Cancer Cell International, 2005; 5: 20-20 (más artículos en esta revista)

Los cambios en la P-glicoproteína actividad están mediados por el crecimiento de una línea celular tumoral como esferoides multicelulares

BioMed Central
Valeria Ponce de León (valeponsua@yahoo.com.mx) [1], Raúl Barrera-Rodríguez (raul_barrera@iner.gob.mx) [1]
[1] Depto. De Bioquímica. Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias de la SSA México. Clza. Tlalpan, 4502 14080, México, DF

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Resumen
Antecedentes

La expresión de P-glicoproteína (P-gp), la multirresistencia (MDR) 1 producto génico, puede conducir a la multirresistencia en los tumores. Sin embargo, el papel fisiológico de la P-gp en tumores de crecimiento como esferoides multicelulares no es bien conocida. La evidencia reciente sugiere que la actividad de P-gp puede ser modulada por componentes celulares como las proteínas de membrana, proteínas de la membrana de anclaje o de la membrana de la composición de lípidos. Dado que, esferoides multicelulares estudios han evidenciado alteraciones en numerosos componentes celulares, incluidos los relacionados con la función de la membrana plasmática, el resultado plausible de que algunos de estos cambios podrían modular la función de P-gp y ser responsable de la adquisición de la resistencia a los medicamentos multicelulares. En el presente estudio se pregunta si un cáncer de pulmón de células humanas línea (INER-51) crecido como esferoides multicelulares puede modificar la P-gp actividad para disminuir los niveles de doxorrubicina (DXR) mantenerse y aumentar su resistencia a los medicamentos.

Resultados

Nuestros resultados muestran que el INER-51 esferoides mantener de 3 pliegues inferiores doxorrubicina que las mismas celdas que monocapas sin embargo, diferencias en la retención no se observaron cuando la P-gp sustrato Rho-123 fue utilizado. Curiosamente, ni el uso de la P-gp-modulador-agente de la ciclosporina A (Cs-A), ni una disminución de la ATP-piscinas fueron capaces de aumentar la retención en el DXR esferoides multicelulares. Sólo la falta de expresión de P-gp en todo el farmacológico de selección de un puesto de P-gp negativo (P-gp neg) mutante clon (PSC-1) derivados de INER-51 células, permiten aumentar la retención de DXR en esferoides.

Conclusión

Así, multicelulares acuerdo parece alterar la P-gp actividad para mantener niveles más bajos de DXR. Sin embargo, no la expresión de P-gp por células que forman esferoides multicelulares sólo tiene una incidencia menor en la resistencia a los agentes quimioterápicos.

Antecedentes

La multirresistencia a la quimioterapia es uno de los mayores problemas en el tratamiento del cáncer. Actualmente, la mejor entendido mecanismo de multirresistencia (MDR) se asocia a la sobreexpresión de la proteína de la bomba de flujo de salida conocido como P-glicoproteína (P-gp), pero otros no Ppg mecanismos también están involucrados (es decir, MRP1, topoisomerases, glutatión - S transferasas, etc.) La P-gp es el producto proteico del gen MDR-1 y se expresa como un paso de proteínas (Señor 170.000), capaz de disminuir la concentración intracelular de una amplia gama de agentes citotóxicos en una energía dependiente del flujo de salida mediada [1, 2 ]. Sobreexpresión de la P-gp en líneas celulares humanas confiere resistencia a muchos de los más eficaces agentes quimioterapéuticos utilizados clínicamente en la quimioterapia, incluyendo antraciclinas (por ejemplo, doxorrubicina (DXR)), Vinca alcaloides (por ejemplo, vincristina), epipodophyllotoxins (por ejemplo, etopósido), Actinomicina D, paclitaxel, así como muchos otros agentes quimioterápicos no como Rhodamine Rhodamine-123 y bromuro de etidio [3]. Aunque el modelo más aceptado es que el P-gp por sí extrusión agentes quimioterapéuticos fuera de las células, estudios más recientes sugieren que la P-gp actividad puede ser modulada por componentes celulares como las proteínas de membrana, proteínas de la membrana de anclaje o de la composición de lípidos Ellos mismos [4 - 7].

Desde los primeros estudios realizados por Sutherland et al en 1979 [8], se demostró que las células tumorales esferoides multicelulares cada vez se parece como muchos de los comportamientos encontrados en tumores sólidos, incluyendo la resistencia multicelulares (MCR) [9, 10]. Utilizando el modelo de esferoides multicelulares, varios autores han demostrado que la P-gp, es más eficaz para conferir resistencia en células cultivadas como esferoides, en comparación con las células cultivadas como monocapas [11 - 13]. A partir de estas observaciones, se plantea una pregunta: ¿las células tumorales modular su actividad P-gp como una consecuencia directa de la condición ambiental donde crecido? Para abordar esta cuestión, hemos realizado un estudio de una línea de células NSCLC denominado INER-51 que mostró un P-gp mediada por la resistencia a la DXR esferoidal en el modelo. En los estudios iniciales con INER-51 células, encontramos que la formación de esferoides multicelulares no muestran ningún aumento de ARNm para MDR-1 en un gen o diferencial P-gp expresión en los ámbitos específicos de la spherule.

Resultados
La doxorrubicina y Rhodamine-123 de retención en esferoides

Es bien sabido que esferoides multicelulares son más resistentes a los fármacos quimioterapéuticos que los mismos cultivos celulares como monocapas [11, 12]. Con el objetivo de evaluar las diferencias en la actividad de P-gp en esferoides multicelulares con respecto a monocapas, dos de P-gp sustratos se utilizaron (DXR y Rho-123). Ambos compuestos fueron elegidos, porque son buenos sustratos de P-gp con una capacidad autofluorescence. Nuestros resultados mostraron que en la cantidad de monocapas DXR retenido en las células fue en proporción directa a la droga añadido a la media (Figura 1]. En cambio, esferoides multicelulares presentan una disminución de la capacidad de retención DXR (3 veces inferior) a monocapas. Curiosamente, este pobre retención no se observó cuando Rho-123 se utilizó como sustrato de P-gp, porque los niveles de Rho-123 retenidos son iguales en ambos tipos de culturas (cuadro de insertar en la Figura 1a].

Dado que la retención de las drogas es un proceso dinámico que implica la absorción de drogas (simple difusión), así como la vinculación de drogas (frente a la expulsión de difusión mediado por un mecanismo activo), hemos tratado de determinar si una forma más eficiente de P-gp dependientes de la droga fue retirada Responsable por permitir que menores concentraciones intracelulares DXR. Así, la eliminación de drogas en monocapas previamente cargado con 30 μ M de DXR durante 30 min mostró una reacción de descomposición de primer orden con un medio tiempo de la concentración de drogas en los primeros 5 minutos intervalo que se indica la presencia de un mecanismo de transporte activo (Figura 1b] . Sin embargo, para esferoides multicelulares la presencia de activos de transporte no era evidente, ya que no era posible su carga de las células con cantidades suficientes de DXR para determinar el flujo de salida valores. Una observación común en estos experimentos fue que una cantidad constante de DXR se conservarán durante un período más largo de tiempo (45 minutos) en las células cultivadas como monocapas. Una posible explicación podría ser de la presencia de carga positiva DXR-, que almacena en vesículas ácidas como lisosomas y gránulos cromafines [20, 21].

DXR elusión de retención con P-pg inversión de los agentes

Con el objetivo de determinar la cantidad de la P-gp influye en los niveles de DXR retenido, el agente modulador de Cs-A fue contratado. Como se muestra en la Figura 2, la incubación de monocapas con 5 μ M de Cs-A aumenta de manera eficiente (2 veces) el DXR fluorescencia intracelular en relación directa con la concentración de agente de reversión. Sorprendentemente, la P-gp con modulación de la actividad de Cs-A no fue evidente en esferoides multicelulares porque ningún efecto en la retención intracelular DXR podría ser visto. Además, la inversión de otros agentes, como SDZ PSC 833 y verapamilo no fueron capaces de aumentar la retención DXR, ni en monocapas ni en esferoides multicelulares (datos no presentados).

Efecto de la ATP-en el agotamiento de retención DXR

P-gp es una proteína que pertenece a la cinta de la proteína ABC vinculante, para que las necesidades de flujo de salida de drogas eficiente de hidrólisis de ATP. Así, con el proponer para lograr más información acerca de la función de P-gp, decidió inhibir la P-gp agotamiento de la actividad a través de la ATP-piscinas. Tres venenos metabólicos se utilizaron para asegurarse de completo agotamiento en el ATP de esferoides multicelulares. La Figura 3 muestra que el agotamiento hizo ATP-inducir un aumento de 1,5 veces de DXR retención en las células mantiene como monocapas efecto, pero ninguno fue visto de nuevo cuando en el ATP agotado esferoides multicelulares.

El logro de la CPS-1 mutante clon no expresar P-gp

Sin posibilidad de obtener pruebas irrefutables de la P-gp modulación de esferoides multicelulares, decidimos eliminar la P-gp expresión de la línea de cáncer de pulmón. Por lo tanto, a través de los compañeros de la selección de los padres línea celular INER-51 con 5 μ M de DXR y 5 μ M de SDZ PSC 833, fuimos capaces de obtener un clon de células mutantes que no expresan P-gp, que fue nombrado PSC - 1 línea (Figura 4a]. In vitro de RT-PCR análisis de otros genes relacionados con la MDR-no mostraron diferencias cualitativas entre los padres y las células mutantes (Figura 4b]. La amplificación de los experimentos mostraron que ambas líneas de células expresar con aproximadamente con la misma intensidad transcripciones de la topoisomerasa I, la topoisomerasa II α y β topoisomerasa II, pero ninguno de ellos expresó la multirresistencia proteína asociada (MRP1) o glutatión-S-transferasa μ.

DXR retención de las drogas y la citotoxicidad PSC-1 en las células

Las similitudes entre el INER-51 células (P-gp pos) y células PSC-1 (P-gp neg), nos permitió evaluar la posibilidad o no de los más bajos niveles de retención DXR-se a través de una forma positiva modulada P-gp - Mecanismo. La incubación de esferoides PSC-1 con el aumento de las concentraciones DXR mostró un incremento significativo en la retención de drogas (1,8 veces) en comparación con el INER-51 esferoides y fue sólo 1,6 veces inferior al PSC-1 de crecimiento como monocapas (Figura 5]. Cuando Rho-123 fue ensayada, un aumento de la retención del colorante relativo a la línea parental INER-51 como monocapas era evidente. En el PSC-1 esferoides, los niveles de retención de Rho-123 fueron similares en ambos INER-51 monomoleculares y esferoides multicelulares (cuadro de insertar en la Figura 5].

Varias técnicas se han utilizado para evaluar el MCR en esferoides multicelulares. Dado que en los experimentos anteriores hemos podido desglosar esferoides multicelulares a través de protocolos basados en tripsina, decidimos evaluar el MCR utilizando el ensayo MTT (que como previamente evaluadas por Furukawa et al [17]. Curiosamente, este ensayo mostró que el aumento En DXR retención sólo había un menor impacto en el MCR. Por lo tanto, PSC-1 esferoides fueron capaces de mantener su resistencia a la DXR etopósido o como la de sus padres INER-51 células (Figura 6 bis, b] con sólo pequeños cambios en los valores de CI 50 (Tabla 1]. Sólo cuando PCS-1 se analizaron las células contra el efecto citotóxico de metotrexato (que usar otra anterior a la desintoxicación a través de P-gp), las diferencias entre el INER-51 células y células PSC-1 puede observarse (Figura 6c] .

Discusión

Es bien sabido que la disposición tridimensional de evocar los cambios estructurales más profundos en las células para mantener la integridad de la estructura multicelulares, algunas de las cuales incluyen: a) la expresión de proteínas de la ECM [22], b) la membrana de proteína de anclaje [23 , 24], c) las proteínas de choque térmico [25], y d) las proteínas de adhesión así como los cambios en la composición de lípidos de membrana y de la hipoxia [26 - 29]. Otro fenómeno observado con frecuencia cada vez mayor en las células tumorales como esferoides multicelulares es la adquisición de MCR. En esferoides culturas y sistemas de monocapa en uno de los principales mecanismos que confieren resistencia se muestra por la expresión de P-gp. Sin embargo, algunas evidencias sugieren que confieren a MCR, la P-gp también parece funcionar de manera más eficiente [11, 12]. Los datos recientes sugieren que la actividad de P-gp puede ser modulada a través de la interacción con los diversos componentes celulares, algunos de los cuales son también alterado cuando las células son esferoides multicelulares [4 - 7, 11, 12]. Por lo tanto, sería interesante saber si la adquisición de MCR, las células tumorales esferoides pueden modular su actividad P-gp.

Nuestros resultados sugieren que una mayor eficiencia de P-gp mediada por flujo de salida parece ser el responsable de mantener niveles más bajos de DXR en el INER-51 esferoides de células en monocapas. Sin embargo, esta P-gp mediada por flujo de salida de drogas no parece funcionar en las mismas condiciones con otros sustratos, ya que cuando el catión lipofílico Rho-123 fue utilizado, los niveles de retención fueron similares e independientes de las condiciones de cultivo.

En virtud de la condición esferoidal, P-gp parece obedecer a diferentes mecanismos de regulación, ya que ni Cs-A trato ni el agotamiento de ATP-fueron capaces de aumentar los niveles de DXR en el spherules. Otros no P-gp mediada por mecanismos también parecen estar operativo para mantener los niveles más bajos en el DXR esferoides multicelulares, ya que la falta de expresión de P-gp no alcanzó los niveles de DXR comparable a la monocapa de las culturas y sólo había un menor impacto en el MCR a la adquisición de agentes quimioterápicos, incluyendo DXR.

Algunas evidencias han demostrado que la composición de la membrana de la célula pueden modular la tasa de circulación transbilayer MDR-tipo de medicamentos a través de la membrana y, por consiguiente, afecta a la "competencia" entre los activos de P-gp mediada por flujo de salida de drogas de drogas y la absorción pasiva: es decir, la retención [30]. En particular, DXR ha demostrado tener una menor tasa de penetración a través de membranas, debido a su interacción específica con cardiolipin [31, 32]. Dado que los cambios que afectan a la membrana plasmática membrana no confieren resistencia, pero sí podría conducir la P-gp función [33 - 35], que postula un posible dibujo para entender cómo P-gp éxito DXR mantiene las concentraciones más bajas. En esta foto, un retraso en la tasa pasiva de transbilayer circulación DXR a través de la membrana plasmática se traduce en un aumento de la capacidad de P-gp para reconocer y extrusión hacia fuera de los esferoides. Por lo tanto, cuando P-gp está ausente (como en el PSC-1 células), la saturación de los lípidos objetivos de permitir el aumento de la concentración en el DXR esferoides multicelulares. Aumento de la eficiencia de la P-gp para dar forma a los sustratos ha sido plenamente demostrada por diferentes miembros de la DXR rodamina y seco análogos, en la que cada una de ellas con diferentes propiedades lipofílicas [36].

Varios estudios han demostrado que el uso de agentes modulador de provocar la sensibilización de crecimiento de las células como esferoides multicelulares [37 - 39]. La eficacia de estos agentes se debe a la mayor tasa de permeabilidad en relación con los sustratos de P-gp [40]. Sin embargo, cuando INER-51 esferoides fueron pre-tratados con 10 μ M de la agente modulador de Cs-A, ningún aumento de la retención se observó DXR. Un fenómeno similar se observó en esferoides multicelulares tratados con verapamil [38, 39]. Hoy en día, una serie de estudios utilizando distintas técnicas han sugerido un probable modelo de la interacción entre la P-gp-sustratos con moduladores de los agentes y de cómo estas moléculas se unen a diferentes sitios de P-gp [41]. Cuatro sitios de unión han sido identificados en la P-gp de que vinblastina y daunorubicin obligar al sitio I, que se unen a los moduladores sitio IV. En este modelo, todos los sitios de unión allosteric mostrar la interacción entre cada uno de ellos, lo que afecta a P-gp mediada por la actividad. Además, un sitio de unión no reconocidas se ha propuesto para Rho-123 [42 - 44]. Así, el fracaso de Cs-A para inhibir la P-gp DXR mediada por flujo de salida puede ser una consecuencia de los cambios en la P-gp que afectan al sitio de unión del modulador-o la inhibición allosteric con algunas hipotéticas molécula. Recientemente, en células con MDR-fenotipo, que se ha demostrado que existe una interacción entre la P-gp y HSP-90 [45]. Si spherules provoca la formación de la expresión de HSP-90, que es capaz de obligar a P-gp, el fracaso de Cs-A inhibición podría entenderse. Además, la inhibición de la allosteric modulador sitio por factores desconocidos podrían ser una explicación para el común de fracaso visto cuando tumores sólidos, incluyendo cáncer de pulmón de los tumores, son tratados con inversión de los agentes [46].

Otra observación interesante vino de los efectos del agotamiento de ATP en DXR retención. Para este experimento se utilizó un cóctel de venenos metabólicos que estar seguros de la ATP piscinas agotamiento. Sin embargo, este tratamiento no pudo aumentar la retención en DXR esferoides multicelulares, pero su efecto fue evidente en monocapas. Dado que hay un consenso general en la literatura que P-gp es una bomba impulsada por la energía, donde la energía es suministrada por la hidrólisis de ATP, nuestros datos son rompecabezas. Sin embargo, utilizando los ensayos de competiciones, Biswas EE [47], demostró que NBD1 de histidina permease (Hisp) y maltosa transportador de proteína (Malk), dos miembros del ABC, puede funcionar como un dominio general de nucleótidos vinculante, con una preferencia de nucleótidos CTP> GTP> ATP>> UTP. Así, el impacto de la ATP en el agotamiento DXR retención no es entendido por el momento.

En los últimos años, ha quedado claro que los múltiples no-P-gp puede ser mediada por mecanismos operacionales en esferoides tumorales para conferir MCR [48]. Uno de los mecanismos más recientemente descrito es la resistencia a la proteína de cáncer de mama (BCRP), que es una bomba de flujo de salida de drogas de manera eficiente en condiciones de extrusión DXR [49]. Desde INER-51 células expresan ARNm para BRCP, no podemos descartar la actividad de esta proteína como un mecanismo que ayuda a mantener los niveles más bajos de retención DXR. Sin embargo, la actividad del BCRP como la bomba de flujo de salida es mayor de Rho-123 eflujo DXR que, aunque su contribución a la retención de drogas en esferoides es controvertida [50].

Además de la resistencia DXR, INER-51 esferoides también mostró resistencia a otros medicamentos contra el cáncer, tales como etopósido y metotrexato. Habitualmente, el etopósido-resistencia implica alteraciones en el objetivo nuclear de enzimas topoisomerases. Oloumi et al [51] indican que las alteraciones en la localización subcelular de topoisomerases tipo II pueden tener un papel importante en la resistencia a los agentes citotóxicos cuando las células están en estrecho contacto. Considerando que Luo et al [52] mostraron que la fosforilación de la guía II alfa se redujo por lo menos 10 veces en el exterior de las células V79 esferoides relativo a monocapas. Sin embargo, el papel de la topoisomerasa II alfa como un mecanismo para conferir a MCR etopósido en el INER-51 esferoides no se ha evaluado todavía y se tendrán en cuenta para futuros experimentos.

Una situación diferente se puede especular de la resistencia al metotrexato. Bajo condiciones fisiológicas, el metotrexato ácido débil tiende a ser cargado en el formulario y es absorbida por las células en gran parte por un mecanismo de transporte de folatos. A diferencia de DXR, metotrexato no es secuestrada en las membranas ni en endosomes ácido, pero puede ser "atrapado" por el interior de las células polyglutamation [53]. Así pues, las diferencias en la resistencia de metotrexato INER-51 relativa a las células PSC-1 células podrían derivarse de las diferencias de P-gp-independiente de las vías metabólicas.

Por último, varios informes han demostrado una menor expresión de MDR-1 en NSCLC [54]. Sin embargo, algunos autores han demostrado un importante papel de la P-gp expresión en el cáncer de pulmón y tumores particularmente en el cáncer de pulmón diagnosticado en personas de las que el humo del tabaco [55 - 57]. Debido a nuestros resultados, sería interesante evaluar tanto los niveles de P-gp, así como expresión de P-gp actividad en el cáncer de pulmón de los tumores.

Conclusión

Nuestros resultados sugieren que en el INER-51 células cultivadas como esferoides multicelulares, una más eficiente actividad de P-gp es responsable de mantener los niveles más bajos de retención de DXR en comparación con la P-gp actividad de las células cultivadas como monocapas. Curiosamente, mientras que la expresión de P-gp ayuda a mantener niveles más bajos de DXR en la esferoides multicelulares, de los mecanismos que rigen el MCR parece ser diferente debido a la falta de P-gp-expresión sólo mostraron un menor impacto de la resistencia a varios fármacos quimioterapéuticos, Lo que sugiere que otros no P-gp también son mecanismos de funcionamiento.

Métodos
Productos Químicos

Doxorubicina (DXR) fue proporcionada por Farmitalia Carlo Erba-, mientras que La ciclosporina-A fue proporcionada por Sandoz Farma, mientras que 833 se SDZ PSC regalo por Novartis. Rodamina-123 (Rho-123) y 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-il) -2,5 difenil bromuro de tetrazolio (MTT) fueron adquiridos a Sigma (San Luis, MO, EE.UU.). Todas las soluciones de trabajo fueron inicialmente disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO) y diluciones posteriores se pusieron en medio de cultivo.

Líneas celulares y condiciones de cultivo

El cáncer de pulmón de células línea INER-51 y su clon CPS-1 (no expresar P-gp o neg P-gp) fueron cultivadas como monocapas en RPMI-1640 medio a 37 ° C en 5% CO 2. INER-51 CPNM es una línea celular establecida en nuestro laboratorio de derrame pleural de los pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón primario sin previo tratamiento con quimioterapia. La línea celular de riñón A498 (expresión de P-gp) y la línea de células de adenocarcinoma de pulmón INER-37 (expresando MRP1) se utilizaron como controles de la P-gp MRP1 función y expresión, respectivamente. El medio de cultivo fue suplementado con 10% de FCS (Sigma, Co San Luis, MO, EE.UU.), el 1% no aminoácidos esenciales, 1 mM piruvato sódico, 2 mM L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina y 100 Μ g / ml de estreptomicina.

Cultura de monocapas y multicelulares spherules

Monocapas de células fueron pasados a la semana por la solución de tripsina-EDTA (Invitrogen ™, EE.UU.). Para obtener esferoides multicelulares, el 3,5 × 10 5 exponencial de las células tumorales fueron sembradas en el 1% de agarosa-revestido (24-well/plate) en RPMI-1640 completo a medio [14]. Culturas habitualmente se cultiva durante 72 horas para adquirir esferoides multicelulares de aproximadamente de 500 μ m de diámetro.

P-gp no expresar clones mutantes

Con el fin de obtener un clon mutante con la capacidad para no expresar P-gp, INER-51 células fueron tratados como se describe por Beketic-Oreskovic, et al [15]. En pocas palabras, 1 × 10 6 células tumorales Se sembró en un T 25 frasco de plástico de cultivo de tejidos (Falcón, EE.UU.). Cuando el cultivo de células logrado una semi-confluente grado, el medio de cultivo fresco y se ha retirado a medio terminar se añadió conteniendo 5 μ M DXR y 5 μ M de SDZ PSC 833. Las células se mantienen con esta condición durante dos semanas, hasta algunos clones de supervivencia eran evidentes a la observación microscópica. Un total de 6 de supervivencia clones fueron aislados, propagadas por un mes, en ausencia de drogas, y la prueba de MDR1 expresión in vitro por RT-PCR. Un clon mutante que se manifiesta estable para mdr1 neg fenotipo fue seleccionado y reproducido de nuevo. Cada clon obtenido se realizarán las pruebas de la expresión de MDR-1 de nuevo. Por último, el clon PSC-1 y se propaga más utilizados para el estudio de la presente comunicación.

Resistencia a los medicamentos en monocapas o esferoides multicelulares

El nivel de resistencia a los medicamentos se determinó con el uso de MTT como ensayo anteriormente descrito por S. Cole [16] y sobre los sistemas multicelulares como evaluadas por Furukawa, et al [17]. Por monocapas, 7 × 10 3 células / así se chapada en 96-well/plate (Costar, EE.UU.) y se añadieron las drogas en diferentes concentraciones por así. En el caso de esferoides multicelulares, que se obtuvieron como se ha descrito anteriormente y que fueron alimentados con frescos completo soporte de la concentración de diferentes drogas. Después de 72 horas, el medio de cultivo fue retirado y MTT reactivo diluido en PBS fue agregado para obtener una concentración final de 2 mg / ml. Después de una incubación de 4 horas, los esferoides rodeado de cristales de formazan fueron trasladados en tubos eppendorf de 1,5 ml. Las células en monocapas fueron lavadas con PBS una vez. Ambos monomoleculares y esferoides multicelulares cristales fueron disueltos por la adición de 100% DMSO durante 20 min con agitación ocasional. Absorbancia a 540 nm se midió utilizando un lector de microplacas automatizado (Labsystem Multiskan MS, Finlandia). En cada experimento, la determinación de drogas se analizó en seis pozos. La supervivencia celular se calculó como porcentaje de la correspondiente control. Drogas-citotoxicidad fue ensayada por la IC 50, correspondiente al 50% de disminución de la tasa de supervivencia de células respectivos no a las drogas tratados culturas.

La doxorrubicina y Rhodamine-123 ensayos de retención

Exponencial creciente células (3,5 × 10 5) Se sembró 72 horas antes del tratamiento con drogas en el 1% de agar-24-revestidos así como placas de cultivo de tejidos se ha descrito anteriormente. Cualquiera de monocapa o esferoides multicelulares células fueron incubadas con el incremento de las concentraciones de DXR o Rho-123 durante 30 minutos y luego se lava con un nuevo medio libre de drogas en dos ocasiones y una vez PBS. Monocapas de células en suspensión fueron obtenidos por tripsinization esferoides multicelulares que se recuperaron mediante micropipette consejos. Para excluir artefactos derivados de DXR refrescante por su unión a DNA y en la acumulación de ácido orgánulos, DXR se extrae de esferoides con el método descrito por Wartenberg et al [18]. Por último, intracelulares o DXR Rho-123 se determinaron por spectrofluormetry (Phototechnology, International, de Princeton, Nueva Jersey, EE.UU.) en λ em 580 nm y 427 o ex λ λ em 510 nm y λ ex 480, respectivamente.

La doxorrubicina ensayos de flujo de salida

El flujo de salida se basan en ensayos de los anteriormente descritos [19]. En pocas palabras, monocapas o esferoides multicelulares estaban cargados con drogas DXR (30 μ M) a lo largo de incubación a 37 ° C en 5% CO 2 durante 30 min. La carga de las células fueron lavadas con un completo libre de drogas helado mediano y bien colocados en hielo o incubadas a 37 ° C en 5% CO 2 para diferentes intervalos de tiempo. Este flujo de salida de drogas de incubación permite que se produzca, y durante el tiempo restante experimental de drogas es su cuantificación spectrofluormetry como se ha descrito anteriormente.

Elusión de la P-gp mediada por flujo de salida con Cs-A-ATP o agotamiento

Para la evaluación de la actividad de P-gp, monocapas o esferoides multicelulares fueron pre-incubadas durante 1 hora con el aumento de las concentraciones de drogas de la ciclosporina-A (Cs-A). Después de pre-incubación, esferoides multicelulares se cargaron de 30 minutos con 30 μ M de DXR en presencia de la inversión y después el agente DXR captación fue evaluada de nuevo. Por el agotamiento de ATP, las células fueron pre-incubadas durante 20 min a 4 ° C en PBS / BSA (1 mg / ml) con 1 mM de cianuro de sodio, 10 mM de fluoruro de sodio y 10 mM de azida sódica antes de la adición de DXR . Después de la centrifugación a 1000 × g durante 15 min, las dos monocapas y esferoides multicelulares se cargaron con diferentes concentraciones DXR en presencia de inhibidores de la síntesis de ATP y de la fluorescencia se midió como se mencionó anteriormente.

In vitro de la transcriptasa inversa-el ensayo de PCR

ARN total fue extraído de las líneas celulares con reactivo Trizol (Invitrogen ™, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Única varados cDNA fue sintetizado por transcripción reversa de 5 μ g de RNA total usando Superíndice ™ RNAse la transcriptasa reversa (Invitrogen ™, EE.UU.) y oligo-dT 16-18. La amplificación se realizó en un volumen final de 25 μ l, que contiene 0,5 μ l cDNA, 50 pM de cada oligonucleótido cebador, 30 μ M de cada dNTPs, 2,5 unidades de Taq polimerasa de ADN, 1,5 mM de MgCl 2, 20 mM Tris-HCl (pH 8,4 ) Y 50 mM KCl. La amplificación se realizó en un Termociclador (programada Térmica Contralor, modelo PTC-100, MJ Research Inc, EE.UU.) durante 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 1 min, recocido a 55-60 ° C durante 2 min, y Polimerización a 72 ° C durante 3 min. La PCR primers y tamaño esperado del producto fueron los siguientes: Para la MDR-1, adelante: 5'-cccatcattgcaatagcagg-3 'y revertir: 5'-gttcaaacttctgctcctga-3 [150 bp]; MRP1, adelante: 5'-tctctcccgacatgaccgagg-3' E invertir: 5'-ccaggaatatgatgccccgacttc-3 '[140 bp]; topoisomerasa II α, adelante: 5'-tttaaggcccaagtccagttaaac-3' y revertir: 5'-gtataacaatatcatcaagattgt [343 pb]; topoisomerasa II β, adelante: 5'-gaagtgttcactagtaaaatacagt-3 'E invertir: 5'-cataatctttccatagcgtaaggtt-3' [336 bp]; topoisomerasa I, adelante: 5'-aagcagaggaagtagctacg-3 'y revertir: 5'-gctcatctgtttccgagctt-3' [206 bp]; GST-μ, adelante: 5 '-Gaactccctgaaaagctaaag-3' y revertir: 5'-gttgggctcaaatatacggtgg-3 '[250 bp]; G3PDH, adelante: 5'-tggggaaggtgaaggtcgga-3' y revertir: 5'-gaaggggtcattgatggcaa-3 '[bp 110].

Lista de abreviaturas

Cs-A: La ciclosporina-A

DXR: doxorrubicina

MCR: Multicellular resistencia

MTT: 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-il) -2,5 difenil tetrazolio bromuro

CPNM: de células no pequeñas de cáncer de pulmón

P-gp: P-glicoproteína

Rho-123: Rhodamine 123

MDR: multirresistencia

DMSO: Dimetil sulfóxido

Contribuciones de los autores

Todos los autores (s) contribuyeron por igual a este trabajo.

Agradecimientos

Estamos en deuda a la Sra Christine Wilson de revisión lingüística y Rodolfo Ocádiz Delgado (CINVESTAV-IPN) para la revisión técnica y la crítica del manuscrito.

Este trabajo fue presentado en cumplimiento parcial de los requisitos para la D. Sc. Licenciatura para Ponce de León Suárez, V., en BIOMEDICAS DOCTORADO EN CIENCIAS, UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO