Lipids in Health and Disease, 2005; 4: 14-14 (más artículos en esta revista)

Óxido nítrico sintasa inducible enlaces NF-κ B de la PGE 2 en ácidos grasos poliinsaturados alterado fibroblastos in vitro de la cicatrización de heridas

BioMed Central
Jia Yi (yjia@purdue.edu) [1], Juan J, Turek (turekj@purdue.edu) [1]
[1] Department of Basic Medical Sciences, Purdue University, West Lafayette, Indiana 47907, USA

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Resumen
Antecedentes

Este estudio investigó los mecanismos de alteración en la producción de colágeno fibroblastos inducida por los ácidos grasos poliinsaturados. 3T3-Swiss fibroblastos son cultivados en medio eicosapentaenoic o ya sea que contengan ácido araquidónico. Los efectos del factor nuclear-kappaB activación por lipopolisacárido de óxido nítrico sintasa inducible, el óxido nítrico, prostaglandina E 2, la producción de colágeno, y en la cicatrización de heridas-vitro fueron estudiados.

Resultados

Eicosapentaenoic ácido producido células tratadas menos prostaglandina E 2, pero ha aumentado el óxido nítrico sintasa inducible de expresión, la producción de óxido nítrico, la formación de colágeno, y recoverage zona durante in vitro de células de la cicatrización de heridas tratadas con ácido araquidónico. La activación de factor nuclear-kappaB lipopolisacárido con el aumento de óxido nítrico sintasa inducible de expresión, la producción de óxido nítrico, prostaglandina E 2, colágeno, y la in vitro recoverage zona de la herida. El inhibidor de la sintetasa del óxido nítrico, N G-nitro-L-arginina metil éster, disminución de lipopolisacárido inducida por óxido nítrico, pero la cantidad de óxido nítrico fue mayor en los tratados de ácido eicosapentaenoic células. N G-nitro-L-arginina metil éster más lipopolisacárido tratamiento aumentó la producción de colágeno y celulares recoverage zona mientras que el tratamiento con N G-nitro-L-arginina metil ester sola disminución de heridos en los fibroblastos.

Conclusión

La activación de la NF-κ B vía PGE 2 y puede estar vinculado por la cruz-hablar de iNOS y NO en la AGPI fibroblastos alterada la producción de colágeno y la cicatrización de heridas. Se necesitan estudios adicionales para determinar la forma de ácidos grasos poliinsaturados puede ser utilizado como adyuvantes en combinación con otros tratamientos (es decir, las drogas) para diseñar terapias para mejorar la salud, ya sea la producción de colágeno o inhibir la producción y reducir la fibrosis.

Antecedentes

El propósito de esta investigación es probar la hipótesis de que los ácidos grasos poliinsaturados, pueden alterar la formación de colágeno durante la cicatrización in vitro modificando iNOS expresión y de la producción de NO, que han de cruzar la interacción con el factor de transcripción nuclear kappaB (NF-κ B) y vía PGE 2. El control de la formación de colágeno para la óptima curación de los tejidos y órganos es esencial para numerosas enfermedades [1 - 3]. La curación de la piel y los tejidos conectivos, como los ligamentos y eficaces requieren un aumento de la producción de colágeno de la fuerza saludable y acortar el tiempo de recuperación, pero sin dejar cicatrices. Sin embargo, en la formación de colágeno lesionado órganos vitales debe reducirse al mínimo para evitar la fibrosis y la posterior pérdida de una función orgánica. Ambos mejorado y la reducción de la formación de colágeno que tienen mecanismos de regulación común que aún no se han dilucidado. Celulares y extracelulares múltiples factores pueden influir en la formación de colágeno, como el óxido nítrico [4], PGE 2 [5], así como los factores de crecimiento [6] y metaloproteinasas de la matriz [7]. Por lo tanto, el potencial de las terapias para el control de la curación puede requerir un enfoque de orientación por múltiples moléculas o mecanismos.

Nuestros estudios anteriores mostraron que los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) altera la producción de colágeno en los condrocitos aviar [8], porcina ligamento colateral medial fibroblastos [9], y murino fibroblastos 3T3-Suiza [5]. Ácido Eicosapentaenoic (EPA, 20:5 n -3) tratados porcina ligamento colateral medial fibroblastos producen colágeno más que los tratados con ácido araquidónico (AA, 20:4 n -6) [9]. En murino fibroblastos 3T3-suiza, hemos observado que la producción de colágeno pueden ser reguladas por la exposición a diferentes -6 n: n -3 AGPI ratios y estos efectos son mediados, en parte, por PGE 2 y los cambios en la señalización a través de los distintos PGE Subtipos de receptores [5].

Desde la formación de colágeno muchos genes asociados han promotor o potenciador de los elementos de NF-κ B [10], se estudió la respuesta diferente de NF-κ B genes relacionados a la EPA y AA tratamientos en fibroblastos 3T3-Suiza por un sistema de perfiles de genes [11]. Tratamientos con lipopolisacárido (LPS), un NF-κ B inductor, estimulado incremento en la expresión de varios genes en el NF-κ B itinerario que se vinculan la producción de colágeno (es decir, interleucina-6 y el óxido nítrico sintasa inducible).

El activan NF-κ B dímero se une a la región 5'-acompañamiento de la iNOS promotor iNOS e induce la formación [12]. Óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y el óxido nítrico (NO) tiene un papel importante en la formación de colágeno durante la cicatrización de la herida [13, 14]. La inhibición de la NO sintasa disminuyó significativamente la síntesis de colágeno en la herida fibroblastos [13]. Cutánea fibroblastos de iNOS-sacude murino fibroblastos proliferado más lenta y menos colágeno sintetizado, y NO donantes restaurado la síntesis de colágeno a nivel normal [15]. Otro estudio implicado un papel para NO PGE 2 en la formación y la deposición de colágeno en ratas [16]. Por lo tanto, NO endógeno iNOS y conexiones de la NF-κ B itinerarios de PGE 2 y regular la formación de colágeno durante la cicatrización de heridas.

Resultados
Real-time RT-PCR para iNOS mRNA

El nivel transcripcional de iNOS mRNA fue determinado por el tiempo real de RT-PCR (Figura 1]. La expresión de iNOS mRNA puede ser alterado por la estimulación de la NF-κ B itinerario. Incubación con el NF-κ B vía inductor, lipopolisacárido (LPS, 10 μ g / ml), significativamente (P <0,01) el aumento de la expresión de iNOS mRNA en tanto el ácido araquidónico (AA, 20:4 n -6) y ácido eicosapentanoic ( EPA, 20:5 n -3) tratados normal o heridos fibroblastos 3T3-suiza. Sin embargo, la EPA tratados con fibroblastos son más sensibles a la inducción de NF-κ B AA-vía que las células tratadas. La activación de la NF-κ B vía de la EPA-en las células tratadas con LPS producido aumentado significativamente (P <0,001) la transcripción de iNOS mRNA AA-en comparación con las células tratadas. La adición de los inhibidores de la sintetasa del óxido nítrico, N G-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, 10 -7 M) produjo un aumento significativo (P <0,05) en la transcripción de iNOS mRNA sólo en la EPA - Tratadas con LPS estimulación de los fibroblastos.

La cuantificación de nitrito

Un producto estable final de la síntesis de NO, nitrito, se mide para determinar la concentración de NO (Figura 2]. La producción de nitrito se puede cambiar modificando la actividad de la NF-κ B, y la vía de la sintetasa del óxido nítrico. EPA tratados con fibroblastos normales sin LPS estimulación produce más nitrito de control o AA-fibroblastos tratados. Sin embargo, cuando estimulado por LPS, la EPA tratados con fibroblastos normales produjo significativamente (P <0,05) menos que el nitrito de control de AA-o células tratadas. El tratamiento con L-NAME redujo significativamente LPS inducido por nitrito de producción, y la EPA tratados células que producen más nitrito AA-células tratadas. Heridos y LPS estimula la producción de células nitrito disminuyó en todos los tratamientos, en comparación con LPS solos, pero la EPA tratados con fibroblastos producen menos AA-nitrito que se trata, o de control de las células.

Cuantificación de PGE 2

La activación de NF-κ B por vía LPS en fibroblastos 3T3-suiza aumentó significativamente (p <0,05) la producción de PGE 2 por el control de los niveles de todos los grupos (Figura 3]. Tanto basal como estimulada cantidades de LPS PGE 2 fueron más bajas de la EPA tratados con fibroblastos en comparación con el control y tratamiento de las células AA. La adición de los inhibidores de la sintetasa del óxido nítrico, L-NAME, a LPS estimula los fibroblastos disminuyó la producción de PGE 2 a los niveles basales en todos los grupos. Hiriendo de LPS estimula las células no cambió de forma significativa la cantidad de PGE 2 producido por las células en comparación con los estimulada por LPS solos.

La formación de colágeno

Fibroblastos heridos sin tratamiento PFA aumentado a la vez la producción de colágeno (CP) y colágeno como porcentaje del total de proteínas (C-PTP), en comparación con el control (no heridos, ningún tratamiento PFA) fibroblastos (Tabla 2]. Sin embargo, heridos fibroblastos tratados con LPS produce menos colágeno y C-Senderos de la Paz que el control de las células de estimulación con LPS. El tratamiento con L-NAME sola redujo la producción de colágeno en los fibroblastos de control, mientras que los adicionales de L-NAME más LPS producido más colágeno y había más de colágeno como porcentaje del total de proteínas en el control de los dos heridos y los fibroblastos. La combinación de tratamientos de la EPA, L-NAME y LPS producían mayores CP C-Senderos de la Paz y de los tratamientos de AA, L-NAME y LPS en fibroblastos normales.

In vitro hiriendo ensayo

El celular recoverage heridos en la zona de fibroblastos modificados por los tratamientos de LPS, inhibidor de la sintetasa del óxido nítrico, ciclooxigenasa (COX) inhibidor, y PFA (Figura 4]. Después de herir a 24 Horas después, LPS activación de la NF-κ B, vía aumento del porcentaje de celulares recoverage zona en comparación con el control. El tratamiento de L-NAME solos disminuido el porcentaje de superficie celular recoverage en todos los grupos mientras que el tratamiento de L-NAME más LPS aumentó la superficie celular recoverage LPS en comparación con el tratamiento solo. La administración de indometacina, un inhibidor de la ciclooxigenasa, el aumento de la superficie celular recoverage en LPS estimula los fibroblastos. Los tratamientos de la EPA y AA por sí solo un aumento de la recoverage zona en comparación con el control. EPA-fibroblastos tratados con LPS había un mayor porcentaje de la superficie celular recoverage que la AA plus LPS células tratadas, con o sin otros tratamientos.

Discusión

Los ácidos grasos poliinsaturados, afecta a la formación de numerosos mediadores de la inflamación, como las citocinas y eicosanoids [9]. Así, la dieta de ácidos grasos, los movilizados de fosfolípidos celulares o triacylglycerols almacenados en el tejido adiposo, y aplicaciones tópicas [18] todos potencialmente pueden influir en la cicatrización de heridas. Un número limitado de estudios han examinado los efectos de la dieta o aplicaciones tópicas de AGPI en la cicatrización de heridas. La cicatrización de heridas cutáneas Un estudio encontró que las ratas alimentadas con una dieta enriquecida en ácidos grasos n -3 heridas que se produjo en la resistencia a la tensión más débil en comparación con los de ratas alimentadas con una dieta que contenga ácidos grasos n -6 [19]. Heridas cutáneas en perros alimentaron una dieta enriquecida n -3 había reducido epithelialization y contracción de heridas abiertas y menos edema en suturadas las heridas después de 5 días que los perros alimentados con una dieta enriquecida en ácidos grasos n -6. Sin embargo, la n -3 dieta no parece tener un efecto negativo en la cicatrización de heridas [20]. Un estudio más reciente encontró que la aplicación tópica de ácido oleico (monoinsaturado ácidos grasos n -9) inducida quirúrgicamente de las heridas en la piel de ratones resultó en el cierre de heridas más rápido que las aplicaciones de ácido linolénico (18:3, n -3) o ácido linoleico ( 18:2, n -6) [18]. La aplicación tópica de ácido linolénico también dio lugar a un aumento de la cantidad de fibras de tejido conectivo en comparación con otros tratamientos de ácidos grasos. Estos estudios limitados sugieren que, a fin de aprovechar las propiedades de la inflamación de mediación AGPI y los utilizan como coadyuvantes en el proceso de curación, puede ser necesario el uso de las distintas clases de AGPI selectivamente durante las etapas de la cicatrización de heridas. Cicatrización de la herida consiste en una fase inflamatoria, proliferativa (fibroblástico) fase, y una remodelación de la etapa (maduración) [21, 22]. Además, el tipo de herida (por ejemplo, agudo o chouronic) y el paciente (por ejemplo, diabéticos, quemar heridos, o inmunosuprimidos), será necesario que concuerden con los AGPI apropiado a la etapa particular de la cicatrización de heridas. Por ejemplo, en los pacientes inmunodeprimidos, un AGPI que aumenta la inflamación en las primeras etapas pueden ser necesarias para estimular el proceso de curación.

Un componente de curación es óptima regulación de la formación de colágeno. Favorables incluye tanto la formación de colágeno mejora la producción de colágeno para la cicatrización tejidos conectivos y la disminución de la formación en órganos vitales para reducir al mínimo la fibrosis. Nuestros estudios previos revelaron que los ácidos grasos poliinsaturados afectados una serie de mediadores y de los involucrados en la formación de colágeno [5, 9]. Muchos genes asociados la formación de colágeno, como la IL-6 y la iNOS, han promotor o potenciador de los elementos de NF-κ B [23, 24]. Estos genes proporcionan objetivos ideal para conectar las diversas vías implicadas en AGPI influido en la formación de colágeno. En el presente trabajo se estudió la relación entre NF-κ B generados vía iNOS y el óxido nítrico (NO) en la formación de colágeno AGPI alterado, y la asociación con la producción de PGE 2. Nuestra hipótesis en el presente estudio es que los ácidos grasos poliinsaturados, pueden alterar la formación de colágeno durante la cicatrización in vitro modificando iNOS expresión y de la producción de NO, que han de cruzar la interacción con el NF-κ B trayecto y PGE 2 (Figura 4, 5].

NO es sintetizado a partir de la terminal de guanidina átomo de nitrógeno de la L-arginina por óxido nítrico sintasa (NOS), y participa en muchas funciones biológicas [25]. La isoforma inducible de NOS (iNOS) se rige principalmente en el nivel transcripcional y contribuye a la mayoría de los NO producido en comparación con las otras isoformas [26]. La NF-κ B vía de señalización regula promotor regiones iNOS e induce la transcripción [12]. En el presente estudio el uso de tiempo real RT-PCR, la activación de NF-κ B por vía LPS aumento de la transcripción de iNOS mRNA en fibroblastos 3T3-suiza. El mayor aumento se registró en la EPA tratados con fibroblastos. Otros investigadores informaron de que NO pueden también regular iNOS transcripción a través de una retroalimentación negativa mediante la inhibición de NF-κ B se unen al DNA [27]. En nuestros experimentos, la adición de una pequeña cantidad de los inhibidores de la sintetasa del óxido nítrico, L-NAME, el aumento de la transcripción de iNOS mRNA sólo en la EPA, más LPS tratados fibroblastos normales. Sin embargo, el aumento de iNOS expresión en la EPA, más LPS tratadas las células no se han traducido en el aumento de óxido nítrico (nitritos), la producción, además de la EPA y de las células tratadas LPS producido menos de óxido nítrico que los tratados de control de AA o de las células. La menor cantidad de óxido nítrico con la EPA, más LPS tratamiento expresión iNOS puede aumentar debido a la disminución de votos negativos en la NF-κ B se unen al DNA (Figura 4, 5]. La observación de que el aumento de iNOS expresión en la EPA tratados con células no conduce a un aumento de la producción de NO, puede explicarse por alteración posterior a la regulación transcripcional que conduce a la reducción de la síntesis de la proteína iNOS y, por tanto, disminuyó la producción de NO.

La reducción de NO en las células tratadas EPA, a pesar de que es el aumento de la transcripción de iNOS mRNA, también puede estar vinculada a la producción de PGE 2 en estas células. La cantidad de PGE 2 producido por la fibroblastos 3T3 fue inversamente proporcional a la cantidad de óxido nítrico producido. PGE 2 se unen a los receptores de GPE (EP1, EP2, EP3, y EP4) que activar la señalización de la proteína kinasa C (PKC) o AMP cíclico (AMPc). Las células tratadas con AA son sobre todo sensibles a la señalización de los receptores de EP1 (PKC señalización), mientras que la EPA tratados son principalmente las células sensibles a EP2 y EP4 señalización (señalización cAMP) [5]. Ácido araquidónico por sí solo se ha demostrado que funcionan como un segundo mensajero y activar la PKC. La mayor cantidad de PGE 2 en células tratadas AA-y la estimulación de la PKC a través de la vía de señalización del receptor de EP1 (por ejemplo, la activación de PKC) puede afectar después de la traducción de la síntesis de la proteína iNOS. Otros estudios definido el papel de la PKC en la inducción de la iNOS por el NF-κ B itinerario en fibroblastos 3T3 murino [28] y la acción sobre el óxido nítrico angiogénesis [29].

El óxido nítrico regula la producción de PGE 2 en una manera divergente. El óxido nítrico estimula la liberación PGE 2 en macrófagos [30, 31] mientras endógena de NO inhibido en la producción de PGE 2 LPS-estimulado macrófagos [32]. El doble efecto de NO sobre la producción de PGE 2 puede ser debido a los diferentes efectos sobre la ciclooxigenasa (COX) isoformas. Estudio de la isoforma COX deficiente murino fibroblastos reveló que NO cambió la producción de PGE 2 por la activación de la COX-1, pero la inhibición de la COX-2 [30]. Otros estudios demostraron que las bajas concentraciones de óxido nítrico atenuar la producción de PGE 2 inducida por LPS, en parte, debido a una disminución de la expresión de la proteína COX-2 [33]. Sin embargo, LPS activación de la NF-κ B vía pueden influir en la COX-2 por la expresión de genes directamente alterando la COX-2 mRNA transcripción [34]. Nuestros resultados muestran que la inhibición de NO con L-NAME, disminución inducida por LPS PGE 2 en la producción normal de los fibroblastos 3T3-suiza. Así, la producción de PGE 2 en fibroblastos 3T3-suiza puede estar regulada en la COX-2 a través de la transcripción NF-κ B, o la vía de la COX-2 después de la traducción a través de la producción de NO derivado a través de la sintetasa del óxido nítrico. La combinación de tratamiento AGPI (EPA), más el bloqueo de la producción de óxido nítrico con L-NAME, dio lugar a un efecto sinérgico que el aumento de la producción de colágeno en comparación con el control de los fibroblastos.

La supresión de colágeno tipo I, la expresión de genes por PGE 2 puede ser mediado por tanto alterar la cantidad y el estado de ARNm de colágeno [35, 36]. Curiosamente, la inhibición de la actividad de iNOS se ha demostrado que tanto lenta la producción de colágeno en el proceso de cicatrización y también favorecer la deposición de colágeno y el desarrollo de la fibrosis [37]. Es la hipótesis de que NO scavenged especies reactivas de oxígeno por formación de peroxinitrito, y la inhibición de iNOS bloqueado NO contribuido a la formación y el desarrollo de la fibrosis [37]. Por lo tanto, la inducción de la iNOS apropiado de la NF-κ B vía de señalización puede ser un mecanismo de control tanto en la formación de colágeno y la fibrosis adecuada cicatrización de la herida.

Los cambios en la formación de colágeno también se han correlacionado con la concentración de NO producido. La producción de colágeno (CP) y colágeno como porcentaje del total de proteínas (C-PTP) se incrementó en LPS y el interferón-γ (IFN-γ) incubados herida derivados murino fibroblastos [13]. NO tratamientos adicionales de disminución de los inhibidores de la sintetasa de la CP y C-Senderos de la Paz en el mismo estudio. Sin embargo, LPS e IFN-γ en conjunto, disminuyeron, mientras que los inhibidores de la NO restablecido la producción de colágeno en humanos lámina propia del intestino delgado en fibroblastos [38]. Otro estudio en ratas normales fibroblastos de piel mostró que un donante de óxido nítrico en baja concentración mayor, pero en mayor concentración síntesis de colágeno vuelto de nuevo a niveles de control [4]. Cutánea fibroblastos de iNOS en los ratones knock-proliferado más lenta y menos colágeno sintetizado [15], y transfección con iNOS mejora la producción de colágeno cutáneo heridos en un modelo de rata [39]. En nuestros experimentos, LPS estimula la expresión de iNOS mRNA, la producción de NO, y la síntesis de colágeno en los fibroblastos 3T3-suiza. El adicional de incubación pequeña cantidad de L-NAME LPS a la disminución de la producción a un nivel bajo, pero el aumento de la expresión de iNOS mRNA y de la producción de colágeno.

Healing fibroblastos son fenotípicamente se caracteriza por cambios en la producción de colágeno, la proliferación de las células, y la migración. Herida células han demostrado aumentar la expresión de iNOS y la producción de NO en diversos modelos [13, 40]. La inhibición de la iNOS reepithelialization retraso en la reparación de heridas cutáneas [41]. El retraso en la reparación de heridas en ratones knockout iNOS se invirtió por iNOS la transferencia de genes [42]. Curiosamente, el papel del óxido nítrico en la proliferación de las células después de herir depende de la concentración [4]. En baja concentración, NO promueve la proliferación de células murinas en fibroblastos [43], mientras que en concentraciones mayores, NO disminución de la proliferación de fibroblastos de piel de rata cutánea [4]. El presente estudio demostró que el tratamiento de L-NAME sola inhibe la producción de NO y disminuyó el porcentaje de superficie celular recoverage en fibroblastos 3T3-suiza. Sin embargo, el tratamiento de L-NAME a los fibroblastos estimulados por LPS aumento de la proliferación celular y la migración en comparación con los tratamientos LPS solos. L-NAME sí solo puede bloquear el efecto del óxido nítrico en baja concentración mientras que la adición de L-NAME además de la disminución de LPS LPS NO inducido a un bajo aumento de la concentración y la formación de colágeno, la proliferación de las células, y la migración. La indometacina, un inhibidor de la ciclooxigenasa, el aumento del porcentaje de superficie celular recoverage fibroblastos en la estimulación con LPS. La disminución de PGE 2 inducida por la indometacina también estimula la cicatrización de la herida en fibroblastos 3T3-suiza.

En resumen, hemos demostrado que el NO iNOS y proporcionar una cruzada hablar entre la activación de la NF-κ B vía PGE 2 y en la AGPI fibroblastos alterada la producción de colágeno y la cicatrización de heridas. El uso de AGPI de regulación de la formación de colágeno en la cicatrización de heridas o la fibrosis se necesitará más experimentos con el fin de determinar la forma en que pueden ser utilizados como adyuvantes. Lo más probable es que será necesario utilizar un determinado tipo de ácidos grasos (por ejemplo, n -3, n -6, n -9) apropiado para el tipo de herida y la etapa de cicatrización de la herida. Además, el uso de ácidos grasos en combinación con la selección de los factores de transcripción y mediadores (por ejemplo, la estimulación o inhibición) que regulan la formación de colágeno proporcionará el nivel de control necesario para adaptar el protocolo de tratamiento para el tipo de herida.

Métodos
Reactivos

Reactivos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, a menos que se especifique lo contrario.

Cultivo de células y ácidos grasos de enriquecimiento

Fibroblastos de ratón (3T3-suizos albinos; American Type Culture Collection CCL-92, Rockville, MD) se mantiene como subconfluent monomoleculares y en seis placas (Corning Costar, Cambridge MA) con Dulbecco modificada del medio Eagle (MEDM), 4 mM L - Glutamina, 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 4,5 g / L de glucosa, y el 10% de suero bovino ternero (Hyclone, Logan, UT). Subconfluent culturas crecido de 24 Horas en medio de mantenimiento se lavaron dos veces y cambió a un nuevo medio, menos suero de ternera. En lugar de suero, el medio de control se completó con 5 mg/100 ml de ácido graso libre de albúmina de suero bovino (BSA), y el ácido graso enriquecido los medios de prueba se complementaron con BSA-cargados de jabones de ácidos grasos de ácido araquidónico (AA, 20 : 4 n -6) o eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5 n -3) (Nu-Chek Prep, Elysian, MN) a una concentración final de 25 μ M. Las células se cultivaron durante 48 h en la prueba de los medios de comunicación antes de la adición de los tratamientos se describe a continuación.

Herida de ensayo in vitro

In vitro de la cicatrización de heridas de ensayo se utilizó para evaluar la migración y la proliferación de fibroblastos 3T3-Suiza como estudios anteriores [9]. En pocas palabras, una pipeta de punta estéril se utilizó para hacer una de 0,5 mm de ancho de la herida por rayas a través de una monocapa de fibroblastos 3T3 suizos. La herida fue creado cuando las células fueron aproximadamente el 80% confluente después de las primeras 48 h polyenoic de ácidos grasos (PFA) y de enriquecimiento de la migración de los fibroblastos en la herida se midió en 24 Horas después heridas. Múltiples fotografías de la herida se obtuvieron mediante microscopía de contraste de fases, y la media de las zonas de la célula recoverage para cada muestra se determinaron con software de análisis de imágenes (Optimas 6,1, Medios de comunicación cibernética, Silver Spring, MD). El porcentaje de celulares recoverage a toda la zona de la herida se le midió el área para evaluar los efectos combinados de la proliferación celular y la migración.

Un conjunto similar de las placas se utilizó para realizar el intercambio en tiempo real de RT-PCR iNOS, la cuantificación de nitrito y PGE 2, y la síntesis de colágeno. Por tiempo real de RT-PCR y la cuantificación de nitrito y PGE 2, el siguiente protocolo fue utilizado. Después de las primeras 48 h de enriquecimiento de PFA, los medios de comunicación se cambió con frescos de mediano enriquecido en ácidos grasos que contienen Eshericia coli O55: B5 lipopolisacárido (LPS, 10 μ g / ml) con o sin N G-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME , 10 -7 M) y la indometacina (INDO, 10 -8 M). Lipopolisacárido se utiliza para activar el NF-κ B, y la vía de imitar algunos aspectos de la inflamación in vivo. Para la formación de colágeno, después de las primeras 48 h polyenoic de ácidos grasos (PFA) de enriquecimiento, los medios de comunicación se ha sustituido por un nuevo medio enriquecido en ácidos grasos que contiene 50 μ M de ácido ascórbico y 5 μ Ci, de 3 H-prolina (Amersham, Arlington Heights IL), con o sin Tratamientos. A las 24 horas posteriores heridas, una parte de los medios de comunicación han sido recogidos y las células fueron cosechadas. Placas paralelas también eran cultivadas con los mismos tratamientos, pero sin herir. Las células de todos los tratamientos utilizados en estos experimentos tenían más del 99% de viabilidad basado en el estándar de azul de tripan tinte de exclusión de pruebas.

ARN aislamiento y la síntesis de ADNc

Después de las células fueron lavadas con Hank equilibrado de solución de sal y cosechada, ARN total fue aislado utilizando un kit disponible comercialmente (RNAqueous, Ambion, Austin, TX) y digeridos con RNasa libre de DNasa, según lo recomendado por el proveedor. La concentración y la pureza del RNA total se determinaron midiendo la densidad óptica a 260 y 280 nm. La relación de la absorbancia a 260 nm a 280 se 1.8-2.0. Dos μ g ARN total fue transcrita invertir utilizando un Kit de síntesis cDNA (cDNA Síntesis iScript ™ Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) siguiendo las instrucciones de la fabricación. CDNA generados se diluye con ARN libre de agua antes de su uso.

Real-time RT-PCR

CDNA sintetizado codificación para murino iNOS y β-actina (como endógenos de control) fueron amplificados y analizados por un tiempo real de la transcripción invertida de la reacción en cadena de polimerasa (tiempo real RT-PCR) sistema (Applied Biosystems 7300 Sistema PCR en tiempo real, Foster City, CA ). Los oligonucleótidos utilizados fueron diseñados por software Primer Express (Primer Express 2,0, Applied Biosystems) y ordenados de IDT (integrada de las tecnologías de ADN, Coralville, IA). Las secuencias de cDNA se obtuvieron de la base de datos de genes, como se indica en el cuadro 1. Amplificaciones de PCR se realizaron según el protocolo de fabricación. Las muestras se prepararon en un volumen total de 50 μ l que contiene 2 μ l cDNA muestra (diluida 1x, 10x, 100x, 200x), 25 μ l SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 1 μ l cada cebador, y el 21 Μ l de agua libre de RNA. Para cada reacción, la polimerasa se inició a 50 ° C durante 2 min y 95 ° C durante 10 minutos, y luego de amplificación se realizó a los 35 ciclos de conmutación entre los 95 ° C durante 15 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, y 72 ° C durante 15 segundos, seguido por el análisis de punto de fusión de 60 ° C hasta 95 ° C. Todas las muestras se realizaron por triplicado y el coeficiente se determinó mediante la creación de un estándar de la curva de valores tramando C T vs total de la ARN. Los resultados se presentan como la expresión mRNA porcentaje de iNOS a β-actina.

La cuantificación de nitrito

Nitrito (NO2-) en la cultura se midió sobrenadantes para determinar la síntesis de NO como otros estudios [17]. Cultura sobrenadantes (100 μ l) se mezcló con un volumen igual de reactivo de Griess (1% sulfanilamide, 0,1% naphthylethylene diamine dihidrocloruro y el 2,5% de ácido fosfórico) y se incuba a la temperatura ambiente con luz atenuada durante 10 min. Nitrito se mide a 550 nm por un lector de microplacas (EIA lector de 2550, Bio-Rad, Hercules, CA), utilizando el doble de agua destilada como blanco y el nitrito de sodio para generar una curva estándar.

Cuantificación de PGE 2

Evaluación del total de la prostaglandina E 2 (PGE 2) la cantidad de medio de fibroblastos 3T3-suizo de incubación se preformados por un kit ELISA (monoclonales prostaglandina E 2 EIA Kit-514010; Caimán Química, Ann Arbor, MI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante recomienda Protocolo.

El colágeno ensayo

El colágeno fue ensayada como se describe anteriormente [5]. Los medios de comunicación recogen y se lavan las células dos veces con frío buffer fosfato salino (PBS). Las células fueron pildoradas por centrifugación y el sistema de cartilla de lavado combinado con los medios de comunicación fracción. La bolita de células, suspendida en 1,0 ml de hidróxido de amonio-Triton X-100 lisis celular solución (AT solución). Después de 15 minutos de incubación a 37 ° C, 750 μ l del lisado se combina con los medios de comunicación fracción. Las dos fracciones, de células y de los medios de comunicación, y luego se sometieron trichloroaceticic ácido (TCA) de precipitación (igualdad de volumen de 20% TCA añadido a la fracción de células, más los medios de comunicación). El ácido insoluble precipitado fue entonces enjuagarse varias veces con el 10% para eliminar los TCA libre 3 H-prolina. El precipitado se vuelve a 0,05 N NaOH 0,05 M en TES de amortiguación, más 0,005 M CaCl 2 y la mitad de la solución incubaron durante 6 horas a 37 ° C con la proteasa libre de la colagenasa Tipo VII (100 U / mL) en TES y la otra mitad De la solución servido como control. Después de la digestión, TCA fue de nuevo añadido para precipitar las proteínas insolubles en el ácido, sin embargo, el colágeno fragmentos generados por la colagenasa tratamiento no están en solución. El sobrenadante y precipitado fueron contados en un contador scintillation y colágeno, no colagenosa, y el total de la producción de proteínas como DPM / μ g de ADN.

ADN de ensayo

Los restantes 250 μ l de la solución AT-lisado celular de la síntesis de colágeno ensayo se utiliza para la determinación de ADN total. Picogreen, 50 μ l (Molecular Probes, Eugene OR) fue agregado a 50 μ l de lisado o 50 μ l de ADN conocidas normas y fluorescencia de la unión a doble tinte varados ADN se midió en un spectofluorometer. A nivel de ADN, se ha generado por la curva de regresión lineal y los valores de ADN se utilizó para obtener los valores desconocidos.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como medias ± desviación estándar (DE) y analizados por tanto de una vía y de dos vías ANOVA procedimientos de SAS (SAS Institute, Cary, NC). Un test de Tukey fue usado para el análisis de importantes efectos principales y la interacción. Un valor de p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado en parte por una subvención del Estado de Indiana Siglo 21 Fondo de la Investigación y la Tecnología. El autor gracias Ingrid A. Schoenlein de asistencia técnica.