDHB expresión funciona como un sustituto de la interrupción del complejo II. Es importante destacar que, reprimidas SDHB, fueron también encontrados en la mayoría de los tumores con mutaciones BVS y feocromocitomas esporádicos de Grupo 1 a prueba por immunoblots (Figura 3 B). Para confirmar este hallazgo, se realizó inmunomarcación de SDHB en feocromocitomas o paragangliomas representante de los diversos síndromes genéticos usando parafina disponibles-materiales incrustados. SDHB inmunoticción es muy concordante con los hallazgos inmunoblot (Figura 3 C), lo que sugiere que SDHB downregulation puede ser una característica de un grupo más amplio de los feocromocitomas. Aunque SDHB ARNm se colectivamente menor en el grupo 1 que en los tumores Grupo 2 feocromocitomas (Dataset S5], los niveles de la proteína SDHB no exactamente paralela mRNA abundancia en las muestras individuales del tumor, lo que sugiere que un defecto de transcripción pueden no del todo cuenta de las diferencias en la expresión SDHB Observó a nivel de proteínas.

En contraste, Grupo 2 tumores presentan una serie de programas biológicos, incluidos los genes que median la traducción iniciación, la síntesis de la proteína, la quinasa y de señalización (Tabla 2; Dataset S4]. Los dos prototipos de los genes de la Categoría 2 (RET y NF1) están vinculadas por su común habilidad de activar el RAS / RAF / MAP kinasa cascada de señalización [16, 17]. RAS activado señalización ha sido demostrado por perfiles de expresión que se asocia con un aumento de los eventos de traducción [18]. Así, el anabólico funciones de RAS activado puede constituir el mecanismo bioquímico que subyace en la cesión de MEN2 y NF1 tumores a la Categoría 2. Incremento en la expresión de genes de la definición de un neural / neuroendocrino perfil y el metabolismo se adrenérgicos también características destacadas de este grupo (Cuadro 2; Dataset S4].

HIF1 α Contribuye a SDHB Reglamento

Debido al papel fundamental de la BVS en el control de la disponibilidad de HIF en normoxic condiciones, el próximo investigado si downregulation de SDHB se HIF-dependiente. En dos modelos de línea celular, y el ratón HEK293 feocromocitoma línea celular 9/3L (MPC), la exposición a la hipoxia-mimética agente de cloruro de cobalto SDHB reducido la expresión de la proteína (Figura 4 A). Además, la expresión transitoria de un mutante, nondegradable forma de HIF1 α, HIF1 α P402A/P564A, pudo downregulate SDHB (Figura 4 B). En cambio, la represión de los HIF1 α en la cresta neural-A2058 derivado líneas celulares de melanoma que expresan establemente HIF1 α corto horquilla RNA (shRNA) impidió la reducción de la SDHB después de la exposición al cloruro de cobalto (Figura 4 C), en contraste con las células que expresan el control shRNA secuencia, El apoyo a una función central de HIF1 α en la regulación de los niveles de SDHB. Este hallazgo implica HIF1 α como mediador entre las agrupaciones de la BVS - y SDH-mutado primaria feocromocitomas identificados en nuestro estudios de perfiles de expresión. Similar a lo que hemos encontrado en la enseñanza primaria feocromocitomas, sin disminución de la SDHB mRNA se detectó cuando estas líneas celulares fueron tratados con hipoxia-mimética drogas (datos no presentados), lo que sugiere que un posttranscriptional fenómeno tiene que ver con estos resultados.

Discusión

Transcripción de perfiles de una gran serie de feocromocitomas primaria revela que los tumores con mutaciones BVS y SDH están estrechamente vinculados. La hipoxia-angiogénesis firma identificados por el análisis de tumores primarios con SDHB o SDHD mutaciones confirma y extiende recientes observaciones sobre el papel de la SDH proteínas cultivadas en líneas celulares. Selak et al. Mostraron que la interrupción de los complejos mitocondriales II HIF1 resultados en el aumento de la actividad α y que esta upregulation se canaliza a través de la inhibición de la función prolyl hidroxilasa [19]. Hidroxilación Este paso es fundamental para la BVS-dependiente HIF1 α degradación [20, 21]. Nuestros datos muestran que las mutaciones mitocondriales II complejo llevar a upregulation de HIF1 α objetivos humanos en el tejido del tumor y de indicar un nivel adicional de la interacción entre la SDHB y HIF1 α proteínas, es decir, un efecto recíproco de HIF1 α en la modulación de los componentes de los complejos mitocondriales II. Nuestros resultados favorecen a la existencia de un bucle autoregulatory cual HIF1 α contribuye a la atenuación de los niveles de SDHB, lo que resulta en la inhibición del complejo II (Figura 4 D). Los altos niveles de succinate derivada de la pérdida de la función compleja II, a su vez, puede bloquear la degradación de HIF1 α a través de la inhibición de la prolyl hydroxylases. Sin embargo, aunque succinate acumulación, pero no el estrés oxidativo, se consideró la oncogénico de activación por Selak et al. [19], el aumento de los niveles de especies reactivas del oxígeno se han reportado en modelos animales de disfunción SDHC [22 - 24]. Estos últimos resultados son consistentes con la oxidoreductase nuestro principal defecto de muestras tumorales. Los mecanismos precisos para la interacción entre HIF1 α y SDHB todavía quedan aún por identificar, pero nuestros datos indican que un posttranscriptional respuesta es probable que participe. De la nota, y de acuerdo con nuestros datos actuales, HIF2 α / EPAS1 nulo ratones se ha informado de que el aumento de la actividad en los músculos SDH [25].

Una provocación posibilidad sugeridas por los resultados es que los efectos de la BVS tumorigénicos mutaciones en los tejidos cromafines podría implicar disfunción mitocondrial del complejo II. Por lo tanto, proponemos que en los tumores derivados de la BVS dos mecanismos complementarios desempeñan un papel en la estabilización de HIF1 α: la pérdida de la BVS que dependen de la orientación de HIF1 α para proteasoma mediada por la degradación, y un segundo mecanismo que depende de los bajos niveles de HIF1 α resultantes de la hidroxilación Complejo II disfunción. Los efectos de HIF1 α en nuestro modelo son menos marcados que los observados con los agentes de la hipoxia-miméticos, que inhiben prolyl hydroxylases. Esto sugiere que otros factores, además de HIF1 α, podrían estar involucrados en la represión SDHB. Como tal, será relevante para determinar cómo y SDHB mitocondrial complejo II se regulan en la BVS tipo 2C variantes que se han propuesto para impartir distintos, HIF-independiente de señalización resultados [12, 13].

La relación entre el oxígeno y SDH función de la reglamentación se ha sospechado sobre la base de la identificación previa de incremento en la expresión de factores angiogénicos en los casos de SDH-mutante feocromocitomas [9]. También, además de similitudes feocromocitoma clínicos se han observado en las familias con mutaciones germinales de la BVS y SDHB [26]. Esto está de acuerdo con nuestros resultados de transcripción de datos y bioquímicos que indican que HIF1 α participa en esta asociación. El bipartito transcripción agrupación de feocromocitomas ha proporcionado una explicación de la relación entre dos subtipos genéticos de los feocromocitomas. También puso de manifiesto que esta distribución tiene un alto valor predictivo, según lo determinado por la identificación de mutaciones previamente inadvertido en muestras tumorales segregar con el grupo apropiado. El éxito distinción de los tumores de Grupo 1 y Grupo 2 por SDHB inmunoticción en nuestra serie experimental sugiere que esto puede ser convertido en un nuevo método para clasificar feocromocitomas en una de dos categorías principales que reflejan el defecto genético subyacente. De interés, en un estudio reciente, inmunohistoquímica de la cabeza y el cuello con paragangliomas SDHB y SDHD reveló mutaciones similares supresión de la SDHB, que fue acompañada de la mitocondria morfológicamente anormales [27]. Esto está en línea con nuestros resultados de los tumores secretores de catecholamine-y sugiere que SDHB downregulation general es un marcador de disfunción complejo II. Este estudio también describe una serie de esporádicos de cabeza y cuello con paragangliomas baja SDHB tinción; estos tumores podrían corresponder con feocromocitomas Grupo 1 para las que no se identificó la mutación detectable, y que también parece derivarse de la interrupción de las rutas relativas. Queda por probar si la predominante hipóxico-angiogénicos perfil de los feocromocitomas con BVS y SDH mutaciones hará que estos tumores antiangiogenic objetivos para las terapias. Esto será especialmente relevante para SDHB-mutante feocromocitomas que se han sugerido para ser más propensas a padecer enfermedades malignas [10].

Materiales y Métodos
Apoyo a la Información
Resumen de los datos clínicos y de Pheochromocytomas Clasificación por grupos genéticos
(13 KB PDF)
Filtrado de la lista de genes sin supervisión análisis
(137 KB PDF)
Resultados de la PCR en tiempo real y análisis de Western blot de los genes expresados diferencialmente
(27 KB PDF)
Cruz-Validación y Gene Conjunto de Análisis de Resultados (Gene listas y Calor Mapa Imágenes) de la Clase Dos comparaciones vigilado por los métodos de aprendizaje
(345 KB PDF)
Expresión de los complejos mitocondriales II subunidades feocromocitomas en la distribución por grupo
(12 KB PDF)
Números de Adhesión

Los datos mencionados en esta publicación se han depositado en el NCBI Gene Expression Omnibus (GEO, Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ) Y son accesibles a través de la serie GEO número GSE2841.

Damos las gracias a Ricardo Aguiar para el asesoramiento y la revisión crítica del manuscrito; Todd Golub de opinión y sugerencias; Scott Pomeroy, John Alberta, y William Kaelin, Jr, por los comentarios; Margaret Shipp y Graeme Eisenhofer para el acceso a los datos prepublication; Christian Colin para Asistencia técnica, y Gail Adler para el acceso a muestras tumorales. También damos las gracias al Hospital General de Massachusetts, Banco de Tumores, Cerebro y Banco de Tejidos para Trastornos del Desarrollo en la Universidad de Maryland, y el Servicio de Microarray Core en el Dana-Farber Cancer Institute. PLMD es destinatario de un Claudia Adams Barr Premio Investigador y un Pan-Misa Agencourt Secuenciación Grant. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Charles A. Dana Proyecto de Neuro-Oncología (CDS), NIH-PO1 HD24926-12 (CDS), RO1 CA48017 (AST), y RO1 NS37685 (AST).