PLoS Genetics, 2005; 1(1): (más artículos en esta revista)

Nueva Genes Atado a endocrinos, metabólicos, la dieta y el Reglamento de la Duración de un Caenorhabditis elegans Genómica RNAi Pantalla

Malene Hansen, Ao-Lin Hsu [¤ a], Andrew Dillin [¤ b], Cynthia Kenyon [*]
Resumen

La mayor parte de nuestro conocimiento acerca de la regulación del envejecimiento proviene de mutantes aisladas originalmente para otros fenotipos. Para preguntar si nuestra opinión actual de envejecimiento se ha visto afectada por el sesgo de selección, y para profundizar nuestra comprensión de las vías conocidas longevidad, una selección genómica Caenorhabditis elegans RNAi biblioteca de clones que se extienden de vida. Se identificaron 23 nuevos genes que afectan a la longevidad de transducción de señales, la Respuesta de estrés, la expresión de genes, y el metabolismo y se les asignará a estos genes específicos de las vías de la longevidad. Nuestros hallazgos más importantes son (i) que la dieta de restricción se extiende C. Elegans' de vida por abajo de la regulación de expresión de genes clave, incluyendo un gen necesario para la metilación de muchas macromoléculas, (ii) que la señalización de integrina es probable que desempeñar un general, conservado evolutivamente vida útil papel en la regulación, y (iii) que las hormonas específicas lipofílica Puede influir en la vida en un DAF-16/FOXO-dependent moda. Sorprendentemente, de los nuevos genes que se han conservado secuencia de los dominios, sólo uno no puede estar asociado a una conocida vía de la longevidad. Por lo tanto, nuestra opinión actual de la genética del envejecimiento, probablemente, no ha sido sustancialmente distorsionados por el sesgo de selección.

Introducción

Una serie de mutaciones y de las condiciones ambientales puede ampliar el ciclo de vida de Caenorhabditis elegans. Aunque los mecanismos subyacentes no se comprenden totalmente, estas perturbaciones parecen afectar, al menos, tres sistemas de regulación. El primero es el sistema de insulin/IGF-1/FOXO [1, 56]. Insulin/IGF-1 inhibición de la señalización puede duplicar la vida útil del animal [54]. Esto requiere de la extensión de vida FOXO factor de transcripción DAF-16 [54], que, a su vez, influye en la expresión de un conjunto diverso de los antioxidantes, metabólicas, chaperón, antimicrobianos, y nuevos genes que actuar de una manera acumulativa para influir en la vida [ 2, 3]. El proceso de autofagia, que se incrementa en estos mutantes de larga vida, también pueden hacer una contribución importante [4]. Además de DAF-16, el calor-shock factor de transcripción HSF-1 [5 - 7], así como AMP kinasa [8] son necesarios para la extensión de la vida útil insulin/IGF-1 vía mutantes. El itinerario insulin/IGF-1/FOXO actos exclusivamente durante la edad adulta para influir en el envejecimiento [9] y parece ser regulada por señales sensoriales [10, 11]. El sistema reproductivo también afecta insulin/IGF-1 señalización [12]. Matanza de la línea germinal de vida aumenta, y este aumento de vida requiere la presencia de la gónada somática [12]. Germinal ablación se piensa extender la vida útil mediante la activación de una hormona esteroide vía y DAF-16/FOXO, la somática y la gónada parece ejercer una influencia en la vida de contrarrestar por los que afectan a la actividad de la vía insulin/IGF-1 [12, 13]. Por último, otros reguladores, como el señor-2 y deacetilasa Junio quinasa, también puede aumentar la vida útil en un daf-16 que dependen de la moda [14 - 17].

Restricción dietética (DR) (es decir, de restricción calórica), que también se extiende la vida útil de C. Elegans. Cómo esto ocurre no está claro. Esta extensión de vida no requiere actividad DAF-16, lo que sugiere que es distinta de la vía de señalización insulin/IGF-1 [18, 19] y el señor-2 histona deacetilasa [14]. Hasta el momento, sólo un gen, el gen biosíntesis de ubiquinona clk-1, ha sido implicado en la respuesta al DR en C. Elegans [18].

En tercer lugar, la inhibición de la respiración mitocondrial o aumento de la síntesis de ATP de vida [20 - 22]. Al igual que la extensión de vida producidos por DR, de prolongación de la vida útil de este daf-16-independiente. Sin embargo, DR extiende la vida útil cuando se inició durante la edad adulta, mientras que la inhibición de la cadena respiratoria-no [21]. Así, estos dos tipos de perturbaciones pueden actuar de diferentes maneras para aumentar la vida útil.

En un esfuerzo adicional para saber si podrían influir en vías de envejecimiento en C. Elegans, y para identificar nuevos genes en las vías conocidas, seleccionadas para una mayor longevidad genómica utilizando un ARN interferencia (RNAi) de bacterias que se alimentan de la biblioteca abarca ~ 87% de la C. Elegans marcos de lectura abierta (un total de 16.757) [23, 24]. En nuestra pantalla, no esperábamos para identificar todos los genes cuyas funciones normales acortar la vida útil. En anteriores de cromosomas I RNAi pantallas, tanto el laboratorio de Ruvkun y nuestro laboratorio identificaron una serie de clones mitocondrial RNAi que el aumento de vida útil, pero hemos encontrado un solo gen en común [21, 22] (leyenda en el Cuadro 1]. Asimismo, el grupo Plasterk encontró un alto nivel de falsos negativos en cada una de sus dos pantallas RNAi [25]. Además, no esperan encontrar funcionalmente redundante genes, los genes con funciones esenciales en otros procesos biológicos, o los genes neuronales (neuronas ya que son refractarias a RNAi [24, 26, 27]]. No obstante, dado que la mayoría de las vías biológicas implican muchos genes, se espera identificar los genes que funcionan en la mayoría o la totalidad de las vías que influyen en la vida.

Resultados y Discusión
RNAi pantalla de clones que aumentan la longevidad

Para identificar los genes de la longevidad, animales cultivados en RNAi bacterias desde el momento de la eclosión y, a continuación, buscó las placas que contienen los individuos viven en un momento en que los controles pareados por edad fueron todos muertos (véase Materiales y Métodos]. Nosotros calculamos que el 70% de los examinados los marcos de lectura abierta de C. Elegans (Figura S1]. De los 94 candidatos clones reanalizada, 29 causó una muy significativa la vida útil de extensión, que van desde ~ 10-90%. (Cinco de estos clones se publicaron anteriormente en cromosomas I / II pantallas [21, 22], Tabla 1]. Estos clones se pusieron a prueba una tercera vez, y encontró a producir extensiones de vida similares (Cuadros 1 y S1].

Sorprendentemente, que se recuperó sólo un gen conocido longevidad, el gen receptor insulin/IGF-1-like daf-2. Para comprender mejor este resultado, probamos el RNAi clones conocidos longevidad de varios genes (Cuadro S2]. De los diez genes conocidos que consideramos, sólo cinco están representadas en nuestra biblioteca RNAi. RNAi para tres clones de estos genes, daf-2, la edad-1, y el acto-1 (pero no clk-1 o glp-1), prorrogó la vida útil significativamente (Tabla S2], lo que indica que hemos mantenido un nivel significativo de falsos negativos En nuestra pantalla. (Falsos negativos pueden surgir por muchas razones, incluido el pequeño tamaño de la muestra en el momento de la puntuación, o la censura a causa de la contaminación o la placa de la producción de progenie; ver Materiales y Métodos. Además, los clones que sólo significa ampliar la vida útil máxima vida útil, pero no se califican como Falsos negativos en nuestra pantalla.) Juntos, estos hallazgos sugieren que, aunque hemos identificado muchos de los nuevos genes de la longevidad en nuestra pantalla, más aún no se han encontrado.

Algunos de los clones RNAi nos había recuperado relativamente pequeños efectos en la vida. Inesperadamente, uno de ellos fue el daf-2 clon biblioteca (figura S2], que en repetidas ocasiones el alargamiento de la vida útil ~ 20% (véanse los cuadros 1 y S1]. Por el contrario, un daf-2 RNAi clon hemos construido utilizando el mismo vector, pero otra daf-2 insertar duplicado de vida (datos no presentados, la figura S2]. De este modo, para daf-2, se podría decir que el RNAi biblioteca contiene una "débil alelo." Igualmente, para los otros genes analizamos, es posible que la longevidad podría ser producido por una mayor reducción de la actividad de los genes.

Los 23 nuevos genes afectados una gran variedad de procesos, incluida la transducción de señales, la expresión de los genes y el metabolismo de los ácidos nucleicos-, la respuesta al estrés, la glucosa y el metabolismo de aminoácidos, la función mitocondrial, y la regulación de tráfico de la vesícula (Cuadro 1]. Hemos asignado los nombres de estos genes sobre la base de nuestro análisis funcional de secuencias de ADN y la información (Tabla 1].

Componentes de la Nueva Insulin/IGF-1 y Reproductiva Senderos

El DAF-16/FOXO factor de transcripción es necesaria para mutaciones en el insulin/IGF-1 vía, la ablación o de línea germinal, para extender la vida útil [1]. Se encontró que siete de los nuevos clones RNAi (ttr-1 / K03H1.6, maoc-1 / E04F6.3, gpi-1 / Y87G2A.8, sinh-1 / Y57A10A.20, ddl-1 / F59E12.10, Ddl-2 / Y48E1B.1, y ddl-3 / Y54G11A.8), así como el daf-2 / Y55D5A.5 clon, no, en múltiples ensayos, para extender la vida útil de daf-16 (mu86) null mutantes (Tabla 2]. Ese fracaso para extender la vida útil podría ser por razones de enfermedad, pero los animales parecían sanos. (Este era el caso de todos los otros animales hemos examinado, a menos que se indique lo contrario.) Por lo tanto, la explicación más simple es que la actividad de daf-16 es concretamente la obligación de extender la vida útil de los animales tratados con estos RNAi clones. En principio, estos "daf-16-dependientes" genes podrían funcionar en el insulin/IGF-1 vía, la vía de la reproducción, las dos vías, o de otros DAF-16 que dependen de las vías.

Nueva insulin/IGF-1 genes en la vía son especialmente interesantes debido a que sus homólogos en los seres humanos podría desempeñar un papel no sólo de la longevidad, sino también en la regulación insulin/IGF-1-related enfermedades metabólicas como la diabetes y el cáncer. Para investigar si los genes identificados por estos clones RNAi podría ser parte de la vía insulin/IGF-1, llevamos a cabo dos experimentos. En primer lugar, si bien no es una prueba concluyente (daf-2, ya no son mutantes null), nos gustaría saber si el RNAi clones podrían no ser capaces de ampliar aún más la vida útil de daf-2 (e1370) mutantes, como es el caso de mutaciones En la edad de los genes-1 / PI 3-kinasa [28]. Hemos encontrado que este es el caso para todos, pero uno de estos clones (véase más adelante; Tabla 2). En cambio, todos menos uno de los daf-16-clones independiente que examinó el aumento de la vida útil de los mutantes e1370 (véase más adelante; Cuadro 3]. También pregunta si estos clones RNAi podría afectar a un proceso diferente regulada por la vía insulin/IGF-1: dauer formación. De tipo salvaje menores entrar dauer, un pre-pubescentes crecimiento-estado detenido, en respuesta a la limitación de los alimentos. Fuerte daf-2 mutantes dauers convertirse incluso en la presencia de alimentos, en un daf-16 que dependen de la moda. Para ensayo dauer formación, nos pregunta si nuestros daf-16 que dependen de RNAi clones mayor a los débiles dauer-constitutiva (Daf-c) fenotipo de daf-2 (e1370) mutantes cultivadas en 22,5 ° C. Hemos encontrado que cuatro daf-16 que dependen de RNAi clones (ttr-1, gpi-1, sinh-1, y ddl-2) mejorar la formación dauer en gran medida, mientras que dos clones (maoc-1 y ddl-1) hizo No (Figura 1]. (Daf-2 (e1370) gusanos crecido en ddl-3 RNAi producido casi no progenie. Por lo tanto, este daf-16 que dependen de RNAi clon no ensayadas.) Porque ttr-1, gpi-1, sinh-1, y ddl - 2 RNAi clones todos dauer mayor formación y su función era daf-16-dependientes, estos genes pueden ser parte de la vía daf-2.

Para comprobar si nuestro daf-16 que dependen de RNAi clones son parte de la vía germinal, preguntamos si pueden ampliar aún más la vida útil de glp-1 (e2141ts) de animales (que carecen de una línea germinal, cuando planteó a alta temperatura [29]], Y también mutantes defectuosos en el receptor de esteroides putativo daf-12 [12]. El itinerario germinal es distinta de la vía daf-2 en el sentido de que no parece afectar a la formación de dauer (ver datos en Materiales y Métodos]. En consonancia con esto, nuestra daf-2 clon volvió a prorrogar la vida útil de los mutantes glp-1 (véase el cuadro 2]. Como se describe a continuación, cinco de nuestros daf-16 que dependen de RNAi clones (ttr-1, sinh-1, ddl-1, ddl-2, y ddl-3) no ampliar la vida útil de glp-1 mutantes. En principio, estos clones podrían simplemente impedir el desarrollo de la línea germinal. Sin embargo, esto parece poco probable, ya que ninguno de estos clones RNAi reducido tamaño de la camada (datos no presentados). En lugar de ello, favorecer la interpretación de que la ablación se extiende germinal de vida, al menos en parte, mediante la inhibición de las actividades de estos cinco genes. Estas y otras daf-16 que dependen de los genes ahora se describe con más detalle.

Una de las más interesantes daf-16 que dependen de los clones transthyretin contiene un dominio de la familia y la correspondiente proteína es, pues se prevé que un miembro de la transthyretin relacionados con la familia de proteínas (ttr-1, para transthyretin transthyretin relacionados con las proteínas relacionadas con la proteína). En los vertebrados, transthyretin es uno de los tres específicos de las proteínas portadoras participen en el transporte de las dos hormonas tiroideas y del retinol. Estas proteínas transportista podría también desempeñar un papel en la regulación de la absorción de las hormonas libres circulantes en diversos tejidos [30, 31]. C. Elegans TTR-1 es un miembro de una familia de proteínas relacionadas pero con una completamente conservado predijo hidrofóbicas de bolsillo [32], lo que sugiere que podría funcionar como un portador de un lipofílica (s) de la hormona que influye en la vida útil. Encontramos que ttr-1 RNAi mayor dauer formación (Figura 1], y no en la ampliación de la vida útil de daf-2 (e1370) mutantes (véase Cuadro 2], lo que sugiere que él (y la hormona putativo lipofílica [s] que se une) Insulin/IGF-1 actos en la vía, ya sea de aguas arriba o en paralelo a daf-16.

El ttr-1 RNAi clon no ampliar aún más la vida útil de los mutantes glp-1 (véase el Cuadro 2], lo que sugiere que también funciona en la vía a la influencia germinal de vida. La extensión de la vida útil germinal-ablated animales requiere la putativo del receptor de la hormona esteroide DAF-12 [12], y hemos encontrado que ttr-1 no pudo extender la vida útil de los mutantes DAF-12. Por lo tanto, es un modelo plausible que TTR-1 y se une a los límites de la disponibilidad de un ligando que activa DAF-12.

Otro daf-16 que dependen de RNAi clon, maoc-1, codifica una proteína que contiene una MaoC-como dehydratase dominio, que se encuentra también en enzimas como la humana tipo IV estradiol 17 - β-deshidrogenasa y en el ácido graso sintetasa subunidad β. Por lo tanto, maoc-1 podría actuar en la síntesis de una hormona que influye en lipofílica vida en un daf-16 que dependen de la moda. Este clon no ampliar aún más la vida útil de daf-2 (e1370) mutantes (véase Cuadro 2], lo que sugiere que el gen insulin/IGF-1 actos en la vía, pero no para mejorar la Daf-c fenotipo (Figura 1 ). Además, el clon mejorado la longevidad de glp-1 (germinal-defectuoso) mutantes (véase el cuadro 2], argumentando que no se extienda la vida útil de la señalización que afectan germinal. El clon también el aumento de la vida útil de daf-12-mutantes nulos, por lo que es poco probable que sintetizar una DAF-12 ligando. Desde este clon diferente de los actos ttr-1 a afectar a la vida, estos resultados plantean la posibilidad de que varias hormonas lipofílicas influencia de vida en un daf-16 que dependen de la moda.

El tercer daf-16 que dependen de los genes, gpi-1, codifica una glucosa en la glucosa-6-fosfato isomerasa fosfato isomerasa / neuroleukin homólogo. Este clon mejorado RNAi dauer formación (Figura 1] y que se prorrogó la vida útil de glp-1 y mutantes daf-12 (véase el cuadro 2]. Por lo tanto, probablemente insulin/IGF-1 funciones en la vía, pero no en la vía de afectar a la reproducción de vida. En los mamíferos, la glucosa-6-fosfato isomerasa funciones en la glicolisis y también como un factor de crecimiento neuronal secretada. Estamos a favor de la posibilidad de que la glicolisis influye en el envejecimiento, debido a la inhibición de otro gen glicolisis, phosphoglycerate mutasa, que también se extiende la vida útil [22]. Una posibilidad es que este clon RNAi se extiende la vida útil mediante la reducción de los niveles de ATP, que a su vez inhibe la liberación de insulina-como DAF-2-ligandos análogos a los efectos de la ATP en la liberación de insulina en mamíferos [33].

El cuarto daf-16 que dependen de los genes, sinh-1, codifica una homólogo homólogo de SIN1 SIN1 Schizosaccharomyces pombe, el estrés-MAP quinasa activada la interacción proteína 1 [34], que funciona en la respuesta al daño del ADN. En S. pombe, SIN1 inactivación aumenta la sensibilidad a algunos problemas ambientales, como la alta temperatura y el estrés osmótico, pero no con el estrés oxidativo [34]. Inesperadamente, encontramos que sinh-1 RNAi aumentó significativamente tanto termotolerancia (media de vida de los gusanos de tipo salvaje a 35 ° C: control de 16,0 h; sinh-1 (RNAi) 20,6 h, p <0,0001) y la resistencia al estrés oxidativo (Media de vida de los gusanos de tipo salvaje tratados con paraquat (generador de radicales libres-): control de 4,4 h; sinh-1 (RNAi) 7,1 h, p <0,0001). Así, en el C. Elegans (y tal vez otros organismos multicelulares también), este gen parece prevenir, en lugar de promover, destacar la resistencia.

Sinh-1 RNAi mayor dauer formación (Figura 1], y no a ampliar aún más la longevidad de daf-2 (e1370) mutantes (véase Cuadro 2], lo que sugiere que actúa en la vía de insulin/IGF-1. Sinh-1 también RNAi No para extender la longevidad de glp-1 mutantes, lo que sugiere que sinh-1 funciones en la vía germinal (véase el cuadro 2]. Curiosamente, sinh-1 RNAi hizo extender la vida útil de daf-12 / esteroide-receptor mutantes (véase el cuadro 2]. La relación entre el regulador DAF-16 y DAF-12 no es conocido. Por lo tanto, una posible explicación es que, en respuesta a la ablación germinal, DAF-12 se activa DAF-16/FOXO mediante la inhibición de la actividad de SINH-1. Alternativamente, las células germinales podría regular las actividades de DAF-16/FOXO y DAF-12 en paralelo, y sinh-1 podría actuar sólo en la vía que regula DAF-16/FOXO.

La proteína codificada por el quinto daf-16 que dependen de RNAi clon, ddl-1 (para daf daf-16 - dependiente de la longevidad depende la longevidad), ha informado de interactuar con bomba de calor, factor de la proteína de unión de choque (HSB-1) [35] , Un regulador negativo de C. Elegans calor-shock factor de transcripción (HSF-1) la actividad [36]. En C. Elegans, el HSF-1 promueve la longevidad [5 - 7], y se requiere junto con daf-16 / FOXO para el aumento de vida útil de daf-2 receptores mutantes [6, 7]. Así pues, de tipo salvaje ddl-1 puede inhibir la longevidad mediante la reducción de la actividad de HSF-1. Ddl-1 RNAi no ampliar aún más la vida útil de daf-2 (e1370) mutantes (véase el cuadro 2], en consonancia con un papel en el Insulin/IGF-1 vía, pero no dauer mejorar la formación (Figura 1].

HSF-1 es también necesario para la longevidad de los animales que carecen de un germinal (hsf-1 (RNAi) significa vida, el 10,4 d a 20 ° C, n = 53; glp-1 (e2141); hsf-1 (RNAi) significa vida 11,0 d, n = 60, p = 0.25). Ddl-1 RNAi no extender la vida útil de los mutantes glp-1, lo que sugiere que él, también, las funciones en la vía germinal. Curiosamente, al igual que sinh-1 RNAi, ddl-1 RNAi logró extender la vida útil de los mutantes daf-12 (véase el cuadro 2]. Este hallazgo sugiere que ddl-1 y sinh-1, que también fue implicado en la respuesta al estrés, actuar en el mismo proceso a afectar a la longevidad.

El sexto daf-16-dependientes clon, ddl-2, codifica una proteína que se ha informado de interactuar con DDL-1 [35]. Este clon mejorado RNAi dauer formación (Figura 1], y no para aumentar la longevidad de daf-2 (e1370) mutantes (véase el cuadro 2], en consonancia con un papel en la vía insulin/IGF-1. Al igual que ddl-1 RNAi, ddl-2 RNAi no para aumentar la vida útil de los animales con deficiencia de germinal (véase el cuadro 2], lo que sugiere que él, también, las funciones en la vía germinal. Sin embargo, a diferencia de ddl-1 RNAi, en varios experimentos, este clon no para extender la vida útil de los mutantes daf-12 (véase el cuadro 2]. Suponiendo que DDL-1 y DDL-2 interactúan, esto sugiere que la función de una manera compleja para influir en la vida.

El final daf-16-dependientes clon, (ddl-3), se prevé disponer de un péptido-tetratrico repetir (TPR) motivo de la interacción de proteínas. Este clon no para aumentar la longevidad de los mutantes daf-2 (véase el cuadro 2], lo que sugiere que ddl-3 actos en la vía insulin/IGF-1. Tampoco pudo ampliar aún más la vida útil de glp-1 / germinal-defectuoso y daf-12 / esteroide-receptor mutantes (véase Cuadro 2], lo que sugiere que DDL-3 también actúa en la vía germinal, posiblemente como un adaptador de proteína en un Cascada de señalización que regula DAF-16 y DAF-12.

Mitocondrial RNAi clones

Dado el gran número y grandes efectos de cromosomas I / II de la cadena respiratoria RNAi clones [21, 22], no nos sorprendió encontrar que 12 de nuestros RNAi clones codifican componentes de la cadena respiratoria mitocondrial. (De estos, cuatro clones de cromosomas I [nuo-2 / T10E9.7, cyc-1 / C54G4.8, cco-1 / F26E4.9, y atp-3 / F27C1.7] y uno de cromosomas II clon [cchl - 1 / T06D8.6] fueron publicados previamente [21, 22]. Los siete nuevos clones se nuo-3 / Y57G11C.12, nuo-4 / K04G7.4, nuo-5 / Y45G12B.1, cco-2 / Y37D8A. 14, atp-4 / T05H4.12, atp-5 / C06H2.1, y asb-2 / F02E8.1 [ver Cuadro 1].] Respiratorias de la cadena de RNAi clones se cree que afecta a un camino que es independiente de la insulina / IGF-1 vía [21, 22]. En consonancia con esto, nos encontramos con que todos los nuevos mitocondrial RNAi clones fueron capaces de extender la vida útil de los mutantes daf-2, y que sus actividades son independientes daf-16 (Tabla 3].

RNAi de componentes de la cadena respiratoria disminuye el tamaño corporal y hace más lento el movimiento y comportamiento alimentario (de bombeo) [21]. Curiosamente, mientras que la vida útil y el tamaño y tipo de bombeo están inversamente correlacionadas para la mayoría de los animales de esta clase, hay varias excepciones (véase la Tabla S3]. Por ejemplo, hemos encontrado que los animales sometidos a nuo-5 (NADH NADH-ubiquinona ubiquinona oxidoreductase oxidoreductase) o cchl-1 (citocromo citocromo C heme heme-liasa liasa) RNAi había casi normal del tamaño (y, por nuo-5, también Tasa normal de bombeo), pero importantes extensiones de vida útil (alrededor de 30%, véase el cuadro 1]. Por lo tanto, la longevidad de los animales con una reducción de la respiración es poco probable que se causalmente conectado a su pequeño tamaño o tipo reducido de bombeo.

Los genes que pueden estar implicados en la longevidad respuesta a la restricción dietética

Otros nueve clones RNAi también aumentó la vida útil de los mutantes daf-16 (Tabla 3]. DR extiende la vida útil de C. Elegans en un daf-16-de manera independiente [18, 19]. Por ello, pregunta si alguno de estos clones podrían estar involucrados en la respuesta al DR. Para hacer esto, le preguntó si podría dejar de seguir ampliando la larga vida de los comer-2 (ad1116) mutante, que es un modelo para la genética DR [18, 37]. Se encontró que este era el caso de cuatro (sams-1 / C49F5.1, Árabe-10 / T23H2.5, drr-1 / F45H10.4, y drr-2 / T12D8.2) de los nueve genes (Cuadro 3 ). Esto es interesante porque a la fecha, la duración de vida de todos menos uno de larga vida mutante examinados, clk-1, puede ampliarse por mutaciones en el comer-2 [18].

Uno de estos genes, sams-1, codifica S - adenosyl adenosyl metionina metionina sintetasa sintetasa, una proteína que funciona como un grupo de donantes universales de metilo en muchas reacciones bioquímicas. La inhibición de esta enzima pueden afectar a la metilación de las histonas, DNA, RNA, proteínas, fosfolípidos, y otras pequeñas moléculas [38]. Para investigar más a fondo la posibilidad de que C. Elegans sams-1 juega un papel en la respuesta a DR, pregunta si este RNAi clon, como DR [39] (Crawford y D. y C. Kenyon, datos no publicados) redujo el tamaño de la camada y el retraso en la reproducción. Se encontró que se había reducido el tamaño de la camada y reproductiva momento fue ligeramente retrasado (Figura 2]. Además, al igual que los animales DR, sams-1 RNAi, gusanos eran delgados (ver Tabla S1]. La tasa de bombeo (de comer) no se vio afectada (datos no presentados), lo que sugiere que este clon RNAi ejerce sus efectos a través de los cambios en el metabolismo en lugar de cambios en el apetito. En conjunto, estos hallazgos sugieren que RD puede extender la vida útil, al menos en parte, por la inhibición de la actividad de sams-1. En consonancia con esta idea, encontramos que sams-1 se redujeron los niveles de mRNA de 3 veces en el comer-2 mutantes (Figura 3]. Por lo tanto, proponemos que el modelo DR puede iniciar una respuesta de la longevidad, al menos en parte, regulado por desencadenar un descenso en sams-1 los niveles de mRNA y, en consecuencia, celulares adenosyl S-metionina. La reducción de los niveles de metionina a la dieta que se conoce para aumentar la vida útil de ratones [40] y ratas por 40-45% [41 - 43], sin embargo, si la limitación y metionina general DR activar mecanismos de la longevidad la misma no se conoce. Nuestros hallazgos sugieren que este podría ser el caso.

Otro clon RNAi que no ampliar aún más la vida útil de comer-2 mutantes se Árabe-10, que codifica una GTPasa Rab-como similares a los que regulan el transporte de vesículas. Al igual que sams-1 RNAi, este clon no afectó el bombeo, pero sí reducir y retrasar la reproducción (véase la figura 2] y produjo una apariencia esbelta (ver Tabla S1]. La expresión de este gen, también, se había reducido regulado en respuesta a DR (2 veces; Figura 3]. Todas estas propiedades son compartidas por drr-1 (restricción dietética restricción dietética respuesta de la respuesta), un gen que codifica una nueva proteína sin evidente homólogo humano (véase el cuadro S1 y Figuras 2 y 3].

El fenotipo de la última DR clon, drr-2, difieren de las de los demás clones en RD que drr-2 (RNAi) gusanos tenía una normal, bien alimentado aparición (ver Tabla S1] y reproducción normal (véase la figura 2] . RRD-2 es un putativo ARN-proteína de unión, lo que sugiere que juega un papel regulador en el desencadenamiento de la respuesta de la longevidad (pero no la respuesta reproductiva) a la RD. La expresión de este gen también se redujo en el comer-2 mutantes (2 veces, en la Figura 3], lo que sugiere que, como el resto de los genes que hemos identificado, baja regulación de este gen en respuesta a RD causas de alguna extensión de vida. En general, es sorprendente que la expresión de los cuatro genes DR se redujo en el comer-2 mutantes. Esto sugiere que en C. Elegans, DR provoque una concertada transcripcional (mRNA o el volumen de negocios) que pueden inhibir la respuesta de múltiples genes acortar la vida útil de las actividades y, por tanto, se extiende la vida útil.

También pregunta si la vida útil de comer-2 (ad1116) mutantes podría ser aumentado por la cadena respiratoria RNAi, y encontró que podía (D. Crawford y C. Kenyon, datos no publicados). Desde la reducción de actividad de la cadena respiratoria durante el desarrollo es necesario para la extensión de vida [21], mientras que la reducción de los niveles de alimentos sólo durante la edad adulta se extiende vida útil [44], parece probable que los componentes de la cadena respiratoria mitocondrial y RD no se extienden vida exactamente de la misma manera.

Integrina de Señalización es probable que Desempeñar un Papel en Evolutionarily Conservadas Duración Limitación

Pérdida de la función de las mutaciones en la β-integrina (myospheroid) extender la vida útil en Drosophila [45], y hemos encontrado que los clones de RNAi pat-4 / C29F9.7, que codifica la integrina-quinasa vinculadas, y pat-6 / T21D12. 4, que codifica actopaxin, una proteína conocida a unirse a la integrina-quinasa vinculadas [46], el aumento de duración de la vida en C. Elegans (véase el cuadro 1). Señalización de integrina influencias vías de señalización de la insulina en mamíferos [47], sin embargo, la extensión de vida producidas por estos dos clones se daf-16 independientes (Tabla 3]. Además, la vida útil de daf-2 (e1370) mutantes se amplió cuando estos animales fueron cultivadas en cualquiera de pat pat-4 o RNAi-6 (Tabla 3]. Así, la integrina señalización puede comprender una novela, conserva la vida útil de reglamentación vía, a pesar de que podría funcionar en la vía insulin/IGF-1 aguas abajo de daf-16-que es del conocimiento de la célula acto-no autónoma [48]-para influir en la vida . (Inactivación de pat-4 y pat-6 alteración de la salud de comer-2 mutantes, lo que hace a su relación con DR difíciles de interpretar.) El descubrimiento de que los genes o las vías ya conocidas para influir en la vida de otro organismo también afectan C. Elegans' vida útil es significativo, tales como la antigüedad, conservado evolutivamente vías de la longevidad podría también influir en la vida humana.

Los genes que pueden funcionar en novela vías para influir en la longevidad

El uso de análisis genéticos epistasis, hemos sido capaces de asociar la mayoría de nuestros nuevos genes conocidos con el envejecimiento de las vías o los procesos de regulación. Sin embargo, las funciones de los tres genes sigue siendo poco clara. Dos de ellos, ril-1 / C53A5.1 y ril-2 / C14C10.3 (RNAi RNAi inducida inducido longevidad longevidad), novela codifican proteínas con homólogos no obvia, mientras que rha-2 / C06E1.10 codificada una DEAH RNA helicasa , Lo que sugiere que regula la expresión de genes o de metabolismo de los ácidos nucleicos. Los tres clones RNAi prorrogó la vida útil de ambas daf-16 y comer-2 mutantes (Tabla 3], lo que sugiere que pueden funcionar en una nueva vía o vías para influir en la longevidad.

Resumen

En este estudio, hemos identificado muchos genes cuya interesante nueva función normal se prevé que inhiben la longevidad. A pesar de que nuestra pantalla no llegó a la saturación, un interesante panorama. La mayoría de los genes que hemos identificado cayó en una de las tres clases: los genes que influyen en la vida a través de DAF-16/FOXO (8 / 29), los genes que influyen en la respiración (12/29), y los genes que parecen influir sobre la respuesta a DR ( 4 / 29). Dos genes más afectados señalización de la integrina, que se sabe que influyen en la vida de las moscas. Al igual que el sistema de insulin/IGF-1/FOXO y de la cadena respiratoria, la mayoría de las vías y los sistemas biológicos consisten en muchos genes, y no para identificar incluso uno de los componentes de muchos de estos sistemas (por ejemplo, el TGF-β sistema de señalización). De hecho, de los genes que se han conservado secuencia de motivos, sólo una, la rha-2 RNA helicasa homólogo, no puede estar vinculado a una conocida vía. Estos resultados son estimulantes, porque hasta ahora no hemos tenido ninguna forma de saber si la longevidad de las vías que sabemos sobre representan sólo la punta del iceberg. Los resultados indican que, por el contrario, a lo sumo una o algunas otras grandes sistemas multigenic influencia en la vida de C. Elegans. En otras palabras, ahora podemos tener conciencia de la mayoría de las principales vías biológicas en C. Elegans que, cuando se inhibe, puede producir en grandes extensiones de vida.

Materiales y Métodos
Apoyo a la Información
Resumen de la pantalla de RNAi longevidad
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Comparación de la
(72 KB PPT)
Complete los datos de análisis de ciclo de vida RNAi clones que se extienden de vida
(839 KB DOC)
Análisis de ciclo de vida de la biblioteca de codificación clones conocidos (no neuronales) genes de la longevidad
(48 KB DOC)
Tasa de bombeo y la longitud del cuerpo de los animales cultivados en N2 mitocondrial RNAi clones
Encontrar en la DOI:
10.1371/journal.pgen.0010017.st003
(49 KB DOC)

Damos las gracias a todos los miembros de Kenyon laboratorio para los debates y ayudar, Kaveh Ashrafi para comentarios sobre el manuscrito, y Julie Ahringer, Ravi Kamath, y Andrew Fraser RNAi para la biblioteca. MH fue apoyada por el Consejo Danés de Medicina y Ciencias Naturales de los Consejos de Investigación. ALH fue apoyada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Ellison y el NIH a CK, que es una Sociedad Americana del Cáncer y profesor de UCSF también un co-fundador de la empresa de biotecnología Elixir Pharmaceuticals.