Normalización de los ensayos de citometría de flujo de citoquinas

Enzima-ligado immunospot (ELISPOT) y citometría de flujo de citocinas (CFC) (o más concretamente, la tinción intracelular de citoquinas (ICS)) son más populares los métodos para el análisis de una sola célula de antígeno-específica de células T producción de citoquinas. La producción de células T del IFN γ, y cada vez más también la IL-2, se toma como una medida de la inmunogenicidad de la vacuna experimental en ensayos de vacunas. De los dos tipos de ensayos, de CSI tiene la ventaja de una muy multiparamétrico de lectura (citometría de flujo), que permite la fenotipificación precisa de la respuesta de células T poblaciones. Recientemente también ha sido adaptado a una placa de 96 pocillos de configuración [1, 2], lo que permite un mayor rendimiento de análisis similar a la utilizada para ELISPOT. Sin embargo, aunque la precisión de los ensayos de ELISPOT través de los sitios ha sido documentada recientemente [3], estudios similares para los ensayos de CSI han sido insuficientes.

Numerosos fase Iy la fase II de ensayos clínicos se han puesto en marcha utilizando profilácticos candidato vacunas contra el VIH (revisado en [4]]. Muchos de estos ensayos el uso de CSI en el marco de su vigilancia inmune. Si bien la mayoría de los juicios en curso el VIH no son alimentados a fin de determinar la eficacia, la producción de citoquinas y no ha sido validada como un marcador sustituto de la protección contra la infección del VIH o la progresión, es, sin embargo, el deseo de medir la inmunogenicidad de las vacunas, así como de seguridad a principios de los ensayos clínicos [5]. Debido a que muchos están realizando diferentes grupos de vigilancia inmune de estos ensayos clínicos, en la actualidad hay una falta de normalización que permitan comparaciones exactas de inmunogenicidad a través de diferentes vacunas candidatas en ensayos clínicos.

Hay cierta literatura publicada sobre la intra-e inter-ensayo de precisión de los ensayos de ICS en sangre [6]. Estos valores se determina que aproximadamente el 8% y el 20% CV, respectivamente. Directrices para la realización de ensayos de CSI también se han publicado recientemente [7]. Sin embargo, no existen datos que documenten la precisión de ICS entre los laboratorios, o la comparación de la precisión de ICS utilizando diferentes tipos de muestras (por ejemplo, sangre total versus criopreservados PBMC). Con el fin de permitir que más de comparaciones significativas entre los laboratorios y el establecimiento de prioridades de las nuevas vacunas, y, en consecuencia, acelerar el desarrollo de vacunas contra el VIH, este estudio de CSI normalización se llevó a cabo.

Los objetivos del estudio fueron tres: (1) para evaluar la reproducibilidad de los ensayos de ICS utilizando diferentes tipos de muestras (sangre entera enviadas vs criopreservados PBMC), (2) para determinar la precisión entre laboratorios de ensayos de ICS entre los principales VIH Clínicos de la vacuna contra los laboratorios de investigación, y (3) para mejorar la concordancia de las metodologías utilizadas en estos laboratorios. Para lograr estos objetivos, experimentos conjuntos (Figura 1] se diseñaron utilizando (1) sangre total activada en un lugar céntrico, donde se fijarán, congeladas y enviadas a los laboratorios participantes para su procesamiento y análisis, (2) un nuevo conjunto de sangre extraídas en un lugar céntrico Y enviadas a los laboratorios participantes para realizar la activación, el procesamiento y análisis, y (3) criopreservados PBMC enviadas desde un sitio central a los laboratorios participantes para realizar la activación, el procesamiento y análisis. En este último caso, este experimento también se repite con un mayor número de laboratorios participantes, utilizando el formato pre-placas microtiter liofilizado que contiene estímulos y liofilizado tinción de anticuerpos. En cada experimento, los archivos de datos en bruto también fueron enviadas por laboratorios de los participantes a un lugar central para su análisis, que se realizó según una dinámica gating plantilla de lote y análisis [1] (Figura 2].

En el primer experimento, toda la sangre de tres citomegalovirus (CMV) de los donantes seropositivos se activó, fijo, y congelado por el método descrito en el Nomura et al. [6]. La sangre se incubaron durante 6 horas, en presencia de brefeldin A, ya sea con ningún estímulo, Infección por enterotoxina B (SEB), o una mezcla de la superposición de péptidos correspondientes a la CMV pp65 proteína [8 - 10]. Alícuotas congeladas activado de la sangre total se enviaban a 9 laboratorios para su procesamiento y análisis. Los resultados, según lo informado por cada sitio y también según lo determinado por el centro, el análisis automatizado de los archivos de datos en bruto, se resumen en la figura 3. Para los datos reportados por cada sitio, la media entre los laboratorio de CV fue de 55% para las respuestas de células T CD4 y el 32% de las respuestas de células T CD8. Esto es más alto que el CV inter-ensayo se informó anteriormente para ensayos de ICS realiza en un solo sitio [6]. Sin embargo, cuando los datos se analizaron centralizada, la inter-laboratorio de CV se redujo al 24% para ambos CD4 de células T CD8 y respuestas, muy similar a la inter-ensayo de CV informó anteriormente [6]. Así, una gran proporción de los de sitio a sitio variabilidad podría explicarse por las diferencias en gating datos de la CSI.

En un segundo experimento, toda la sangre de tres donantes CMV-seropositivos fue enviado la noche a la mañana a 6 laboratorios de EE.UU. para la activación, el procesamiento y análisis. Este experimento se realizó dos veces, ya que el primer juicio fue comprometida por los retrasos de envío. Los resultados de la segunda prueba se muestran en la figura 4. Como en la figura 3, entre el laboratorio de CV's fueron más altos para los datos notificados por cada sitio, a pesar de la reducción debido a la centralización de análisis fue menos espectacular que en el primer experimento. Comentarios sobre gating diferencias se proporcionó a los laboratorios entre el primer y el segundo experimento, por lo que el menor efecto de la centralización de análisis puede atribuirse a una progresión de los sitios hacia un régimen más uniforme gating. Asimismo, la relativamente alta CV para las respuestas de células CD4 T (42% incluso después de análisis centralizado) podría ser debido a la baja respuesta media a CMV péptido mezcla en dos de los donantes (los donantes no eran idénticos en los diferentes experimentos). Desde la CV varía inversamente con la media de la población de la muestra, la comparación entre los CV's de experimentos realizados en diferentes donantes están sujetos a esta variable de confusión.

En un tercer experimento, PBMC fueron aislados a partir del 6 de donantes CMV-seropositivos y criopreservados. Replicar criopreservados viales fueron enviados a cada uno de los 7 sitios, donde fueron descongelados, descansó la noche a la mañana, estimulado, transformados, y analizadas. El deshielo posterior a la viabilidad y la recuperación de la PBMC muestras de cada sitio se muestra en la Figura 5. La media de viabilities fueron> 82%, y la media de las recuperaciones fueron> 75% para cada muestra (determinado por la exclusión de tripan azul). En general, viabilities son bastante uniformes entre los laboratorios, mientras que las recuperaciones más variado ampliamente, tanto entre los laboratorios y entre las muestras. Esto podría ser debido en parte a la imprecisión de llenado de los viales cuando fueron inicialmente congelados, lo que tendría consecuencias de la aparente recuperación calculado a la descongelación. Además, mientras que un protocolo común de descongelación se proporcionó, no se trató de estandarizar los métodos de recuento o de otros factores que pueden influir en la viabilidad y reproducibilidad de los cálculos de recuperación a través de laboratorios.

El ICS criopreservados PBMC de los resultados se muestran en la Figura 6. La inter-laboratorio de CV's para este experimento en promedio ligeramente inferiores a las de los experimentos de sangre total (25-32% para análisis manual; 23-25% para análisis automatizado centralizado). Al igual que la prueba de sangre fresca en su conjunto, la mejora de la CV centralizado de análisis es relativamente pequeño. Cuando atípicas muestras con inusualmente bajos respuestas fueron verificados para la viabilidad y la recuperación, que no son necesariamente bajos en estos parámetros también. De hecho, no hay relación evidente de la viabilidad o de la recuperación con la respuesta, tal vez porque viabilities y recuperaciones fueron prácticamente todos los generalmente reconocidos dentro de los límites de aceptabilidad (> 80% viabilidad,> 50% de recuperación) [11, 12].

Para ampliar los resultados del tercer experimento utilizando criopreservados PBMC, en un cuarto experimento con este tipo de muestra se llevó a cabo mediante la ampliación de la cohorte de los laboratorios participantes (cuadro 1]. Además, el perfeccionamiento de un protocolo se introdujo para tratar de reducir todavía más la variabilidad inter-laboratorio: Péptido estímulos junto con brefeldin A liofilizado se presentaron en forma adecuada en los pozos de una placa microtiter, para proporcionar simplificado ensayo set-up; liofilizado y tinción de anticuerpos cócteles Se presentaron en los correspondientes pozos de una segunda placa microtiter. Estos últimos se rehidrata y se añaden a las celdas de la primera placa microtiter después de la fijación y permeabilización de las células. Este experimento también trató de comparar dos tipos diferentes de la tinción de anticuerpos cócteles: los dos cócteles utilizados en los últimos tres experimentos (IFN γ FITC/CD69 PE/CD4 PerCP-Cy5.5/CD3 APC y IFN γ FITC/CD69 PE/CD8 PerCP-Cy5 .5/CD3), Y una que combina CD4 y CD8 tinción en una sola muestra, así como la adición de IL-2 tinción (CD4 FITC / IFN γ + IL-2 PE/CD8 PerCP-Cy5.5/CD3 APC).

Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 7 (nota el cambio a una escala lineal en el presente y las siguientes cifras). Un conjunto de péptidos de epítopes de CMV, EBV, y la gripe (CEF) [13] se utilizó como control positivo, debido a restricciones en el envío internacional de SEB. CEF se esperaba para inducir CD8, CD4 en lugar de respuestas, y, de hecho, el CD4 respuestas a este control eran muy bajos o negativos. Las respuestas de CD8, mientras que positivos, fueron considerablemente menores que las observadas con SEB en los experimentos anteriores. Las respuestas a CMV pp65 péptido tampoco se mezcla en lo alto de las donantes se utiliza en este experimento, pero se detecta en los dos compartimentos de CD4 y CD8. A pesar de la baja respuesta de los medios, el promedio de CV para este experimento fue más o menos similar al anterior experimento, al comparar la misma tinción de anticuerpos cócteles (cocteles 2 y 3). Por razones que se desconocen, el promedio de CV cóctel 1 (CD4/IFN γ + IL-2/CD8/CD3) fue mayor que la de los cócteles 2 y 3, si bien el porcentaje medio de citoquinas de las células positivo no fue significativamente diferente. La adición de IL-2 en este cóctel no aumentó significativamente el porcentaje de la media de citoquinas de las células positivas, como muy pocas células en respuesta a CMV producen IL-2 sin IFN γ [14]. Esto no se espera que sea cierto para todos los tipos de respuestas, sin embargo.

Cuando los datos de este experimento fueron analizados centralmente (Figura 7B], el promedio de CV's se redujo considerablemente, al igual que en el primer experimento (Figura 3]. Esto podría reflejar el hecho de que los nuevos sitios de laboratorio se ha añadido que aún no habían normalizado sus estrategias con el gating sitios existentes; por lo tanto, más beneficio se realiza el análisis centralizado. La diferencia en el promedio de CV cóctel entre 1 y cócteles 2 y 3 se conservó incluso después de análisis centralizado. La media de cócteles CV 2 y 3 es ahora del 18%, la más baja variabilidad visto en ninguno de los experimentos. Por comparación, la media entre los laboratorio de CV por ciento de los CD4 ⁺ o células CD8 ⁺ en las muestras no de este experimento fue de 3% y 7%, respectivamente (datos no presentados).

Como control positivo en el Experimento 4, un conjunto de PBMC se SEB-activado, transformados, manchada, y luego liofilizado en algunos pozos de las placas de anticuerpos liofilizado. Ellos fueron hidratados y trasladado a la placa que contiene las células activadas, junto con la tinción de anticuerpos. Estas células servido como un instrumento de control para la configuración y gating, ya que todas las medidas de activación y transformación se realiza centralmente. Los resultados reportados por los sitios de estas células se muestran en el panel izquierdo de la Figura 7C. Sorprendentemente, el promedio de CV (20,5%) fue sólo ligeramente menor que el del resto del Experimento 4, en el que las células se activan y se procesa de forma independiente cada sitio. Sin embargo, cuando el control de la célula central de datos se analizaron mediante un modelo dinámico de gating (panel derecho), la CV's se redujeron a 3-7%. Esto refuerza la idea de que la gran mayoría de los inter-laboratorio de la variabilidad se debe a gating.

"Antecedentes" o espontánea producción de citoquinas (restará de todos los datos en los gráficos 3, 4, 6, y 7] se traza para todos los experimentos en la figura 8. Fondos eran bajos, en general. Para todos los experimentos combinada, el promedio de CD4 fue de antecedentes 0,02% y la media de CD8 antecedentes fue de 0,05%. 98% de CD4 muestras y el 84% de las muestras tenía antecedentes CD8 = 0,1%. Hubo un número importante de CD8 que exhiben muestras espontáneas de alta producción de citoquinas. Sin embargo, la media de antecedentes CD8 fue significativamente más alta que la media de CD4 en el fondo sólo activado, fija toda la sangre experimento (p <0,0005). Cuando automatizado centralizado de análisis se aplicó a los datos, los antecedentes no eran por lo general reducido. Esto indica que el aumento de la reproducibilidad visto con centralizada análisis no se debe simplemente a la reducción de antecedentes.

Aunque CD4 orígenes fueron muy similares entre los experimentos, CD8 orígenes diversos. La mediana de CD8 antecedentes en la PBMC experimentos fue significativamente más bajo que el de la sangre total congelados activado experimento (p <0,0001) o la sangre entera fresca experimento (p <0,05). Las diferencias fueron significativas después centralizada y análisis. Sin embargo, esto podría deberse al hecho de que diferentes donantes han sido utilizados en los cuatro experimentos, en lugar de ser debido a alguna diferencia inherente entre los tipos de ensayo. En el experimento 4, el CD4 antecedentes para cóctel 1 fueron significativamente más altos que los de cóctel 2 (p <0,05, no se muestran los datos), mientras que no hubo diferencias significativas para CD8 orígenes. Esto puede ser debido a la inclusión de la IL-2 en 1 cóctel, que se espera que sea producido por más de CD4 ⁺ de las células CD8 ^+, y contribuir de esta manera selectiva a los antecedentes CD4.

El presente estudio examinó la reproducibilidad de los ensayos a través de las sedes de CSI utilizando diferentes formatos de ensayo. No fue diseñado para comparar ICS con otros ensayos de la vigilancia inmunológica, de las comparaciones que se han publicado [15 - 21]. El actual estudio utilizó 96-así placa basada exclusivamente los protocolos, ya que estas se consideraron más conveniente, y recientemente se han validado contra el tubo de base para los protocolos de PBMC y sangre total [1].

Liofilizado reactivos en placas se utiliza para el Experimento 4. Estas han sido ampliamente comparación con reactivos líquidos ([22] y Figura 9] y demostrado ser en gran medida equivalente. Además de la comodidad de ensayo de puesta en marcha, el liofilizado reactivo placas de ofrecer estabilidad a largo reactivo, incluso a temperatura ambiente (> 1 año, los datos no presentados), y una posible reducción de los errores causados por la incorrecta adición de reactivo. La variabilidad intra-placa liofilizado utilizando reactivos está decidido a ser <10% en los ensayos de CSI (datos no presentados).

Hay algunos posibles inconvenientes de la utilización de placas de 96 pozos. Uno de ellos es la posibilidad de que así-así-a la contaminación durante el ensayo. Esto se observó en un primer subconjunto de Experimento 4 (datos no presentados), en el que algunos sitios recibido liofilizado con placas de SEB como un control positivo. Algunos de estos sitios de alto experimentado antecedentes negativos en el control de los pozos adyacentes a los pozos que contienen SEB. Más tarde se determinó que la contaminación cruzada probablemente se produjeron durante la distribución inicial de los antígenos en las placas, y esto se ve agravado por el hecho de que los donantes utilizados fueron inusualmente sensible a la estimulación SEB (respuestas de> 30% de los CD4 ⁺ y CD8 ⁺ Células T). Cuando fue sustituido por SEB CEF como un control positivo, no se observaron problemas. Esta experiencia sugiere que la selección y colocación de los pozos de control positivo en un plato merece consideración.

El presente estudio fue diseñado para determinar la variabilidad inter-laboratorio de ensayos de ICS. Como tal, no se dispone de datos "filtros" potencialmente aplicarse a excluir datos erróneos o atípicos. Sin embargo, la mejora de la precisión de los resultados de CSI puede ser obtenido si determinados criterios de aceptación se aplicaron antes de los datos se tomaron como válidas. Por ejemplo, un número mínimo de eventos que pueden ser recogidos especificado (sitios en este estudio se les pidió que recoger 10000-40000 CD4 ⁺ o células T CD8 ⁺ por muestra, o 60000 células CD3 ^+). Esta serie de eventos fue diseñado para obtener los niveles de precisión que minimice el número evento como un factor de inter-laboratorio de la reproducibilidad. También podría haber criterios de aceptación basados en el nivel absoluto de antecedentes, o el grado de reproducibilidad entre duplicados de las muestras, en caso de ejecutarse (el actual estudio no utilizar duplicados de las muestras).

También es posible aplicar las estadísticas para obtener más significado de resultados numéricos. Por ejemplo, las pruebas estadísticas se podrían utilizar para determinar si una determinada respuesta puede ser discriminado de un determinado fondo, para un determinado número de eventos recopilados [23, 24]. Esto puede ser dada por un poder de cálculo de la siguiente manera:

N = [2 * _av P (1-P _av) (Z + Z _{α β)} ^2] / ² Δ

Donde N es el número de eventos en cada una de las muestras necesarias para la significación, P _av es la proporción media (entre el fondo y las muestras de ensayo), y Δ es la diferencia entre estas dos proporciones. El término (Z + Z _{α β)} ² se denomina índice de poder, y varía en función de la potencia deseada y valor p. Por ejemplo, (Z + Z _{α β)} ² = 23,9 para la energía y el 99% p <0,005 [23].

Además, un intervalo de confianza podrían obtenerse alrededor de la diferencia del resultado de la prueba y el control negativo [24], a fin de permitir la discriminación de diferencias significativas entre las distintas muestras. Otros métodos estadísticos también han sido empleados con el fin de determinar los valores límite de respuestas positivas en el ICS [25, 26]. No se hizo ningún intento en el presente estudio para definir que los resultados fueron positivos, ya que todos los datos se informó de manera objetiva, y todos los donantes son conocidas por ser seropositivos CMV.

El examen de los datos de las figuras 3, 4, 6, y 7 sugiere que las muestras con un bajo número de células de citoquinas-positivo tuvieron mayor variabilidad de las muestras con un alto número de citoquinas de las células positivas. La relación de CV y nivel de respuesta se resume en la Tabla 2 para todos los ensayos (CD4 y CD8, sangre total y PBMC), consideradas de forma conjunta. Estos datos hacen hincapié en la dificultad de lograr la precisión de los resultados en los niveles de respuesta de menos de 0,1% de CD4 o células T CD8. Para estas muestras, la recolección de los acontecimientos aún más de lo que se sugirió que se esperaría para mejorar la precisión, por encima de la discusión.

El promedio de CV a través de los cuatro experimentos se resumen en la Tabla 3. Estos datos son confundidos por el hecho de que diferentes donantes y participó en diferentes laboratorios de los cuatro experimentos. Sin embargo, debido a la variabilidad individual de análisis puede ser excluida mediante la comparación de sólo el centro de análisis de los datos (fila inferior del cuadro 3]. Suponiendo que no efecto de las otras variables de confusión, encontramos que el Experimento 4 (criopreservados PBMC con lyoplates) arrojó una media significativamente menor que el Experimento 2 CV (enviadas sangre total) (p <0,05). Asimismo, el promedio de CV centralizada de los datos de todos los experimentos fue significativamente menor que la de los datos analizados individualmente (p <0,0001). Esto pone de relieve la cantidad de variabilidad en cada experimento que se debe a las diferencias entre los sitios gating.

Mitigación de gating variabilidad se logró en estos experimentos de análisis centralizado con una plantilla dinámica gating (ver Figura 2B]. La dinámica permitió gating plantilla para más automatizado, lote análisis de los datos. Una vez que la plantilla se ha creado y optimizado (véase la sección de Materiales y Métodos para la descripción), también podría haber proporcionado a los distintos lugares a fin de lograr los mismos resultados. Es más posible que los mismos resultados pueden ser logrados por el análisis manual, siempre que fue hecho por un solo operador. Normalización de las técnicas de gating, en la ausencia de análisis centralizado o dinámica gating plantillas, también podría mejorar la precisión. La mejora de CV realizados por análisis centralizado fue más marcado en el primer experimento, y menos en los experimentos 2 y 3, tal vez debido a la normalización de gating entre los sitios con el tiempo. Experimento 4 incluido muchos sitios nuevos, y la mejora de la CV centralizado de análisis fue de nuevo más marcada.

Debido a que el CV varía en función de que el nivel de respuesta (Tabla 2], es posible que las diferencias de medias entre el ensayo de formatos de CV se debe a que el número de bajas versus alto respondedores en cada experimento (desde diferentes donantes han sido utilizados en los cuatro experimentos ). Asimismo, la CV es muy sensible a pequeños cambios en la media, cuando la media es un número muy bajo. Por lo tanto, un análisis de SD versus significa también se realiza en el transcurso de los cuatro experimentos (Figura 10]. Esta información confirma los datos de la Tabla 3, lo que indica que los tres formatos de ensayo mostró sumamente similar reproducibilidad. Sin embargo, cuando el análisis de la variabilidad se eliminó criopreservados PBMC ensayos que parecía ser ligeramente más reproducible que envían ensayos en sangre entera. Esto parece especialmente evidente en el experimento 4, donde se utilizaron reactivos liofilizado.

Además de las diferencias en la reproducibilidad, los diversos formatos de ensayo tiene otras ventajas e inconvenientes también. Criopreservados PBMC son mucho más susceptibles de péptido (y superantigen) la estimulación de la proteína a toda la estimulación [9], mientras que los ensayos de toda la sangre son igualmente susceptibles de estimulación con cualquier tipo de antígeno. Asimismo, consistentemente buenos criopreservación de PBMC en múltiples sitios clínicos es difícil de conseguir, pero muy importante para lograr resultados reproducibles con PBMC [27, 28] (DeLaRosa et al., Manuscrito en preparación). Esto podría convertirse en menos de un factor estabilizador si una matriz para la preservación de sangre total o PBMC función se descubrieron durante el envío. Con todo, la elección del formato de ensayo para un ensayo clínico dependerá no sólo a consideraciones de ensayo de precisión, pero también a que el tipo de antígeno utilizado (s) y la capacidad de la clínica sitios participantes.

El uso de reactivos de liofilizado placas parecían reducir la variabilidad inter-laboratorio. Esto no podemos concluir con certeza, debido a los diferentes laboratorios participantes y donantes diferentes experimentos se utilizaron entre 3 y 4. Sin embargo, es intrigante observar que, cuando el centro de análisis de los datos se compara (para eliminar gating como fuente de variabilidad), la media de la CV experimento 4 fueron los más bajos de los cuatro experimentos (18%, Tabla 3]. Esto es a pesar del hecho de que los donantes y los estímulos utilizados en el experimento 4 dio lugar a los niveles más bajos respuesta media, que debería tender a aumentar la CV Esto se ve confirmado también por el análisis de la Figura 11B, en donde los resultados de la prueba 4 que parecía ser general Más cerca del mínimo teórico SD que con los resultados de otros experimentos.

Con la posibilidad de lograr entre laboratorios CV's de menos del 20%, incluso con las respuestas relativamente bajo, de CSI compara favorablemente a ELISPOT, para que interassay CV's de 17-18% para la PHA y 55-65% para Candida se han comunicado [29 , 30]. ICS también es comparable a la de citoquinas ELISA, este último que ha informado de interassay CV's de <25% [31, 32]. Fenotípica manchas, como los utilizados para el recuento de CD4, pueden alcanzar mayores niveles de precisión de las pruebas funcionales, y un promedio de alrededor del 10% en un solo CV estudios multicéntricos [33]. Por comparación, entre la CV-laboratorio de los CD4 ⁺ o CD8 ⁺ porcentajes de células fue de alrededor del 5% en el experimento 4 del presente estudio (datos no presentados). Recuento de CD4 de precisión también se ha demostrado que depende del número de eventos recogidos, gating, y el uso de análisis automatizado [33, 34]. Desde ensayos funcionales están sujetos a un mayor número de variables que fenotípicas tinción, la capacidad de alcanzar los niveles de precisión como las que se informó aquí debe considerarse favorable. CSI podría así ser una herramienta viable para la comparación de la respuesta inmune incluso a través de los ensayos clínicos, con indicación de la metodología normalizada.

ICS ensayos podrían ser llevadas a cabo por entre laboratorios CV's de aproximadamente 20% en los niveles de respuesta> 0,5%, y los CV's de aproximadamente 25-30% de respuesta en los niveles de 0.1-0.5%. El CV más en el aumento de los niveles de respuesta = 0,1%. Una parte importante de la variabilidad entre laboratorios pueden ser eliminadas mediante el uso de análisis centralizado y / o una dinámica gating plantilla.

Sangre total y criopreservados PBMC mostró sumamente niveles similares de la reproducibilidad. Sin embargo, cuando el análisis de la variabilidad se eliminó criopreservados PBMC procesados con liofilizado reactivos mostró significativamente mejor reproducibilidad que envían sangre total. Enviado ensayos en sangre entera se someten también a la pérdida de datos cuando las muestras no fueron entregadas en el momento oportuno.

Antecedentes de producción de citoquinas era en su mayor = 0,05% para los dos células CD4 y CD8. Aunque CD8 antecedentes fueron inferiores en PBMC criopreservados que en la sangre total, esto podría haberse debido a la utilización de diferentes donantes en los cuatro experimentos. Con el alto viabilities y recuperaciones obtenidos para PBMC criopreservados en este estudio, no hay ninguna relación evidente entre la viabilidad y la recuperación y respuesta.

La utilización de placas microtiter liofilizado que contiene los reactivos simplificado de la ICS protocolo, y parece mejorar la reproducibilidad del ensayo. Este formato se presta para el transporte marítimo internacional de los reactivos (porque no hay necesidad de refrigeración), y también a los grandes ensayos clínicos (debido a la estabilidad de los reactivos de liofilizado). Es también una manera de reducir la posibilidad de errores de pipeteo, porque las placas son pre-formateado.

Los resultados de este estudio indican que los ensayos de ICS pueden, razonablemente, ser uniformes entre sitios, pero que las consideraciones de modelo de formato y espera respuesta de los niveles pueden influir en la precisión de los resultados. Estos datos deben guiar ICS resultados de las comparaciones entre los diferentes grupos o en diferentes ensayos clínicos.

Heparinizadas toda la sangre se recogió de los voluntarios sanos seropositivos para CMV experimentos 1 y 2. Para el experimento 1, la sangre se activó en 15 ml cónicos de acuerdo con el método de Nomura et al. [6]. Activado sangre fue tratada con 2 mM concentración final de EDTA durante 15 minutos a temperatura ambiente, luego de 10 volúmenes FACS Lysing Solución (BD Biosciences, San Jose, CA) se añadieron. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, los tubos fueron congeladas a -80 ° C, y luego enviadas a los laboratorios participantes en el hielo seco. El protocolo utilizado por cada laboratorio para la manipulación de estas muestras se presenta en el Archivo Adicional 1.

Para el experimento 2, 5 mL de sangre total heparinized noche a la mañana se entregará dentro de un contenedor aislado a la temperatura ambiente de laboratorio a cada participante. El protocolo utilizado por cada laboratorio para la manipulación de estas muestras se presenta en el Archivo Adicional 2.

Para los experimentos 3 y 4, leukapheresis de PBMC de donantes CMV seropositivos se aislaron mediante gradiente de Ficoll separación. Posteriormente fueron criopreservados de acuerdo con un protocolo estándar (Disis et al., Presentado para su publicación). Estos criopreservados PBMC fueron enviadas a los laboratorios participantes utilizando nitrógeno líquido seco cargadores. El protocolo utilizado por cada laboratorio para la descongelación y el tratamiento de estas células se ofrece a los ficheros adicionales 3 y 4.

La citometría de flujo de instrumentación utilizada en este estudio incluyó 12 BD FACS Caliburs (BD Biosciences), 3 BD LSRIIs (BD Biosciences), y el 1 de CyAn (Dako Cytomation, Fort Collins, CO). Instrumento de configuración se deja a la discreción de cada laboratorio, y fue ya sea manual (utilizando células teñidas isotipo control para definir PMT voltajes, y solo las células teñidas para fijar la indemnización) o automatizado (BD usando FACSComp software y BD Calibrite cuentas (BD Biosciences) ). En algunos laboratorios, configuración automatizada fue seguido de ajuste manual mediante células teñidas como anteriormente.

FCS original de los archivos de cada sitio fueron enviados a BD Biosciences para su análisis utilizando un modelo dinámico de gating (Figura 2B]. Esta plantilla se construyó con "Snap-Para Gating" y "Tethering" herramientas disponibles en el software Pro CellQuest (BD Biosciences). La forma de las puertas a snap-se determina por un algoritmo de clustering, y este algoritmo permite su movimiento de la muestra en una muestra de datos de forma dependiente. El tamaño y la cantidad de movimiento de cada admisibles de snap-se ajustó a la puerta de la inspección de un subconjunto de los archivos que se utilizarán, con iterativo cambios que se están realizando hasta que la plantilla realizó tal como lo desea. La plantilla fue utilizada, sin más ajuste, en todos los archivos de un determinado experimento. Desde la plantilla se generó en CellQuest software Pro, sólo los archivos generados en la FACS Calibur instrumentos fueron analyzable por este método.

El CV% se calcula como 100 * SD / media para cada muestra, desde el porcentaje de citoquinas de las células positivas comunicadas por cada laboratorio o derivados de la centralización de análisis que muestra. El promedio de CV para cada experimento se tomó como la media de toda la muestra individual de CV. Significación estadística de las diferencias en el promedio de CV entre los experimentos se calculó utilizando una prueba de Kruskal-Wallis, Dunn con la prueba de comparación múltiple para determinar dónde se encontraron diferencias significativas. La importancia de la diferencia entre individual y centralizada los datos analizados se calculó comparando el total de los CV de todas las muestras de todos los experimentos utilizando una prueba de los rangos con signos de Wilcoxin acompañado por pares. Una de dos colas de prueba t de Student se utilizó para calcular la importancia de las diferencias de fondo entre o dentro de los experimentos.

HTM compilado los datos y redactó el manuscrito. AR coordinó el estudio. P.D 'S. JD garantizados y apoyo logístico y financiero. Todos los autores contribuido a la concepción del estudio, bajo la supervisión y / o llevado a cabo los experimentos, y siempre los comentarios editoriales y de la asistencia.