Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 24-24 (más artículos en esta revista)

La placenta RCAS1 expresión durante muertos

BioMed Central
Lukasz Wicherek (mowicher@cyf-kr.edu.pl) [1], Marek Klimek (mmklimek@mp.pl) [1], Artur Czekierdowski (a.czekierdowski @ am.lublin.pl) [2], Tadeusz Popiela J (Msjpopie@cyf-kr.edu.pl) [3], Krystyna Galazka (bengot@wp.pl) [4], Tomasz Tetlak (hugo@autocom.pl) [1], Andrzej Gilowski (gyninf@su.krakow. Pl) [1], Magdalena Dutsch-Wicherek (mowicher@cyf-kr.edu.pl) [5]
[1] Departamento de Ginecología y Infertilidad de la Universidad Jagellónica, 23 Kopernik Str, 31-501 Cracovia, Polonia
[2] I. Departamento de Ginecología de la Universidad de Medicina de Lublin, 16 Staszica Str, 20-081 Lublin Polonia
[3] Departamento de Radiología de la Universidad Jagellónica, 19 Kopernik Str, 31-501 Cracovia, Polonia
[4] Departamento de Pathomorphology Universidad Jagellónica, 17 Grzegórzecka, 31-531 Cracovia, Polonia
[5] Departamento de ORL de la Universidad Jagellónica, 2 Sniadeckich Str, 31-531 Cracovia, Polonia

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Resumen

Antecedentes: Independientemente de la causa de muerte fetal, el comienzo y el curso de la muerte está estrechamente relacionada con la creciente actividad citotóxica en el interfaz materno-fetal. RCAS1 participa en la inhibición de la respuesta inmune materna durante el embarazo. El RCAS1 alteraciones de la expresión de la proteína en células de la placenta parecen determinar el comienzo de la mano de obra y participar en el desprendimiento placentario. El objetivo del presente estudio fue investigar RCAS1 expresión en placentas obtenidas a raíz de mortinatos o plazo normal de nacimientos. Métodos: RCAS1 expresión fue evaluada por el método Western blot con el uso de monoclonales anti-RCAS1 de anticuerpos en 67 muestras de tejido placentario. Las mujeres embarazadas fueron divididas en cuatro grupos según el modo de trabajo de inicio - espontáneo o inducido, y el tipo de mano de obra, muerte o mano de obra a término. Placentaria beta-Actina expresión fue elegido como el control de la proteína. Cantidades relativas de la placenta RCAS1 se compararon con el uso de la prueba t de Student, mientras que los beta-Actina control de los datos fueron comparados con el uso de Mann-Whitney U test. Resultados: La media de la cantidad relativa de RCAS1 fue significativamente menor en las mujeres con inducido muertos que en las mujeres con trabajo de parto al término inducida. Del mismo modo, considerablemente inferior RCAS1 placentaria niveles se observaron en pacientes con espontánea muertos que en las mujeres con trabajo de parto espontáneo a término. RCAS1 diferencias significativas en la expresión, también se observaron con el respeto al principio de la muerte: espontánea e inducida. RCAS1 placentaria niveles más bajos se observaron en las mujeres con muerte fetal espontánea. Conclusiones: Estos resultados preliminares indican que las alteraciones de RCAS1 expresión en la placenta humana puedan participar en los cambios del sistema inmunológico de la madre que tienen lugar durante la muerte fetal.

Antecedentes

Dinámica del crecimiento fetal observadas entre 20 ª y 28 ª semana del embarazo se acompaña de la maduración fetal, que permite seguir sin complicaciones extra-uterino crecimiento. El desarrollo fetal es posible gracias al fenómeno de la tolerancia inmunológica materna a los antígenos fetales. Graves perturbaciones del crecimiento fetal, en algunos casos, podría resultar en muerte fetal intrauterina. Algunas de las más comunes causas de muerte fetal, que constituyen alrededor del 50% de todos los casos son trastornos de la maduración placentaria y fetal, malformaciones congénitas [1]. La muerte fetal puede ser considerado una forma de trabajo complicado vaginal. Independientemente de la causa de muerte fetal, el comienzo y el curso de la muerte está estrechamente relacionada con la creciente actividad citotóxica en el interfaz materno-fetal. Sin embargo, esta actividad no tiene que surgir simultáneamente con la muerte fetal. En algunos casos de muerte fetal no podrán ir acompañadas de las características clínicas de inmediato el inicio de trabajo de parto. Molecular cambios en la membrana de proteínas expresadas por las células trofoblásticas suele dar lugar a comienzos del plazo normal de entrega, pero también se puede encontrar en la muerte fetal. Estas proteínas son necesarias para el desarrollo de la tolerancia inmunológica materna fenómeno. Membrana celular proteínas expresadas por las células trofoblásticas que parece ser responsable de la represión CTLs, dNK y células NK son: Fas / Fas-L, asesino inhibidora familia (KIRs), los receptores de factor de necrosis tumoral (TNF) la familia y otros [2 - 4 ]. Recientemente, un nuevo factor llamado RCAS1 se ha descrito [4 - 6]. RCAS1 es una proteína de membrana tipo II, expresado en extra-velloso cytotrophoblast, vellosidades de histiocitos, endometrio uterino y en diversas células del cáncer humano [7 - 12]. Esta proteína actúa como un ligando para un receptor putativo que pueden estar presentes en los linfocitos periféricos normal como T, B, y las células NK. RCAS1 inhibe el crecimiento de las células que expresan receptores in vitro e in vivo e induce la apoptosis de células de muerte [13]. Principales funciones de RCAS1 incluir el reconocimiento inmune de evitar y eludir la vigilancia inmune por inhibición de la maternidad ataque inmune contra antígenos fetales [4, 5]. El RCAS1 alteraciones de la expresión de la proteína en células de la placenta parecen determinar la aparición de la mano de obra y participar en el desprendimiento placentario [5, 6]. El objetivo de nuestro estudio fue evaluar los cambios de RCAS1 nivel de la placenta durante el mortinatos.

Métodos
2,1. Los temas

Cantidad relativa de RCAS1 contenido se estimó en 67 muestras de tejido placentario tomadas del plazo normal de las entregas y de fetos muertos. El consentimiento informado para la utilización de tejido placentario se obtuvo de todos los pacientes. La aprobación por parte del Comité Ético de la Universidad Jagiellonian en Cracovia (KBET/379/13/2003) para este programa de investigación también se concedió. Stillborns se define como fetos nacidos muertos-ya sea en su conclusión de 23 semanas de gestación, o cuando el peso fetal fue de más de 400 gramos. La autopsia fue realizada en el Departamento de Pathomorphology Universidad Jagiellonian en todos los casos. Basado en el informe de la autopsia, examen que incluyó los casos de muerte fetal intrauterina causada por malformaciones congénitas del feto. De acuerdo con la aparición de muerte pacientes fueron divididos en cuatro grupos. El primer grupo incluyó 6 mujeres en la mano de obra los cuales se indujo a raíz del reconocimiento de la muerte fetal intrauterina. El segundo grupo consistió de las mujeres con 5 muertos con inicio espontáneo del trabajo de parto. Dos grupos de control consistió de las mujeres embarazadas con el plazo normal de nacimiento (37-43 semana completa de gestación), y se seleccionaron de acuerdo con el inicio de trabajo de parto, que fue espontáneo (grupo III) o inducido (grupo IV). El primer grupo consistió de 31 mujeres embarazadas con inicio espontáneo de los partos vaginales precedido por el ordinario de las contracciones uterinas durante la primera y segunda etapa del trabajo de parto. El último grupo incluyó a 25 mujeres con partos inducidos vaginal plazo. Características maternas de las mujeres se muestran en la Tabla 1. Los pacientes con partos pretérmino, corioamnionitis, la hipertensión, la diabetes mellitus y se excluyeron los embarazos múltiples. Todas las placentas son histológicamente examinada por un patólogo experimentado.

2,2 Preparación de los extractos de tejido

Muestras de tejidos (app. 0,5 × 0,5 × 0,5 cm) se obtuvieron a partir de la parte central de la placenta después del parto y recogidos muertos y fueron inmediatamente congelados. El 0,5 cm de espesor muestras de tejido que figuran las vellosidades lámina (extra-cytotrophoblast células de las vellosidades y sinciciotrofoblasto) y las células de la madre decidua compacta (la parte exterior de decidua basal). Las muestras se mezclaron con total inhibidor de proteinasa cóctel (Roche, Alemania) y homogeneizada en baño de hielo en vaso de vidrio Potter-Elvejhem homogeneizadora. Las suspensiones resultantes se mezcla con igual volumen de buffer de lisis SDS muestra (4% SDS, 20% de glicerol, 125 mM Tris-HCl pH 6,8) y el baño de agua hervida por 5 minutos. Las muestras fueron refrigeradas y después se centrifuga a 16000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante recogido se utilizaron para el análisis.

2,3. Western Blot

Total de contenido de proteína en el sobrenadante obtenido se midió usando BCA kit de ensayo y de diferentes volúmenes de muestra (generalmente en el rango de 2-10 μ l) equivalente a 50 μ g de proteína total fueron cargados en SDS-PAGE tris-tricine péptido-que separa geles. Prestained amplia gama estándar de proteínas de peso molecular (Bio Rad, EE.UU.) se utilizó en gel marcador carril. Después de la electroforesis en geles fueron electrotransferred sobre Immobilon-P difluoride polivinilideno (PVDF) 0,45 μ m de membrana (Millipore, EE.UU.) en el buffer que contiene 10 mM 3 - [cyclohexyloamino]-1-propanesulfonic ácido pH (CAPS) 11, complementado con un 10% de metanol . La membrana obtenido blots fueron bloqueadas por la noche a la mañana en ligera agitación en el 5% de albúmina bovina en el buffer de TST (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, el 0,9% de NaCl), 0,5% Tween-20). Todos los procedimientos descritos se realizaron a temperatura ambiente. Solución de albúmina fue descartado y las membranas fueron agitados durante 2 horas en TST con el mouse monoclonal anti-RCAS1 clase de anticuerpos IgM, 1: 4000 dilución (Médica y Biológica Laboratories, Japón). Las membranas fueron luego sometidas a 4 ciclos de lavado en TST, a 5 minutos cada uno, y sumergido en la agitación de 1: 2000 dilución de SIGMA con biotina IgM anti-ratón μ cadena de anticuerpos específicos por un período de 2 horas. Después de 4 ciclos de lavados de las membranas fueron tratadas durante 2 horas en 1: 2000 dilución de ExtrAvidin conjugado fosfatasa alcalina (SIGMA, EE.UU.) y por último lavado 2 veces en TST y 2 veces en TST sin Tween-20. Color reacción se desarrolló con la utilización de Fast Red TR / Naphtol AS-MX conjunto comprimido (SIGMA, EE.UU.). Un suficientes bandas de intensidad se obtuvo generalmente tras un período de 5 min en desarrollo. Immunoblotts obtenidos fueron lavadas con agua destilada y secado al aire. Descripción detallada de la preparación de tejidos y semi-cuantitativos de evaluación y control de RCAS1 beta-Actina cantidades relativas en la muestras de tejidos utilizando la técnica de Western blot se ha presentado en nuestros informes anteriores [5, 6]. El antígeno RCAS1 fue identificado como una banda de 32 kDa y β-actina representaba una banda de 42 kDa [6, 10, 11].

2,4. Asistido por ordenador de análisis de imágenes

Fluor-S MultiImager (BioRad, EE.UU.) se ha utilizado para escanear immunoblotted membranas y un software QuantityOne (BioRad, EE.UU.) se utilizó para cuantificar la intensidad de la banda. Todos los cálculos fueron realizados sobre la banda de antígeno RCAS1 haber masa molecular de aproximadamente 32 kDa [6, 10, 11]. La intensidad de esta banda se expresaron en unidades arbitrarias relativa y una unidad (U) se define como banda de intensidad producidos en la muestra de referencia. Esta referencia muestra fue escogida al azar, pero fue estrictamente el mismo en todos los blots y se aplica siempre en la misma cantidad. Típico procedimiento de cuantificación RCAS1 fue el siguiente: escaneado inmunoblot membrana figura un carril de la masa molecular normas, en tanto que un carril de la muestra utilizada como referencia para calibrar RCAS1 cantidad y 12 carriles que contengan muestras desconocidas. La ubicación de 32 kDa RCAS1 bandas de referencia en los carriles y desconocidos se identifican a través de los carriles que contienen masa molecular estándar. Los 32 kDa RCAS1 intensidades de la banda de referencia y en los carriles eran desconocidos entonces calcula y se expresa en número de unidades de píxel. Estas unidades están divididas por el número de píxeles de referencia carril de la banda que se han traducido en unidades de intensidad relativa "U". El resultado de la intensidad de referencia carril de la banda siempre fue 1,00 U mientras que las intensidades de las bandas de 12 desconocidos muestra carriles en la misma membrana cambiado de acuerdo a RCAS1 nivel (por ejemplo, si RCAS1 en una determinada cantidad de muestra fue de 2 veces mayor que en esta muestra de referencia de la Resultado fue de 2,00 U. RCAS1 Si la cantidad es 2 veces menor, entonces el resultado fue de 0,50 U). Como se mencionó anteriormente, porque todos los immunoblots figura la misma cantidad RCAS1 estándar y todos los carriles fueron cargados con la misma cantidad de proteína total (50 μ g), los valores determinados son muy repetitivas e independiente de las condiciones de la prueba. La cantidad total en RCAS1 examinó muestras de tejidos es relativamente reconocido, que era necesario porque no RCAS1 estándar está disponible. El resultado siempre muestra la cantidad relativa de 32 kD RCAS1 antígeno en 50 μ g de proteína total de la muestra [5, 6].

2,4. Análisis estadístico

La distribución de los temas que se analizaron con el uso de Shapiro-Wilk en la prueba. RCAS1 se compararon con el uso de la prueba t de Student que β-Actina control de los datos fueron comparados con el uso de Mann-Whitney U test. Las diferencias entre los grupos estudiados se consideraron significativos valores de p <0,05.

Resultados

La presencia de RCAS1 expresión fue evaluado en todas las muestras de tejido placentario derivadas de los partos vaginales a término y mortinatos. La cantidad relativa de β-Actina en todos los grupos resultaron ser idénticos (cuadro 2], esto indica que la igualdad de la carga de las proteínas se realizó y permitir un estudio comparativo entre RCAS1 expresión en cada grupo.

El promedio de la cantidad relativa de RCAS1 fue significativamente menor en la placenta obtenida de muestras de tejidos inducida muertos que de las muestras obtenidas tras el trabajo de parto al término inducidos (p = 0,004). Asimismo, RCAS1 expresión promedio observado en muestras de tejido placentario de las mujeres con espontánea muertos fue significativamente menor que la placenta la expresión de la proteína en muestras de mujeres con plazo con inicio espontáneo del trabajo (p = 0,03). Significativamente mayor RCAS1 placentaria niveles se encontraron en mujeres con mano de obra inducida, en comparación con las mujeres con inicio espontáneo del trabajo de parto al término (p <0,001). RCAS1 diferencias significativas en la expresión, también se observaron en el grupo de nacidos muertos con el respeto al principio de la muerte: espontánea e inducida (p = 0,06).

Discusión

Con el fin de investigar el posible papel de RCAS1 en inicio de muerte, la expresión de esta proteína se determinó y se comparó entre los grupos de pacientes con espontáneos e inducidos aparición de la muerte fetal. El RCAS1 expresión espontánea observado durante muertos fue menor que el nivel de esta proteína que se encuentra en la muerte inducida. Inmune actividad observó alteraciones durante la gestación tienen un alcance local y se refieren a la endometrio-tejido linfoide asociado. Células trofoblásticas participar en este fenómeno. Sinciciotrofoblasto es funcional a la terminal diferenciada trofoblasto. La proporción de sinciciotrofoblasto a cytotrophoblast aumenta a medida que avanza la gestación y, al término sinciciotrofoblasto ocupa casi toda la placenta. La diferenciación de cytotrophoblast sinciciotrofoblasto de la placenta es idéntico al desarrollo [14]. Las células de sinciciotrofoblasto y cytotrophoblast desempeñar un papel importante en la función de la unidad feto-materna. La disminución de la tolerancia inmune a término da lugar a comienzos del trabajo de parto espontáneo, antes de la aparición de este fenómeno se traduce en trabajo de parto prematuro o aborto involuntario [15].

La activación de endometrio-tejido linfoide asociado está a cargo principalmente de la citotoxicidad mediada por linfocitos. Endometrio normal es infiltrado predominantemente por linfocitos T, macrófagos y células NK. Aumento del número de linfocitos B, que constituyen un pequeño porcentaje durante el ciclo de los cambios fisiológicos en el endometrio se observa sólo en la endometritis [16]. El análisis de células mononucleares de distribución en deciduas plazo de las placentas reveló número considerablemente mayor de dNK, NK y macrófagos [17].

Nuestros estudios anteriores confirman la observación de una disminución RCAS1 nivel de expresión durante el parto de inicio espontáneo en comparación con el trabajo de parto al término inducida. La disminución de expresión RCAS1 nivel parece confirmar la observación de mayor dNK, NK actividad, que puede ser observado clínicamente en el inicio espontáneo del trabajo de parto, trabajo de parto prematuro o muertos [5]. Clínicamente asintomáticos aparición de la muerte fetal, que indica que el fallecimiento podría no ser inmediatamente reconocida por el sistema inmune materna. Baja placentaria RCAS1 expresión en las mujeres con inicio espontáneo de muerte en comparación con inducido muertos observó en nuestro estudio parece confirmar esta hipótesis. Una correlación entre RCAS1 expresión y de la infiltración de células dNK humanos en el útero se encuentra en las primeras etapas del embarazo se observó por Oshima et al. [4]. En este estudio, en los casos sin materna RCAS1 rechazo se expresó principalmente en el trofoblasto. En cambio, en los casos en la madre con la expresión de rechazo RCAS1 disminuido notablemente. Estos cambios también fueron acompañados por marcados infiltración y activación de células dNK. Placentas normales a término fueron seleccionados como los controles. Localización inmunohistoquímico reveló la presencia de RCAS1 en los tejidos normales de la placenta a término. Tinción positiva para RCAS1 se encuentran predominantemente en extravillous cytotrophoblast y syncytiotrofoblast [4]. Por lo tanto, es posible que la aparición de la muerte también puede ser necesaria la disminución de la tolerancia inmune, que puede reflejar un aumento de la actividad citotóxica.

Conclusión

Nuestros resultados indican que las alteraciones en la expresión RCAS1 puedan participar en los cambios del sistema inmunológico de la madre que tienen lugar durante la muerte fetal.

Lista de abreviaturas

RCAS1 (receptor vinculante antígeno expresado en el cáncer de células SiSo); CTLs (linfocitos T citotóxicos); dNK (decidua natural killer); KIRs (asesino inhibidora), TNF (factor de necrosis tumoral).

Agradecimientos

Queremos dar las gracias R. Profesor Klimek, y el profesor A. Reron Profesor J Marcinkiewicz, de asesoramiento y de ayuda para los debates y la amistad palabras de apoyo. También damos las gracias al Dr P. Mak bioquímicos de apoyo.