Journal of Nanobiotechnology, 2005; 3: 7-7 (más artículos en esta revista)

Microcontact impresión directa de oligonucleótidos para aplicaciones biochip

BioMed Central
Thibault C (cthibaul@laas.fr) [1], V Le Berre (leberre@insa-toulouse.fr) [2], S Casimirius (scasimir@laas.fr) [1], E Trévisiol (trevisiol @ insa-toulouse . Fr) [2], J François (fran_jm@insa-toulouse.fr) [2], C Vieu (vieu@laas.fr) [1]
[1] LAAS-CNRS, 7, avenue du Colonel Roche 31077 TOULOUSE Cedex 4
[2] Biochips Plataforma Genopole Toulouse, CNRS-UMR 5504 INRA y 792, 135, avenue de Rangueil, 31077 TOULOUSE Cedex 4
[3] Laboratoire de Biotechnologie & Bioprocédés, CNRS-UMR 5504 INRA y 792, 135, avenue de Rangueil, 31077 TOULOUSE Cedex 4

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

Un paso crítico en la fabricación de los biochips es la colocación de sondas controlado moléculas sobre superficies sólidas. Este es actualmente realizado por la deposición secuencial de las sondas en la superficie con un objetivo dividir o sólidos pins. En este artículo, presentamos un procedimiento económico a saber microcontact impresión utilizando sellos, de un paralelo deposición de las sondas aplicables para la fabricación de biochips.

Resultados

Contrariamente a un trabajo anterior, nos demostró que los sellos diseñados con un elastómero poli (dimethylsiloxane) material no requiere ninguna modificación de superficie para poder absorber oligonucleótidos o productos de PCR. Las moléculas de ADN son adsorbidos posteriormente impreso de manera eficiente en la superficie con un objetivo de alta resolución sub-micron. En segundo lugar, puso de manifiesto que las sucesivas estampación se caracteriza por un decaimiento exponencial de la cantidad de moléculas de ADN transferido a la superficie hasta el 4 º de impresión, a continuación, seguida de un segundo régimen de transferencia que dependía del tiempo de contacto y que se han traducido en una disminución de la calidad De las características. Así pues, si bien era posible sacrificio consecutivos, este procedimiento resultó ser menos reproducible y más tiempo que la simple re-entintado entre cada uno de los sellos de impresión. En tercer lugar, puso de manifiesto que la hibridación señales sobre matrices hechas por microcontact impresión fueron de 5 a 10 veces más altas que las manchas de sangre realizados por métodos convencionales. Por último, hemos demostrado la validez de este método de impresión microcontact oligonucleótidos en la fabricación de matrices para el reconocimiento de mutaciones en un gen de levadura.

Conclusión

El microcontact impresión puede ser considerado como un nuevo potencial de la tecnología de plataforma de microarrays de ADN patrón que puede tener importantes ventajas frente a la detección de las tecnologías convencionales, ya que es fácil de aplicar, que utiliza materiales de bajo costo para hacer el sello, y los arreglos realizados por esta tecnología Son 10 veces más sensibles en el plazo de las señales de hibridación que los fabricados por la tecnología convencional manchado.

Antecedentes

DNA microarrays han evolucionado rápidamente hasta convertirse en una de las herramientas esenciales para investigar o mutación de expresión de miles de genes simultáneamente. Dos principales plataformas de tecnología para la fabricación de chips de ADN han surgido. La primera plataforma utiliza la inmovilización de los prefabricados o oligonucleótidos de ADN sobre manchas de vidrio funcionalizadas diapositivas usando las patillas de metal como originalmente desarrollado por Brown y colaboradores (véase http://cmgm.stanford.edu/pbrown/index.html], o por un no - Utilizando el método de contacto piezoeléctrico manipulación de líquidos [1]. El segundo se basa en la plataforma directa in situ síntesis de oligonucleótidos (entre 20 a 70 agricultores en general) diapositivas sobre vidrio o superficies de silicio, desarrollado por Affymetrix o Agilent [2]. Una característica típica de estas técnicas es la naturaleza secuencial del proceso. Una molécula es depositado después de otra o de una base se añade a la anterior, con la consecuencia de que cada variedad se hace como un original con un menor rendimiento, aunque Affymetrix microarrays combinatoria implica procesos de fabricación que permiten múltiples microarrays (alrededor de 96) que se sintetizan En paralelo en materia de horas. Sin embargo, estas plataformas tecnológicas necesidades equipos sofisticados, lo que arrays de alta densidad que puede ser demasiado caro para la producción y la utilización de simple-personalizado-arrays de ADN.

Existe la necesidad de métodos alternativos patrón que debe ser muy simple, reproducible, rentable, y, finalmente, transferibles a cualquier laboratorios para su propia problemática. El microcontact impresión (μ PC) puedan cumplir con este requisito, ya que es una tecnología de impresión que utiliza barato sellos elastoméricos hecho generalmente de polidimetilsiloxane (PDMS) y que exhibe patrones de socorro en la nanoescala micras y [3]. Estos sellos dejar paralelo a la deposición de las moléculas sobre un objetivo de superficie, de la misma manera que la impresión de una página del libro en vez de ser una carta escrita individual para componer la página. Trabajos anteriores demostraron que las proteínas se pueden depositar en la superficie de un sustrato microcontact impresión (μ CP) [4, 5]. Más recientemente, Lange et al. [6] mostraron que μ CP técnica puede ser utilizada para depositar moléculas de ADN PDMS con una superficie de la tinta del sello modificado químicamente para que la moléculas de ADN se bloquee en el sello. Esta funcionalización paso restringido fuertemente de la velocidad de esta tecnología, ya que se necesitan varias horas de la conversión de la CH 3 de la superficie terminada PDMS aminated en una superficie total de tinta de los sellos antes de la impresión de la superficie objetivo.

En este trabajo se μ CP demostrar que se puede utilizar para fabricar biochips de ADN directamente sin ningún tipo de modificación de superficie de los sellos. Se demuestra que a veces en contacto con tinta y de menos de 30 segundos de la máxima calidad y de alta resolución por arrays μ CP. Según nuestra nueva variante del proceso, no es más que el sello entintado con las moléculas de interés, se secaron con una corriente de nitrógeno y luego impresas manualmente en la superficie de sustrato (ver Fig. 1]. Se prevé que esta plataforma tecnológica será altamente competitivo de alto rendimiento para el análisis de la expresión génica y análisis de detección de mutaciones. Además, esta técnica puede ser fácilmente implementado para sub-patrones micras como se ha demostrado anteriormente [6] y en este trabajo.

Resultados y Discusión

Las dos principales medidas de μ CP son la adsorción de las biomoléculas en el sello (entintado proceso) y la transferencia de la estampilla a un objetivo de superficie (en contacto con la impresión). Es importante que la retención de las moléculas en la superficie sello no impide su posterior transferencia a la diapositiva, y que la tinta y el tiempo de contacto son lo más breve posible para optimizar el alto rendimiento de la técnica. En un reciente trabajo [6], este compromiso se logró por medio de un tratamiento químico de la elastoméricos poli (dimethylsiloxane) material (PDMS) de la tinta del sello después de moldeo. En contraste con este informe, encontramos que sin tratar PDMS sello que tiene un fuerte hidrofóbico de la superficie después de curado, fácilmente absorbido una cantidad suficiente de moléculas de ADN dentro de unos segundos, al tiempo que permite su posterior deposición por contacto de diapositivas o microscopio de vidrio de silicio. El proceso de impresión de las obras sin tratar superficies de cristal o la silicona, pero real bioensayos se llevaron a cabo sobre las superficies de cristal tratado vinculante que permita fuerte de las moléculas de la sonda. Durante el contacto, el objetivo es transferir de manera eficiente y lo más rápido posible las moléculas de la superficie sello a la diapositiva sin afectar el tamaño de los patrones. Un específicos de química en la superficie de la diapositiva también es importante para la fijación de las sondas después de quitar el sello de la superficie. Asimismo, hemos verificado que los sellos pueden ser reutilizadas varias veces después de la limpieza en agua desionizada. Los experimentos se detallan a continuación tienen por objeto la investigación de la influencia de varios parámetros, entre ellos la química de la superficie de la diapositiva, la tinta y el tiempo de contacto de la tinta del sello, y para demostrar la potencialidad de esta técnica de biochips real.

Superficie de la química y de gran uniformidad de la impresión en blanco ADN superficies

Los experimentos reportados en el presente trabajo se llevaron a cabo utilizando dos tipos diferentes de vidrio diapositivas que difieren por su superficie funcionalización: carga positiva amina vidrio diapositivas (Ultra Gap, Dow corning) y dendrislides, que son láminas de vidrio que se han funcionalizado con nanométricos partículas esféricas dendrimeric Teniendo aldehídos grupo reactivo en la periferia de covalentes archivo adjunto de la 5'-NH 2 sondas [7, 8]. Estos dos tipos de funcionalizadas diapositivas se imprimieron durante 15 segundos con un sello que ha sido incubados durante 30 segundos con una solución de 10 μ M de 35-tarios 5'-NH 2-Na sonda en el buffer fosfato a pH 9,0. Hibridación se logró utilizando un 15-mer 5'Cy5 complementarias a la meta 35-mer 5'-NH 2 sonda. Como se muestra en la Fig. 2, el micronic características de la estampilla (plazas, discos, artes, cruces, espirales, ...) se observa claramente en los dos tipos de láminas de vidrio. Sin embargo, se observó sistemáticamente una mayor relación señal / ruido, una mejor uniformidad y definición borde de las manchas con dendrislides (Fig. 2B] que con diapositivas electrostática (Figura 3A]. Este resultado es coherente con nuestro informe anterior que la funcionalización de la superficie con dendrimers reduce la adsorción no específica de material fluorescente [8]. Además, el "donut" formación de manchas frecuencia obtenido después de la deposición de las moléculas de ADN por contacto con manchas ya no se observa desde la CP μ es una "seca" la técnica de deposición. Esto permite un mejor tratamiento de las imágenes de fluorescencia para el análisis cuantitativo. La parte superior de la Fig. 2C muestra algunas líneas en la matriz que presentan un lanzamiento de 4 μ m, que sólo puede ser visto como muy pequeñas manchas de color rojo fluorescente, porque el escáner no puede resolver las características. Un aumento de las características convencionales (es decir, las plazas y los discos) se muestra en la Fig. 2D. En esta imagen, el contorno de los patrones era borrosa principalmente por el tamaño de pixel de los escáner. Con el fin de permitir Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) caracterización, submicrónicos características fueron impresas en la superficie de silicio en vez de láminas de vidrio para minimizar la rugosidad de la superficie. Estos patrones consistió en un periódico gama de 500 nm de ancho líneas en un tono de 1 μ m. Como se muestra en la Fig. 3, de 500 nm de ancho líneas son claramente visibles y los oligonucleótidos impresos aparecen como pequeños agregados que podrían distinguirse de la superficie lisa del sustrato de silicio. Es digno de notar que en este caso la superficie de la muestra no podía ser enjuagados después de la impresión, debido a la falta de tratamiento de superficie de silicio no proporciona fuerte adhesión de moléculas de ADN. Edge rugosidad y pequeños agregados visibles en la imagen puede ser atribuido posiblemente a los residuos procedentes de la solución tampón.

Entintado tiempo

En nuestro primer juicio, el moldeado PDMS sellos fueron incubados a temperatura ambiente en los oligonucleótidos solución a diferentes tiempos que van desde 30 segundos a 1 hora y, a continuación, impresos en una dendrislide después del secado. En estas condiciones, una muy alta y saturar fluorescentes intensidad se obtuvo independientemente de la tinta tiempo, probablemente porque la cantidad de moléculas de ADN fluorescente transferido a la superficie ya estaba muy alto en el más breve tiempo tinta a prueba. Es incluso posible observar efectos nocivos de la excesiva tinta veces debido al exceso de material fluorescente depositado en la periferia de la estampilla (datos no presentados). Estos resultados indican que la superficie PDMS fue saturado con moléculas de ADN en menos de 30 segundos de tinta. Por lo tanto, la reducción de la tinta a un período de tiempo que es fácilmente compatible con un procedimiento de manipulación de los sellos, es decir, 15 segundos.

Para explicar el excelente rendimiento de esta técnica de impresión para sondas de ADN, sugerimos que una interacción hidrofóbica tiene lugar entre el PDMS superficie de la tinta del sello y único capítulo moléculas de ADN, ya que la superficie es muy PDMS hidrofóbica, y el filamento de la DNA también pueden exhibir hidrofóbica Propiedades a través de sus bases de contenido, a pesar de que es una molécula hidrofílicos. Por otra parte, las interacciones hidrofóbicas son de 10 a 100 veces más fuerte y tienen un radio de acción más largo que el de Van der Waals interacciones [9, 10]. Por otra parte, una rápida y eficiente transferencia de las sondas de ADN de la estampilla a la diapositiva que requiere la interacción entre las fuerzas y los oligonucleótidos PDMS superficie debe ser más débiles que las que ocurren entre los oligonucleótidos y la superficie de la diapositiva. Esto fue verificado en nuestros experimentos para ambos carga positiva y hidrofóbico dendrimeric activado superficie diapositivas. Como consecuencia de ello, la preservación de la hidrofobicidad de la PDMS sello es claramente un punto clave con el fin de reducir los tiempos de tinta para la impresión de ADN y favorecer la posterior transferencia de las moléculas ya sea a un acusado o de una superficie hidrofóbica. Esta es la principal diferencia entre nuestro trabajo y el de Lange et al [6]. En este último trabajo, la adsorción de las sondas de ADN en el sello se basó principalmente en la interacción electrostática con la consecuencia de tinta largo período (45 min.). Además, como el tratamiento de la superficie de PDMS es conocido por ser inestable en el aire, nuestro proceso, que no implica ninguna modificación de superficie después de moldeo, debe ser más reproducible y debe permitir la reutilización de la estampilla (véase más adelante). Vale la pena señalar que resultados similares fueron obtenidos en largo solo moléculas de ADN o PCR fragmentos doble varados. Sin embargo, como puede observarse en la Fig. 4, la intensidad de la señal fue significativamente menor con el sello de productos de PCR con oligonucleótidos. Esta observación no es en realidad específica a esta técnica ya que los mismos resultados se observaron usando métodos convencionales de fabricación de matrices de mecánica manchado (V. Le Berre, datos no publicados).

Tiempo de contacto y de las sucesivas impresiones

Para identificar los mecanismos de transferencia de las moléculas de la superficie sello a la diapositiva, se determinó la influencia del tiempo de contacto y de la evolución de las señales fluorescentes después de las sucesivas impresiones con el mismo sello cargado con un fluorescente de 35 mer 5'-etiquetados Cy5 - Oligonucleótido 3'NH-2 (5'Cy5-TTAGCGCATTTTGGCATATTTGGGCGGACAACTT-NH 2 -3 '). En la misma diapositiva, sellado de pasos consecutivos se realizaron con un tiempo de contacto de 15 segundos, 1 minuto o 2 minutos, que tuvo un total de 2 a 20 minutos a un patrón dendrislide con 10 copias sucesivas. Para evaluar el cambio en la intensidad de fluorescencia a lo largo de las sucesivas imprimir, el total de la intensidad resta del fondo local de características específicas sobre el modelo de la diapositiva y se integraron en comparación con el total de la intensidad de la primera impresión que se fijó arbitrariamente en un 100%. Como se muestra en la Fig. 5, este cambio siguió a un decaimiento exponencial hasta el 4 º estampación, y sorprendentemente, esta decadencia depende del tiempo de contacto. La siguiente ecuación

-dN/dn = KN

Donde N es el número de moléculas depositadas en la diapositiva en el número n de impresión, se podría utilizar para determinar la característica de k, una especie de escollo coeficiente de las moléculas en la superficie. Obtuvieron los valores de la k resultó ser depende el tiempo de contacto, con k, como el aumento de la disminución de tiempo de contacto (k = 1,36 para t = 15 s, k = 0,67 para t = 1 min, k = 0,57 para t = 2 min ). Este resultado indica que el tiempo de contacto más largo, más lento es el agotamiento de la estampilla en biomoléculas. Este comportamiento es sugerente de una lenta difusión de las moléculas de mantenerse dentro de la cavidad del sello PDMS su socorro a las estructuras que están en contacto con las diapositivas, como se muestra en la Fig. 6. Por tanto, se espera observar un lento descenso de la intensidad de fluorescencia para aumentar el contacto con los tiempos porque hay más tiempo para las biomoléculas a migrar a la superficie. Además, se calculó que el coeficiente k unos cambios con la inversa de la raíz cuadrada del tiempo de contacto, que es coherente con una difusión limitada mecanismo de la deposición. En consecuencia, el decaimiento exponencial de la señal de fluorescencia ya no es válido después de las 4 de impresión pasos sucesivos (Fig. 6]. Para n> 4, el número de moléculas inicialmente adsorbido en el socorro de las estructuras de la PDMS sello se ha agotado en gran medida las impresiones anteriores. Sin embargo, una baja intensidad de la fluorescencia disminución muy lentamente a partir de la 5 ª a la 7 ª de impresión sigue siendo medido. Esto sugiere una lenta difusión de las moléculas de los bordes de la estructura de las diapositivas durante el contacto. En ese caso, el número de moléculas de impreso debe ser más alto en la periferia de las características que en el centro. La fluorescencia imágenes de la 5 ª a la 7 ª de impresión para un tiempo de contacto de 2 min muy bien confirmado esta hipótesis (Fig. 7]. Esencialmente los bordes de las características específicas son reconocibles porque probablemente el resto de las moléculas tenido tiempo suficiente para migrar de los bordes de la impresión de socorro de la estampilla a la superficie de cristal durante el tiempo de contacto. Así, en tiempos de contacto más cortos, la fluorescencia imágenes fueron aún peor (no se muestra), y, por tanto, la intensidad de los valores fueron menores (véase la Fig. 5].

Como conclusión de este apartado, claramente identificado algunos problemas relacionados con la difusión de las biomoléculas durante sellado que pueden perjudicar a la producción de alta calidad por los sucesivos arreglos de estampación sin tinta de nuevo. Por otra parte, teniendo en cuenta que la carga de la tinta del sello es muy rápida y de alta calidad que por la deposición μ CP de moléculas de ADN tarda menos de 15 segundos para dar señales de fluorescencia óptimo, parece más favorable para volver a la tinta del sello durante 15 -- 30 segundos después de cada impresión, que es más rápido que el tiempo de impresión consecutivos.

Comparación entre μ CP y en contacto con la deposición de la deposición de metales utilizando las patillas

Con el fin de comparar μ CP manchado con un método convencional, se realiza un experimento dedicado en el que la intensidad de fluorescencia de ADN array se determinó en función de la concentración de ADN de la sonda utilizada para la fabricación de las diapositivas por las dos técnicas. Para permitir una comparación directa entre los dos métodos, spots de 60 μ m de diámetro tamaño realizados con diferentes concentraciones de 20-mer de oligonucleótidos HSP12 fueron avistados con un comercial situador (VersArray ChipWriter Pro, Biorad empresa) en un dendrislide, y discos de la misma Dimensión se imprimieron por μ CP, en las mismas condiciones. Los arrays luego se hibridó con la etiqueta moléculas complementarias. Fig. 8 muestra la evolución de la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias como una función de la concentración inicial de la sonda. A partir de una gama de 0,1 a 10 μ M, la señal de fluorescencia fue de 5 a 10 veces más altos que cuando se realizó el depósito por μ CP que por un situador convencionales. Esta gran diferencia se explica por el hecho de que la deposición con un sello seco en el que las moléculas de ADN se entregan en la frontera entre los materiales elastoméricos y de la superficie de diapositivas podría ofrecer uniforme capas de moléculas densamente empaquetadas. Por el contrario, la deposición de una gota de líquido sobre la superficie de deslizamiento, que es dejar que se evapore, puede dar irregulares capas de moléculas dispersas. Como alternativa o complemento a esta explicación, es posible considerar que las sondas impreso en la superficie por μ CP están mejor organizados que por manchas, lo que permite una mayor cantidad de metas accesibles a las sondas. En cualquier caso, para una determinada relación señal a ruido, la cantidad de moléculas de la sonda es significativamente menor para obtener el mismo hibridación señales usando μ CP, en comparación con la detección de la tecnología. Esto podría ser en el futuro una razonable de las ventajas de esta técnica teniendo en cuenta el prohibitivo precio de la sonda de moléculas de ADN. Además, este proceso de impresión es versátil y también da excelentes resultados con más moléculas de ADN o PCR fragmentos doble varados.

Detección de mutaciones

Habiendo demostrado que se puede oligonucleótidos con éxito en varias copias impresas, con un rendimiento uniforme de las pautas, se determinó la posibilidad de fabricar una gama corta teniendo oligonucleótidos de un determinado gen por μ CP para la detección de una única mutación, ya que se pueden hacer con la tecnología de microarray de ADN [11 , 12]. Tenemos 5 diferentes impreso 20-mer de oligonucleótidos HSP12, la codificación de una proteína acompañante en la levadura [13]. Estos sondeos difieren unos de otros por una sola o una doble base de la mutación en las posiciones próximas al 5 'o 3' final o en medio de la secuencia. Estos oligonucleótidos fueron hibridada con Cy5-etiquetados preparado a partir de cDNA de RNA total de levadura (véase el método de la sección para más detalles) en la sala de hibridación automática. Se comparó la intensidad de la hibridación de la meta moléculas en el impreso que, a partir de las pautas con el objetivo perfectamente coincidentes a la secuencia de 20-mer oligonucleótido sonda. Hemos observado que, independientemente de la posición y la naturaleza de la mutación, la señal de hibridación se redujo considerablemente para la mutación de las secuencias. Como era de esperar, la posición de la mutación a lo largo de la secuencia de la sonda molécula fuertemente influido en la tasa de hibridación (Fig. 9]. Este experimento se repitió 4 veces independiente y arrojado datos altamente reproducibles con una desviación estadística de <1%. En conjunto, estos resultados son muy similares a los obtenidos utilizando microarrays fabricados con dendrislides manchado por un método convencional [7]. Esto indica que la calidad de los arrays impresos por μ CP con respecto a la hibridación de ensayo es en gran medida equivalente a la producida por vectores convencionales de las técnicas de deposición.

Conclusión

En este trabajo se demostró que μ CP es un nuevo potencial de la tecnología de plataforma de microarrays de ADN patrón en una relativamente alta velocidad, alta resolución y alta reproductibilidad. Dos elementos adicionales que pueden ofrecer importantes ventajas de esta tecnología sobre la detección de las tecnologías convencionales son: (i) la simplicidad de la CP μ asociados con el bajo costo del material empleado para hacer el sello, y (ii) los arreglos realizados por μ CP tecnología Proporcionar 10 veces superior después de la intensidad de fluorescencia de hibridación comparar a los fabricados por la tecnología convencional manchado. Con estas ventajas en mente, nuestro siguiente paso será la fabricación de un dedicado automático X, Y, Z controlada herramienta para la impresión de diferentes moléculas de la sonda con un alto rendimiento. En el futuro, CP μ puede ayudar a simplificar, acelerar y mejorar la fabricación de microarrays y aumentar significativamente su fiabilidad y accesibilidad es decir, en aplicaciones clínicas.

Métodos
Sello de fabricación

El primer paso consiste en la fabricación de la generación de un maestro de silicio. Esto se logró por la proximidad de una UV fotolitografía Si [100] revestidos con láminas positivas resistir (AZ 1529), y el modelo de transferencia de profunda reactiva Ion Aguafuerte (1,4 μ m de profundidad). Por submicrónicos patrones, la litografía de haz de electrones sobre PMMA (PolyMethylMetAcrylate) se utilizó en lugar de los rayos UV y la fotolitografía etch a fondo se limitó a 100 nm. Para habilitar la simple demoulding de este maestro, un anti-adhesivo tratamiento se lleva a cabo utilizando silanisation en fase líquida con la OET (octadecyltrichlorosilane). El paso final consiste en la cura de la pre-polímero PDMS solución que contiene una mezcla (10:1 ratio de masa) de PDMS oligómeros reticular y un agente de Sylgard 184 Kit (Dow Corning) en el maestro de silicio. El PDMS fue curado térmicamente a 120 ° C durante 90 minutos o durante 12 horas a 80 ° C (ambos métodos da resultados similares de estampación). Un maestro de silicio se puede reutilizar más de 50 veces y cada sello puede ser usado para un gran número de impresiones (> 100).

Química de la superficie del sustrato

Dos tipos de microscopio de vidrio diapositivas se utilizan para la impresión en manchas y las sondas. El uso de "electrostática" láminas de vidrio que son de carga positiva de aminas vaso diapositivas (Ultra Gap, Dow corning), el impreso / sondas fueron avistados vínculos cruzados, en la superficie de amina por la luz UV a 300 mJ. Con dendrislides (hecha en casa con la generación de diapositivas 4 dendrimers, ver [7], y nuestro sitio en la red: http://biopuce.insa-toulouse.fr], un archivo adjunto covalente de la sonda sobre la superficie de cristal a través de la función aldehído dendrimers Se realizó [8, 9]]. Después de manchas, la dendrislides se deja secar a temperatura ambiente durante la noche. La reducción de la función imines formado entre sondas y dendrimer fue llevado a cabo por inmersión de las diapositivas en una solución que contenga NaBH 4 en 3,5 mg / ml durante 3 horas a temperatura ambiente bajo agitación. El ADN diapositivas fueron lavados tres veces en el agua durante 2 minutos, a temperatura ambiente y luego se secaron con una corriente de nitrógeno.

Stamping proceso

Sellos fueron incubadas con 2-20 μ l de un 10 μ M oligonucleótido realizados en la solución de Na-buffer fosfato 0,3 M, pH 9 por sólo 30 segundos (a menos que se menciona diferente) y, a continuación, soplado secado bajo una corriente de nitrógeno. Luego, el sello fue impreso manualmente en la superficie del sustrato y de la izquierda en el lugar durante un tiempo de contacto controlado. Un 35-mer 5'-etiquetados Cy5-oligonucleótido 3'NH-2 (5'Cy5-TTAGCGCATTTTGGCATATTTGGGCGGACAACTT-NH 2 -3 '), 35-mer 5'-aminoácidos modificados (5'NH 2-GTGATCGTTGTATCGAGGAATACTCCGATACCATT) y 70 -- Mer 5'NH 2 oligonucleótidos correspondientes a la levadura gen HSP12 (de Qiagen / Operon levadura conjunto) fueron utilizados en la impresión en manchas y experimentos. La PCR es un fragmento de 500 pb en la amplificación de fragmentos de genes HSP12 usando primers universal, tal como se describe en otro lugar [7].

Preparación de los objetivos de la etiqueta

El objetivo es un 15-mer 5'-etiquetados Cy5 oligonucleótido (Cy5-AATGGTATCGGAGTA) complementario del 35-mer sondas (5'NH 2-GTGATCGTTGTATCGAGGAATACTCCGATACCATT). Otros objetivos fueron preparados a partir de RNA total de levadura en forma de plantilla por la incorporación de la etiqueta fluorescente-Cy5 o Cy3-dCTP primera posición durante la síntesis de ADNc. El etiquetado de reacción y purificación de cDNA se llevó a cabo con 15 μ g de ARN total LabelStar utilizando el Kit de Qiagen siguiendo las instrucciones del fabricante.

Hibridación

En los experimentos iniciales, la hibridación se llevó a cabo en una hibridación de cassette (Corning Inc), de acuerdo con el protocolo estándar utilizado en el laboratorio para la tecnología de microarrays http://biopuce.insa-toulouse.fr en presencia de 20 μ l de solución que contenga 16,5 Μ l Dig Fácil de amortiguación (Roche Diagnostic), 1 μ l de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 2,5 μ l de la etiqueta meta y cubierto con una cubierta 2,2 cm 2 slip uniformados para lograr una reacción de hibridación durante 15 min. Después de la hibridación, las diapositivas se lavaron por 2 min de 2 × SSC/0.1% (v / v) SDS, 2 min en SSC/0.1 × 0,2% (v / v) SDS y 2 min en 0,2 SSC a temperatura ambiente, y Luego se secaron con una corriente de nitrógeno. En experimentos informó acerca de la figura 8, la hibridación se llevó a cabo con una sala de hibridación automática (Descubrimiento de Ventana Medical System, Inc). Prehybridization se llevó a cabo con una solución recién preparada de un 1% de BSA, 2 × SSC, 0,2% SDS durante 1 h 30 a 42 ° C. Después de lavado automático de acuerdo con el fabricante de instrucciones, las diapositivas se hibridó durante 8 horas en un 200 μ l de buffer ChipHybeTM (Ventana Medical System, Inc), que contiene 20 μ l de la etiqueta y purificado cDNA.Fluorescence de imágenes. Fluorescente imágenes fueron capturados con el escáner láser GenePix 4000 B de Axon apropiado en los niveles de sensibilidad fotomultiplicador (PMT). El escáner de correr y recoge datos en 5 μ m pasos, y luego los datos en promedios de 10 μ m píxeles. Para corregir el tratamiento de datos, sólo las características más grande que 10 μ m se utilizaron.

Contribuciones de los autores

CT y VL llevó a cabo la parte biológica y tecnológica de la obra y escribió el primer borrador del manuscrito. ET llevaron a cabo parte de la química en el estudio. JF y CV concebido del estudio, participó en el diseño de los experimentos, y ultimó la redacción del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por la CE, proyecto financiado por NaPa (Contrato n ° NMP4-CT-2003-500120, a CV) y por Genopole Toulouse Midi-Pyrénées (JF). El contenido de este trabajo es de exclusiva responsabilidad de sus autores.