PLoS Genetics, 2005; 1(1): (más artículos en esta revista)

Las unidades de selección positiva la evolución del rinoceronte, un miembro de la Familia Heterochromatin Proteína 1 en Drosophila

Danielle Vermaak [1], Steven Henikoff [1], Malik Harmit S [1]
[1] Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington, Estados Unidos de América
[2] Howard Hughes Medical Institute, la División de Ciencias Básicas, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington, Estados Unidos de América
Resumen

Heterocromatina comprende un componente importante de muchos genomas eucarióticos. En comparación con euchromatin, es heterocromatina gen pobres, ricos transposón, y fines de replicar. Sirve muchas funciones biológicas importantes, de silenciamiento génico exacta a la segregación cromosómica, aún se sabe poco sobre las limitaciones que dan forma evolutiva heterocromatina. Un enfoque complementario a los tradicionales de una de heterochromatic directamente el estudio de la secuencia del ADN es el estudio de la evolución de las proteínas que unen y definen heterocromatina. Uno de los mejores marcadores de la heterocromatina es la heterocromatina proteína 1 (HP1), que es un elemento esencial, nonhistone proteínas cromosómicas. En este sentido, investigar la evolución molecular de cinco HP1 paralogs presentes en Drosophila melanogaster. Tres de ellos han paralogs ubicuo patrones de expresión en tejidos de adultos Drosophila, mientras que HP1D/rhino y HP1E se expresan principalmente en testículos y ovarios respectivamente. El HP1 paralogs también tienen distintas preferencias de localización en células Drosophila. Así, Rhino se localizan a la Drosophila heterochromatic compartimiento en el cultivo de tejidos de células, pero en un patrón distinto de HP1A y lisina-9 dimethylated H3. Uso de evolución molecular y los análisis genéticos de población, nos encontramos con que rinoceronte ha sido objeto de selección positiva en los tres dominios de la proteína: la N-terminal de cromosomas de dominio, el C-terminal de cromosomas sombra de dominio, y la región de la bisagra que conecta a estos dos Módulos. Máxima verosimilitud análisis de las secuencias de rinoceronte de 20 especies de Drosophila revela que una pequeña cantidad de residuos de cromo y la sombra dominios han sido objeto de repetidos positivos selección. La rápida y positiva selección de rinoceronte es muy raro que un gen que codifica la proteína cromosómico rinoceronte y sugiere que se vean implicados en un conflicto genético que afecta a la línea germinal, belying heterocromatina la idea de que no es más que un receptor pasivo de "ADN basura" en los genomas eucariotas .

Introducción

Las secuencias de ADN repetitivas pueden constituir gran parte de muchos genomas (aproximadamente el 30% de los genomas humanos y la mosca) y participan en los procesos celulares fundamentales [1 - 3]. Por ejemplo, centromeres en eucariotas superiores consisten en general, las regiones repetitivas necesarias para una adecuada segregación de cromosomas durante la división celular cada [4]. Heterocromatina flancos y los centrómeros es también esencial para la segregación [5 - 7]. Se compone en gran medida de ADN repetitivas y trasladables elementos y sus reliquias, pero pueden contener genes importantes para la fertilidad y viabilidad [8, 9]. Transcriptionally silencio heterocromatina puede influir en la expresión no sólo de elementos móviles integrados en la heterocromatina, pero también euchromatic genes [6, 10 - 12]. Dada la importancia de la heterocromatina, no es de extrañar que heterochromatic perturbación de proteínas se asocia con el cáncer y otras enfermedades [13, 14].

El estudio de ADN repetitivo heterochromatic se queda muy atrás que euchromatic regiones de heterocromatina, porque es difícil de manipular experimentalmente y secuencia. Incluso cuando se dispone de la secuencia del ADN, las fuerzas evolutivas que determinan patrones de secuencias repetitivas en rápida evolución cromosómica y la arquitectura son difíciles de discernir. Un enfoque complementario es el estudio de la evolución de los componentes de las proteínas que se asocian con repetitivas de ADN en lugar de estudiar directamente el ADN. Estos componentes de las proteínas han sido bien estudiados, especialmente en Drosophila genomas [15 - 18]. El uso de una estrategia similar, el descubrimiento de selección positiva que actúan en las proteínas que unen a centroméricas de ADN ha llevado a la unidad de centrómeros hipótesis de que puede dar cuenta de la complejidad de la secuencia centromeres [19 - 21].

Aquí, examinamos las presiones evolutivas que determinan las proteínas que unen a heterochromatic ADN. Heterocromatina proteína 1 (HP1) es un componente ubicuo de la heterocromatina que es el mejor sustituto disponible para estudiar la heterocromatina complejidad. HP1 se identificó por primera vez en las moscas [18, 22], y está presente en la mayoría de eucariotas en el que se requiere para el mantenimiento de la mayoría de los aspectos de la heterochromatic estado [6, 10, 11, 23]. HP1 consta de una N-terminal de cromosomas de dominio, una bisagra región, y un C-terminal de cromosomas sombra (o simplemente "en la sombra") de dominio que se asemeja estructuralmente los cromosomas de dominio y media homodimerization [16, 22, 24 - 26]. El dominio de cromosomas se une a las histonas metiladas H3 colas de lisina en 9 (H3K9me), una modificación covalente asociados con el mantenimiento y la heterocromatina silenciamiento transcripcional [10, 11, 27, 28] y puede influir directamente en la orientación de HP1 in vivo [29].

HP1-al igual que múltiples genes, que pueden tener diferentes funciones, se pueden encontrar en el mismo genoma. En los vertebrados, por ejemplo, hay al menos tres HP1-como genes (HP1 α, β HP1, HP1 y γ) que cada codifican proteínas con distintas pautas de localización, a pesar de ser de alrededor de 65% idénticos [22, 30 - 33]. Drosophila melanogaster contiene cinco Genes con HP1-como dominio de la organización. Se realizó un estudio molecular evolutiva de estos HP1 paralogs en Drosophila, con el fin de utilizarlos como un sustituto para el estudio de ADN heterochromatic evolución. HP1A (o Su [Var] 205) fue el primero de estos se puedan identificar. HP1A Este gen codifica la proteína prototypic HP1 heterocromatina necesarios para el mantenimiento [18, 34]. Las funciones de los otros cuatro HP1 proteínas son desconocidos. Sin embargo, HP1B y HP1C difieren de HP1A en su localización cromatina [35], lo que sugiere que su función no es redundante con HP1A. El cuarto HP1-como proteínas, HP1D/Rhino (en lo sucesivo denominado "Rhino"), fue descubierto en una pantalla para las mujeres estériles mutantes [36] que hemos identificado el quinto, HP1E, utilizando criterios bioinformáticas en el estudio.

Rinoceronte mutantes mostrar una variedad de la fase tardía de defectos de la cáscara del huevo, entre ellos los apéndices dorsales fusionados para los que el gen fue nombrado [36]. Una cuidadosa caracterización de mutantes de huevo cámaras revelado varios defectos [36]. En primer lugar, la enfermera células no se someten a un orden superior estructura de la cromatina de reorganización de una "gota de cinco" estado a un estado dispersas en la etapa 5. En segundo lugar, si bien los niveles de transcripción de varios genes del patrón no se vieron afectados, las transcripciones de los principales genes del patrón como gurken y oskar se mislocalized. Además, la síntesis de proteínas Gurken se retrasó a principios de huevo y germaria cámaras, y Gurken acumulación de proteínas aberrantes mostraron más tarde en las cámaras de huevos [36]. A diferencia de otras proteínas de HP1, Rhino se expresa predominantemente durante oogenesis [36]. Su inusual patrón de expresión sugiere que la evolución de las limitaciones de rinoceronte podría reflejar con más exactitud las presiones sobre la heterocromatina en la línea germinal femenina, relativamente libre de las limitaciones impuestas durante expresión somática.

En este informe se muestra que la etiqueta Rhino proteínas se localizan a distintos focos heterochromatic dominio en el cultivo de tejidos de las células. Sorprendentemente, encontramos que los tres dominios de Rhino muestran una fuerte evidencia de la selección recurrente positivo. Dicha selección positiva implica que rinoceronte está involucrada en un genéticos hereditarios y recurrente conflicto, el aumento de la intrigante posibilidad de que la heterocromatina sí podría representar un registro paleontológico de este conflicto genéticos.

Resultados
HP1 Paralogs en Drosophila genomas

D. melanogaster contiene cinco HP1-como los genes, que se define como tal porque todos codifican un N-terminal de cromo y un dominio C-terminal de sombra de dominio (Figura 1 A). Cuatro de estos paralogs se han identificado en los análisis anteriores [36, 37], mientras que se HP1E recientemente identificados en el presente informe. Estos paralogs muestran diferencias en su conservación a través de las especies de Drosophila. HP1A, HP1B, y HP1C son altamente conservados, incluso entre D. Melanogaster y el más alejadas D. Pseudoobscura (Figura 1 A). En cambio, los rinocerontes difiere significativamente en el tamaño y la secuencia de aminoácidos entre D. Y D. melanogaster Simulans. Además, el gen HP1E parece haber degenerado en el D. Pseudoobscura genoma, mientras que D. Pseudoobscura posee HP1F, una novela que la HP1 D. Melanogaster genoma carece por completo.

Entre los HP1 paralogs, la HP1D/rhino gen parece ser particularmente rápida evolución. En los análisis filogenéticos, tanto el rinoceronte cromo y sombra dominios parecen haber evolucionado mucho más rápidamente (Figura 1 B-C) que sus homólogos de otros HP1s en Drosophila (rama comparar longitudes entre D. melanogaster, D. erecta, y D. pseudoobscura Orthologs, que tienen sucursales en negrita). HP1E también parece evolucionar rápidamente en los cromosomas de su dominio, pero no se conserva en D. Pseudoobscura. Por lo tanto, parece rinoceronte única entre el HP1-al igual que en los genes está bien conservada todavía evolucionando rápidamente. Porque rinoceronte está evolucionando tan rápidamente, orthologs no son susceptibles de ser identificado sin ambigüedad en otros organismos.

¿Predominantemente rinoceronte Expresado en Ovarios

Anterior blot del Norte ha detectado un 1,6 kb mRNA rinoceronte hembra en las moscas, los primeros embriones, y de ovario, pero no en los hombres y las moscas mutantes rinoceronte [36]. In situ análisis mostró que el rinoceronte transcripción estuvo presente tanto en las células somáticas y germinales de ovario [36]. Sin embargo, una abundante y mucho más grande banda en el norte de la mancha no mostraron el mismo patrón de expresión restringida. Esta banda también se hizo presente en el RNA de rhi 2 moscas mutantes que sugiere que no contenía rinoceronte transcripción. Con el fin de delinear el patrón de expresión de este gen inusual HP1, hemos utilizado RT-PCR para determinar la presencia de mRNA en rinocerontes machos o hembras moscas y en diferentes tejidos, ya que proporciona un ensayo más sensible que complementa el análisis anterior del Norte ( Figura 2].

Se confirmó la expresión predominante de rinocerontes en D. Melanogaster ovarios, aunque los bajos niveles de transcripción también podría ser detectada en los testículos, la cabeza, y ligeramente en la canal, probablemente por debajo de los límites de detección para el análisis del Norte (Figura 2 A). Endógena rinoceronte transcripción también estuvo presente en el cultivo de tejidos S2 células que se utilizaron para nuestros estudios de localización. Además, la falta de una transcripción de rinoceronte rhi 2 moscas mutantes por RT-PCR confirma que la gran cruz de reacción banda visto en el análisis anterior del Norte [36] no contiene rinoceronte transcripción. Hemos ampliado este resultado para demostrar que la expresión predominante de rinoceronte se limita a los ovarios en otro alejadas especies, D. Bipectinata (Figura 2 B). En contraste, se encontró que HP1A,-B, y C-genes fueron abundantemente expresado en todos los tejidos adultos bruto que hemos examinado (Figura 2 C). Curiosamente, HP1E mostró un patrón de expresión restringido fundamentalmente a los varones testículo, lo que sugiere que dos de los cinco HP1 paralogs en D. Melanogaster son cada dedicada predominantemente a los testículos y ovarios respectivamente. Esto puede resaltar el hecho de que la estructura de la cromatina es probable que sea intrínsecamente diferentes en células somáticas versus germinal, que haya suscitado esta especialización.

Rhino localización en D. Células melanogaster

La localización de la proteína HP1 productos de los tres genes se han probado hasta ahora en el cultivo de tejidos de células Drosophila. Sólo se encontró HP1A para localizar predominantemente a la heterocromatina, mientras que HP1C localizado a euchromatin y HP1B a ambos euchromatin y heterocromatina [35]. Por lo tanto, decidimos primer estudio el patrón de localización de Rhino para determinar si localizado en la heterocromatina. Drosophila S2 interfase células tienen una densa tinción DAPI-área que ayuda a demarcar los límites de la heterocromatina citológico, aunque cabe señalar que no mancha DAPI todos Heterochromatic ADN, debido a que dependen de la secuencia de ADN preferencia de encuadernación [38]. H3K4me citológico es un excelente marcador para euchromatin, mientras que las marcas de heterocromatina H3K9me [10, 11]. Los patrones de localización de la proteína verde fluorescente (GFP) fusionados a HP1A, HP1B, o HP1C y expresada en el cultivo de tejidos células fueron previamente demostrado ser fieles representaciones de la localización de las proteínas endógenas por tinción de anticuerpos [35]. Por lo tanto, expresó rinoceronte como un C-terminal de la proteína de fusión GFP en células Drosophila S2, seguido por inmunomarcación con anticuerpos frente a HP1A, HP1B, HP1C, específicas o modificaciones de las histonas H3 (Figura 3] para la comparación de los patrones de localización.

El patrón de localización de Rhino-GFP difiere de la de HP1A,-B, y C-interfase en células de cultivo de tejidos (Figura 3 y Figura S1]. Rhino-GFP formado distintos focos que ocupa un área limitada en el núcleo. Rhino-GFP Estos focos se localizaron en el compartimento heterochromatic tal como se define por la ausencia de manchas H3K4me. Sorprendentemente, Rhino-GFP también directamente no se superponen con los marcadores comunes de la heterocromatina, HP1A o H3K9me, y no aparecen intercalados con, o en torno a estas señales. Así, a diferencia de HP1A, esperamos que el Rhino cromosomas de dominio no se une H3K9me. El Rhino-GFP localización patrón no era un artefacto de GFP el etiquetado, ya que también se observó con una proteína que se Rhino N-terminal marcados con biotina con un péptido (Figura S1]. Llegamos a la conclusión de que entre HP1 paralogs, Rhino-GFP tiene un único patrón de localización dentro de la heterochromatic dominio en el cultivo de tejidos de células. Su localización en el patrón de ovocitos es actualmente desconocido.

Evolución Molecular de rinoceronte: Selección positivos de la Bisagra y Chromo Shadow Dominios

La indicación de que puede ser un rinoceronte en rápida evolución, HP1 (ver Figura 1], su expresión predominante en los ovarios (ver Figura 2], y su patrón de localización interesante citológico (Figura 3], nos llevó a investigar su historia evolutiva con más detalle. Sacar a la luz evolutivo limitaciones con que evolucionan los genes diferentes HP1 pueden proporcionar una idea de las fuerzas evolutivas que determinan la heterocromatina. Para estudiar la evolución molecular de las proteínas en Drosophila HP1, secuencia de ADN obtenido de HP1 orthologs estrechamente relacionados en el D. Simulans especies (D. melanogaster divergen de unos 2,5 millones de años) por PCR.

La rápida evolución de HP1s HP1s puede atribuirse a la limitación relajado, que permite la acumulación de secuencia de los cambios, sobre todo si son diferentes de genes funcionalmente copias redundantes. Por otra parte, la sustitución de aminoácidos cambios pueden conferir una ventaja selectiva, en cuyo caso se espera que se acumulan a un ritmo superior a lo previsto en virtud de la evolución neutral (selección positiva). Para evaluar si alguno de los HP1s son sometidos a esta positiva entre la selección estrechamente relacionados D. Y D. melanogaster Simulans especies, se les practicó un deslizamiento de 100 bp ventana de análisis de la serie de cambios sustitución por sitio (dN), en comparación con el número de cambios por sinónimo sitio (dS) (Figura 4]. HP1B, HP1C y HP1E había dN <dS En todas las ventanas, de conformidad con la purificación de la selección, como era de esperarse para la evolución de proteínas estructurales bajo estrictas limitaciones. Para nuestra sorpresa, encontramos dN> dS durante varias ventanas en el rinoceronte gen correspondiente a la región dependen de la proteína codificada (Figura 4 E). Se utilizó simulaciones de Monte Carlo en el programa K-estimador para demostrar que tres de esas ventanas fueron estadísticamente significativas (dN> dS, p <0,02, se indica con un asterisco), en consonancia con la positiva selección de rinoceronte entre D. Y D. melanogaster Simulans. También se encontró con dos ventanas dN> dS de la HP1A codificada bisagra frontera con significación (p-valor de aproximadamente 0,05), pero además incluye un análisis detallado de la población de estudio D. Y D. melanogaster Simulans, y dN / dS comparaciones entre varios otros pares de especies estrechamente relacionadas Drosophila (D. Vermaak, HS Malik, datos no publicados) llevó a la conclusión de que no era positiva selección de HP1A. Por lo tanto, ninguna otra que no sea HP1 homólogo rinoceronte mostró ninguna prueba de selección positiva, lo que sugiere que es de nuevo HP1D/rhino única en este sentido, no sólo entre Drosophila HP1 paralogs, sino también entre todos los HP1 genes identificados hasta el momento.

Ventana deslizante dN / dS análisis sugieren que el rinoceronte está sujeto a la selección positiva. Realizar un seguimiento de esta observación inicial, se llevó a cabo un estudio más detallado en el D. Y D. melanogaster Simulans. Se utilizó PCR para obtener rinoceronte secuencia de 17 cepas de D. Melanogaster y 11 cepas de D. Simulans. Cambios en la secuencia del ADN se catalogaron como de reemplazo (R) o sinónimos (S) (Tabla S1]. Los cambios fueron más bien clasificarse como fijos entre las especies (f) o polimórficos dentro de las especies (p) (Tabla S1]. Bajo un modelo de evolución neutral, la relación de sustitución sinónimo de cambios que se han fijado entre las especies (Rf: Sf) se espera que sea aproximadamente la misma que la proporción de cambios polimórficos (Rp: Sp) (McDonald-Kreitman prueba) [39 ]. No hemos encontrado una importante desviación de la neutralidad cuando todo el rinoceronte secuencia fue considerado (Cuadro 1, la codificación de toda la región, p = 0.13). Sin embargo, una ventana deslizante análisis muestra claramente que la sustitución fijo observado cambios mucho mayores que las de los previstos en virtud de la evolución neutral en la parte C terminal de la proteína (Figura 5]. En efecto, la sombra tiene un dominio muy importante desviación de la neutralidad (p <0,01), lo que sugiere que este ámbito ha sido objeto de fuerte positiva de selección (Cuadro 1, sombra). Se utilizó parsimonia para cada secuencia de ADN, los cambios dentro de la sombra de dominio, ya sea a la simulans melanogaster o linaje por polarizar a los cambios afuera especies D. Teissieri y D. Yakuba (Tabla S1, cambios en el linaje melanogaster [m] o linaje simulans [s]). Llegamos a la conclusión de que la sombra de dominio ha sido objeto de selección positiva en el D. Simulans linaje (Cuadro 1, sólo sombra D. simulans, p <0,05), pero no hay suficientes polimorfismos de llegar a una conclusión similar para el D. Melanogaster linaje a pesar de una fuerte Rf: Sf ratio. A pesar de que la completa bisagra solos no rechaza la neutralidad, la bisagra que separa el largo dominio en la N-y C-terminal de los segmentos sugiere que la región C-terminal de la bisagra, la sombra de dominio de terrenos colindantes, ha sido objeto de selección positiva (p <0,01 ). No hemos podido determinar si la selección positiva en la bisagra se linaje específico debido a la ambigüedad en la alineación con el grupo afuera especies. A pesar de esta fuerte señal positiva para la selección, no hemos podido detectar indicios de los últimos adaptable "sweeps" utilizando Fu y Li [40] o [41] Tajima pruebas, lo que sugiere que cualquiera de esas redadas no fueron lo suficientemente reciente para dar lugar a polimorfismos de pie solo. Así, tanto la bisagra y la sombra dominios de la proteína codificada por rinoceronte muestran una fuerte evidencia de relativamente viejos episodios de selección positiva entre el D. Y D. melanogaster Simulans linajes.

Evolución rinoceronte en Drosophila Otras especies

¿Es positiva la selección de rinoceronte limitado a la especie melanogaster grupo? Para abordar esta cuestión, identificó D. Pseudoobscura rinoceronte por synteny con D. Melanogaster; rinoceronte está contenida dentro de un intrón de otro gen en ambas especies. Se utilizó RT-PCR para confirmar la predicción de sitios de empalme rinoceronte de la oscura grupo de especies. D. Pseudoobscura rinoceronte es muy diferente de longitud (317 vs 418 aminoácidos codificados) y la secuencia de D. Melanogaster rinocerontes (véase la figura 1]. De hecho, la bisagra de la región Rhino proteína está cambiando tan rápidamente que es irreconocible en una comparación entre BLAST D. Y D. melanogaster Pseudoobscura (e-valor> 1.000). Para rastrear la evolución de rinoceronte melanogaster más allá de los grupos de especies, se obtuvieron rinoceronte secuencia de intervenir entre las especies D. Y D. melanogaster Pseudoobscura. A pesar de la distancia evolutiva de D. De D. melanogaster Pseudoobscura, no podríamos identificar secuencias conservadas tanto aguas arriba como aguas abajo de los rinocerontes de genes, lo que nos permite diseñar cebadores para la amplificación de rinoceronte de 12 especies adicionales de Drosophila, que se muestra esquemáticamente en la Figura 6 A.

Nos parece que rinoceronte está evolucionando a un ritmo sin precedentes para un HP1. Bisagra Las regiones no pueden ser alineados sin ambigüedades entre los diferentes grupos de especies o en algunos casos ni siquiera dentro de un mismo grupo de especies. No hemos detectar cualquier similitud significativa de la Rhino bisagra regiones a otras proteínas o motivos, pero todos dependen de la secuencia de las regiones comparten ciertas características, notablemente más largo va de serines así como de prolina y glutamina ricos en secuencias (Figura 6 A). En algunos casos, hemos encontrado pruebas claras de selección positiva (dN / dS> 1) para alignable sectores de la bisagra de las regiones pares estrechamente relacionados, D. Yakuba versus D. Teissieri, D. Erecta versus D. Orena, D. Lutescens versus D prostipennis, D. Bipectinata versus D. Parabipectinata, y D. Pseudoobscura versus D. Miranda (ejemplos representativos se muestra en la Figura 6 B). Nuestra capacidad para detectar casos de dN / dS> 1 dentro de la región dependen de múltiples pares de especies dentro de una pequeña muestra de especies de Drosophila sugiere que la selección positiva de la bisagra es un rasgo común de rinoceronte evolución.

Selección positiva de rinoceronte Chromo Dominio

Análisis filogenéticos (ver Figura 1 By 1 C) sugiere que no sólo la bisagra región, sino también a los cromosomas y la sombra de dominios Rhino son divergentes más rápidamente que otras de similar dominios HP1s. Para la bisagra y la sombra dominios, que ya hemos presentado pruebas de que esta rápida evolución no se debe a falta de limitación selectiva, sino más bien debido a la selección positiva. Sin embargo, no hemos podido detectar dentro de la selección positiva cromosomas dominio utilizando dN / dS McDonald-Kreitman o ensayos, ni tampoco se lo puede detectar indicios de una adaptación de barrido usando pruebas estándar (Fu y Li [40], Hudson-Kreitman - Aguade [42], Tajima's D [41]]. Estamos motivados de que puede ser difícil de detectar positivos selección de los cromosomas de dominio debido a que la mayoría de los codones son susceptibles de ser funcionalmente limitados y, por tanto, en virtud de la selección purificadora. Sin embargo, esa selección se puede purificar el enmascaramiento positivo selección de un pequeño número de codones dentro de los cromosomas de dominio. Por ello, utilizó un codón por codón prueba de máxima verosimilitud, PAML [43], para preguntar si se podría detectar cualquier codones que han sido objeto de repetidos, la fuerte selección positiva.

Se utilizó una secuencia de ADN de alineación de los rinocerontes de genes correspondientes a los cromosomas codificados dominio de diferentes especies de Drosophila. La correspondiente secuencia de aminoácidos de alineación se muestra en la Figura 7 A. Tomamos nota de que un árbol sobre la base de este aminoácido alineación está de acuerdo con la filogenia Drosophila aceptada [44], lo que sugiere que estamos considerando estricto orthologs. Sorprendentemente, los modelos que permiten a los codones de evolucionar bajo la selección positiva (M8 y M2) se ajustaba a los datos asociados significativamente mejor que los modelos que no permiten la selección positiva (M1 y M7) (p <0,001 en todos los casos, el cuadro 2]. A pocos codones cuenta para esta selección positiva. En particular, tres codones reiteradamente muestran muy significativa posterior probabilidades (1E, 9L, y 25S en el Cuadro 2; flechas Figura 7 A). El Rhino cromo estructura de dominio es probable que sea similar a la de los cromosomas conocidos HP1 dominios, por lo que muestran las probables posiciones de los tres aminoácidos adaptativamente evolución de los cromosomas Rhino dominio sobre la conocida estructura de los cromosomas de Drosophila HP1A dominio obligado a H3K9me péptido ( Figura 7 A; [45]]. Posición 1 está cerca de la ranura que se une el péptido metiladas, lo que sugiere que este aminoácido puede ser impulsada a adaptarse a un constante cambio de sustrato Rhino. No podemos descartar que las posiciones 9 y 25 también puede adaptarse a un sustrato obligatorio en la misma posición, ya que podrían influir en la conformación general y, por tanto, vinculante especificidad de los cromosomas de dominio. Sin embargo, las posiciones 9 y 25 se espera que se solvente el acceso en el lado opuesto de la Rhino cromosomas de dominio y puede representar una adicional, potencialmente novela, la interacción superficie.

Ya hemos demostrado que la sombra de dominio está bajo la selección positiva fuerte entre D. Y D. melanogaster Simulans. Para saber si algunos codones de la sombra de dominio han sido también positiva continua en virtud de la selección, realizamos un análisis PAML. Un árbol basado en la sombra de dominio de aminoácidos alineación también recapitula la filogenia Drosophila (Figura 7 B). Hemos encontrado evidencia significativa positiva para la selección, con la mayoría de las señales procedentes de tres codones (Cuadro 2; Posiciones S31, I33, I59 y en la Figura 7 B). En cuanto a la estructura de un ratón HP1 β sombra dímero de dominio [46], las posiciones 31 y 33 están en el mismo lado de la sombra dímero y debería estar disponible para las interacciones proteína-proteína. Los vertebrados HP1 cromosomas sombra dominio dimerización sitio se sabe que se unen a las proteínas a través de sus muchas PxVxL motivo [47 - 49]. No está claro si estas interacciones se conservan en Rhino, pero la rápida evolución en esta región (incluyendo posición 59 identificado en nuestro análisis PAML) ciertamente tiene el potencial de influir fácilmente las interacciones proteína-proteína.

PAML análisis como éstas son muy útiles para poner de relieve los codones que han sido repetidamente objeto de selección positiva [43, 50], pero lo hacen corren el riesgo de falsos positivos. Esto es algo mejorado en nuestra base de datos porque el árbol longitudes son de valor moderado (Tabla 2]. Árbol de longitudes similares han demostrado que las simulaciones para tener un riesgo significativamente menor de falsos positivos [51]. No obstante, la verdadera prueba de la importancia de estos residuos seleccionados positivamente provendrán de las pruebas funcionales sobre Rhino función y localización.

Discusión

En este trabajo, hemos realizado un estudio evolutivo de HP1-al igual que las proteínas, con el objetivo final de que discierne la presiones selectivas que actúan sobre la heterocromatina. Hemos encontrado que Rhino, el único HP1 paralog que se expresa principalmente en los ovarios, codifica una proteína que tiene un único patrón de localización en células S2. A pesar de que se excluye de la euchromatic compartimiento, el Rhino proteína no se superponga con HP1A o H3K9me. Esto sugiere que inmediatamente H3K9me o HP1A no marca todos Drosophila heterocromatina, y que tiene una forma única de Rhino diferentes especificidad para un compartimento unappreciated previamente en la heterocromatina.

No ha sido fácil discernir la función molecular de rinoceronte de fenotipos mutantes defectos en la cáscara del huevo. Las posibilidades van desde un papel de la cromatina en los ingresos brutos Rhino cambios estructurales, a la regulación transcripcional y traduccional o incluso microtúbulos organización en el ovocito [36]. A pesar de nuestra actual falta de conocimientos sobre la función molecular de rinoceronte, el hecho de que las mutaciones son mujeres estériles, punto a su importancia para el buen oogenesis [36]. HP1A, que es mucho mejor entendida, es un elemento esencial de genes. Esas proteínas cromosómicas que actúa crucial funciones se espera que se firme en virtud de las limitaciones y purificar evolutivo de selección. Aunque esto es cierto para cuatro de los cinco D. Melanogaster HP1s incluidos HP1A (vea la Figura 4], nos encontramos con que los tres dominios de rinocerontes han evolucionado bajo la selección positiva utilizando varios criterios, entre ellos dN / dS ratios, McDonald-Kreitman, PAML y análisis [39, 43]. ¿Cuál podría ser este positivo selección de conducción de tan importante proteína HP1?

Pueden co-evolutivo explicar las presiones de selección positiva que actúa en rinocerontes? Por ejemplo, el rinoceronte podría ser continuamente "alcanzar" a mutaciones en las proteínas que interactúan necesarios para su función. Creemos que esto es poco probable, debido a que las mutaciones en peligro un requerida interacción probablemente serán sacrificados fuera de la población por selección purificadora, mucho antes de la posibilidad de compensación mutación puede ocurrir en rinocerontes. Una segunda posibilidad es que la selección positiva de rinoceronte puede ser impulsada por los cambios en la regulación de genes clave entre dos especies. Aunque formalmente no podemos descartar tal escenario, parece poco probable para explicar la relativamente constante de selección positiva que hemos visto por aproximadamente 25 millones de años de evolución Drosophila.

Positivos de selección no tiene por qué implicar rinoceronte 's "normales" de la función, cualquiera que sea, sino más bien la base de un segundo y no vinculado "defensa" función de rinoceronte. En este escenario la selección positiva sobre rinoceronte sería manejado por un conflicto recurrente intracelular que produce una ventaja a la selección "ganador." Genes de codificación de proteínas que participan en directa interacción huésped-parásito están sometidos con frecuencia a la selección positiva. En este caso, los cambios que son beneficiosos para el parásito (para eludir las interacciones por ejemplo) será seguida de la selección a favor de los cambios en las proteínas de acogida (que restablecer las interacciones). Así, dos entidades antagónicas encerrados en genética frente a los conflictos positivos repetidos episodios de la selección, sólo para llegar a la misma cuasi-estado de equilibrio, un escenario formalizado como la "Reina Roja" hipótesis [52]. Rinoceronte pueden estar sujetos a la misma clase de Genéticos conflicto que se produce intracelularmente. Es especialmente intrigante que la única HP1 hemos encontrado a ser objeto de selección positiva se expresa principalmente en los ovarios ([36] y Figura 2], en caso de que tal ventaja competitiva tiene consecuencias directamente hereditarios. Consideramos dos modelos genéticos de los conflictos de explicar rinoceronte 's positivos selección.

Bajo el primer modelo, rinocerontes participa en la represión de "egoísta" la conducta de centromeres, que puede competir al máximo sus ventajas en la transmisión de la meiosis femenina, en la que sólo uno de los cuatro productos meióticas está destinada a convertirse en el huevo [21]. Hemos propuesto anteriormente que este tipo de unidad puede tener consecuencias para la meiosis masculina y es probable que sea reprimida, ya sea por alteración de las proteínas centroméricas su ADN vinculante especificidad [19, 20] o por heterocromatina evolución de las proteínas para limitar centrómeros fronteras, y, con ello, limitar "Fuerza" [4, 21, 53]. Presiones selectivas similares se han propuesto anteriormente para dar lugar a mutaciones deletéreas en el guiño chromokinesin en D. Melanogaster [54]. Rinoceronte puede representar otro represor de la unidad de manera directa o indirecta influyen en centrómeros fuerza.

Un segundo modelo es positivo que la selección de rinoceronte es un resultado directo de un conflicto genético entre rinoceronte y elementos genéticos móviles. Aunque no tenemos ninguna prueba en apoyo de esta hipótesis, es atractiva por varias razones. Trasladables elementos pueden evolucionar rápidamente y difieren significativamente entre especies de Drosophila, incluidos D. Y D. melanogaster Simulans [55, 56]. Rhino-GFP heterochromatic localiza a la región del núcleo (véase la figura 3], que es altamente enriquecido en elementos trasladables [57]. Por último, el genoma determinado elementos trasladables sólo puede aumentar su número de copias por genómica en la transposición de la línea germinal, el aumento de la presión selectiva sobre la acogida proteínas que actúan como supresores de transposición germinal. Rhino puede interactuar con el mecanismo de integración de transposones directo a su integración en silencio transcriptionally heterocromatina, o puede obligar directamente y reprimir transcriptionally trasladables elementos que son de reciente introducción en la heterocromatina. Algunos elementos trasladables se sabe son los principales objetivos de in vivo HP1A, al parecer, la participación de RNAi (RNA de interferencia) vía [1, 11, 58 - 62]. Del mismo modo, puede ser rinocerontes bajo continuo de selección se unen directamente a los elementos trasladables.

Sea cual está impulsando la positiva selección de los rinocerontes, las mutaciones en cualquiera de los tres dominios Rhino parecen ser seleccionado para dar rinoceronte en la parte superior de la actual ronda de la competencia. El cromo y dominios relacionados con la sombra son muy versátil interacción dominios que pueden influir en unión a ADN, el ARN, y proteínas [63]. La bisagra de dominio también puede influir mucho la localización de HP1-como las proteínas [64, 65]. Los futuros experimentos se ocupará de la función de los tres aminoácidos en virtud recurrentes positivos en la selección de cromosomas y la sombra dominios (Figura 7], y ayudar a distinguir entre nuestros modelos de lo que es el motor de la positiva selección de los rinocerontes. Estos experimentos promesa de revelar información detallada sobre la organización de una parte importante de los genomas de Drosophila. Probablemente no es una coincidencia que hemos encontrado selección positiva sólo en un HP1-miembro de la familia que se expresa principalmente en los ovarios. De hecho, un patrón de expresión restringido pueden haber permitido la detección de un conflicto que previamente unremarked formas, al menos, una fracción de Drosophila heterocromatina, a través de la positiva selección de los rinocerontes. Esta señal puede haber sido enmascarado por otros HP1s debido a sus limitadas funciones en otros tejidos.

Nuestros resultados complementan resultados anteriores que otras proteínas que unen a la heterocromatina parecen estar entre las más rápida evolución de las proteínas en una pantalla imparcial en Drosophila [67 - 68], aunque esto no parece ser el resultado de la selección positiva [69]. Polimorfismos en la heterocromatina vinculante de las proteínas puede tener efectos directos sobre la no-disyunción frecuencias [54, 70, 71]. Del mismo modo, aunque HP1A,-B, y C-parecen ser conservados en virtud de la purificación y la evolución de la selección, HP1 evolución (tanto en secuencia y el número de copias de genes; véase la figura 1], en general, parece bastante rápido para una proteína cromosómicas con una función muy conservadas En la mayoría de eucariotas. Así, los rápidos cambios en el paisaje genómico puede ser la base de una rápida diversificación de los genes que codifican las proteínas cromosómicas y HP1s en general.

Materiales y Métodos
Apoyo a la Información
Rhino-Localización de las buenas prácticas agrarias en
Estas imágenes adicionales de Rhino-GFP muestran un patrón de localización que es distinto de HP1A, H3K4me, y H3K9me. Además, el N-terminal de la etiqueta Rhino biotina-proteína muestra el mismo patrón de localización que la de la C-terminal de la etiqueta Rhino-GFP proteína.
Una ventana deslizante dN / dS Análisis
Sólo aquellos que se encontraron cambios que se han resuelto las diferencias entre
D. melanogaster
Y
D. simulans
Se utilizaron
.
Todos los polimorfismos intraespecíficos fueron eliminados de este análisis. En comparación con
, La señal positiva para la selección aparece ahora concentrado exclusivamente en la región C-terminal de
Rhino
Todos los Polimorfismos dentro de la codificación de las mercancías de la Región
Los cambios se resaltan como está, ya sea en el (f) entre las especies o polimórficos (p) dentro de las especies, como reemplazo (R) o sinónimo (s) de los cambios. Fijo cambios fueron polarizada utilizando un grupo afuera especies a los cambios a lo largo de cualquiera de los
D. melanogaster
(M) o
D. simulans
(S) de los linajes. Muchos cambios no pueden ser claramente polarizada.
Lista de Adhesión Primers Usado y Números de Secuencias Obtenidos en el Este de estudios
(36 KB XLS)

Damos las gracias a la Drosophila existencias centro (Tucson, Arizona) para diversas especies de Drosophila y de las existencias Judy O'Brien para la conservación de las poblaciones de Drosophila. Damos las gracias a Kami Ahmad y Celeste Berg útil para los debates a lo largo de este proyecto, y Jiro Yasuhara, Barbara Wakimoto, Sara Sawyer, y Julie Kerns para comentarios sobre el manuscrito. También agradecen Terri Bryson para ayudar con el mantenimiento de las células Drosophila cultivo de tejidos, y Takehito Furuyama para la BLRP y pBirA plásmidos. Este trabajo fue apoyado por un Damon Runyon Cancer beca posdoctoral (DV), de Howard Hughes Medical Institute (SH), de inicio fondos de la Fred Hutchinson Cancer Research Center, y un Premio Académico de la Fundación Sidney Kimmel (HSM). HSM es una Alfred P. Sloan Fellow en Computacional Evolutiva y Biología Molecular.