Theoretical Biology & Medical Modelling, 2005; 2: 25-25 (más artículos en esta revista)

La identificación y el aislamiento de células madre embrionarias en endocrinología reproductiva: teórica protocolos para la conservación de embriones humanos derivados de la fertilización in vitro

BioMed Central
Eric Scott Sills (dr.sills @ ivf.com) [1], Takumi Takeuchi (ttakeuchi@med.cornell.edu) [2], Noriko Tanaka (not2003@med.cornell.edu) [2], Queenie V Neri ( Qneri@med.cornell.edu) [2], D Gianpiero Palermo (qneri@med.cornell.edu) [2]
[1] Georgia Reproductive Specialists LLC, Division of Reproductive Endocrinology and Infertility, Department of Obstetrics and Gynecology, Atlanta Medical Center; Atlanta, Georgia 30342 USA
[2] Cornell Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Medical College of Cornell University, New York, New York 10021 USA
[3] Street, New York, New York 10021 USA

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Resumen
Antecedentes

Las células madre embrionarias (ESC) son pluripotentes células obtenidas de la masa celular interna (ICM) de blastocistos derivados de cultivo in vitro asociada a la terapia endocrinología reproductiva. CES humanos se consideran como muy importantes, ya que conservan la capacidad de diferenciarse en cualquiera de los aproximadamente 200 tipos de células únicas. CES Humanos de la investigación es controvertida debido a la adquisición de tales células, el ICM de blastocistos humanos deben ser manipulados de una forma que hace que los embriones inviables e inadecuadas para la transferencia en el útero. Técnicas para producir competente CES con la conservación de los blastocistos fuente para satisfacer los requisitos de muchas objeciones contra la CES investigación, pero en la actualidad esos criterios siguen en gran medida sin revisar.

Resultados y discusión

Estamos contraste experimental de la cultura única blastomeres obtenidos por 1) la biopsia no destructiva de embriones destinados a la transferencia, y 2) el aislamiento de karyotypically normal blastomeres desde desglosados ( "muertos") embriones considerados inadecuados para la transferencia, y la evaluación de estos enfoques con respecto a Producción de la CES. Pluripotencia fue confirmado por criterios morfológicos y por divergentes homeodomain cuantificación de las proteínas específicas de desarrollo de las células indiferenciadas. Tras CES aislamiento y la identificación, la evaluación se realizó de acuerdo a un nuevo sistema de clasificación del CES, también se propone aquí.

Conclusión

El papel de la CES en endocrinología reproductiva de la investigación sigue siendo fundamental. En este informe, que postula nuevas y ampliar las estrategias existentes que tengan el potencial humano para mejorar la CES aislamiento, identificación y conservación in vitro.

Antecedentes

Si bien la caracterización definitiva de las células madre embrionarias murinas se registró por primera vez en 1981, las células madre embrionarias (CES) no eran totalmente aislados y se describe en seres humanos hasta mucho más tarde [1]. Sin duda, la escasa oferta de los CES humano en combinación con la técnica de los retos asociados con la traducción entre la derivación de células madre contribuido a la largo intervalo entre estos informes. Para obtener CES humanos, los embriones producidos durante la fertilización in vitro (FIV) se mantienen en la cultura extenderse a la etapa de blastocisto (4-5d posterior fertilización) cuando la polarización interna de la célula masa (ICM) desarrolla. El exterior trophoectoderm se elimina a través de immunosurgery, exponiendo así a la ICM para el desglose y enchapado en una capa de células de alimentación para seguir la cultura. Es importante destacar que este proceso hace que los perturbadores de embriones no viables y no apto para la transferencia en el útero [2]. Homogéneas humanos CES colonias pueden ser derivados de aislamiento y posterior re-enchapado de la ICM células, que luego se hacen pruebas de stemness por una variedad de reconocidas marcas.

Una vez estable en la cultura, son capaces de CES ya sea simétrica (clonigénicas) o asimétrica fisión. CES división simétrica se obtiene un auto-renovación de la oferta de pluripotentes CES, mientras que la división asimétrica produce una célula idéntica a la CES más uno de los padres de células diferenciadas. El mecanismo (s) responsables de la modulación de estos patrones específicos CES fisión siguen siendo poco conocidos. En cualquier caso, ya que aún no es posible-a diferencia de las células somáticas se comprometieron en volver a la pluripotencia, asociados con la FIV los embriones hasta la fecha han sido la única fuente para la CES. El hecho de que viven los embriones humanos deben ser destruidos para producir humanos CES presenta un importante obstáculo ético para el adelanto de la investigación del CES humanos. Con la gran promesa terapéutica de la CES visto contra la destrucción de embriones humanos necesarios para hacer realidad esas aspiraciones, argumentos se han articulado tanto en el apoyo y en contra de la investigación CES humanos [3, 4].

Hay que reconocer que hasta ahora han proporcionado humanos CES no reproducible, seguro, único y previamente inalcanzables para cualquier tratamiento de las enfermedades humanas. No obstante, el interés en la exploración de la posibilidad de la plena terapéutica humana CES sigue creciendo y ya no se limita a los científicos y médicos endocrinólogos reproductiva - de hecho, que ahora incluye a la opinión pública y los dirigentes médicos y los consumidores [5]. Sin embargo, las preocupaciones de los humanos de la investigación del CES no son opositores sin justificación ética; estas objeciones podría ser sustancialmente assuaged si es seguro y eficaz de laboratorio se podrían desarrollar protocolos que se ofrecen humanos CES al mismo tiempo (o al menos no destruir) el blastocistos a partir de la cual se originó. En este artículo presentamos los resultados de los estudios piloto sobre la base de algunos enfoques teóricos, de manera de facilitar la investigación y la CES humanos para promover el respeto de los embriones humanos obtenidos de la práctica clínica endocrinología reproductiva.

Células madre de embriones humanos: enfoques teóricos
Impacto de mosaicismo en CES derivación

Poco después de la primera experiencia clínica con el diagnóstico genético de preimplantación se informó de [20], se sugirió que blastomere mosaicismo podría contribuir a la clínica observada en la tasa de error del PGD [21]. El precepto de que no todos son necesariamente equivalentes blastomeres posteriormente ha surgido como un principio reconocido en embriología humana, que ocupa un lugar destacado en el consentimiento informado para los pacientes contemplando PGD [22]. Actualmente, una técnica para determinar el grado de mosaicismo embrión sin desmontar el embrión (y, por tanto, que los haga inviables) no existe. En consecuencia, presenta mosaicismo potencialmente graves deficiencias de las dos propuestas del CES técnicas descritas aquí, ya que la eficacia de cada método se ve afectada por la medida de blastomere mosaicismo, que no puede ser conocido a priori.

Sin embargo, para los dos protocolos teóricos CES presentamos, el impacto de mosaicismo embrión no es el mismo y cada caso merece una consideración aparte. Por ejemplo, si el PGD + blastomere biopsia y método de cultivo se aplicaron a los embriones con amplia blastomere heterogeneidad, este enfoque sería poco probable que chromosomally producir las células normales in vitro, para su posterior CES cultura. Si, no obstante, muy limitados con embriones, o si no mosaicismo se utilizan para el proyecto de PGD + blastomere proceso de la cultura, la producción CES humanos podría proceder con mucha más probabilidad, dada la uniformidad de todas las células de la muestra. Dado el alcance de desconocidos embrión mosaicismo, las limitaciones de la biopsia blastomere solo se han reconocido [22] y algunos investigadores han recomendado confirmación PGD por un segundo muestreo blastomere [23]. Por el contrario, entre blastomeres obtenidas de la desagregación de embriones inviables, sería razonable esperar una mayor frecuencia de mosaicismo. En ese entorno, incluso limitada mosaicismo arrojaría el resultado deseable basa en la presencia de al menos un constituyente blastomere genéticamente normales dentro de un embrión organismically muertos.

Evaluación objetiva de las colonias CES

Aunque se necesitan recursos considerables a la cosecha y propagar CES, métodos eficaces para verificar y controlar la calidad stemness en esas células son también necesarias para lograr toda la gama de posibilidades terapéuticas en el punto de mira. En un esfuerzo por desarrollar un sistema de evaluación de los CES, nuestro centro murino blastocistos cultivados en fibroblastos de ratón en los medios de comunicación experimental complementada con 2000 UI / ml ratón recombinante leucemia factor inhibitorio. A 4-5d, la ICMs son mecánicamente aislados y desglosados por tripsina. Cell pasajes se repitieron × 2-3d, según sea necesario, de acuerdo a la colonia confluency.

Nuestro CES colonias fueron clasificados sobre la base de tres factores: 1) el número de colonias, 2) la densidad de colonias, y 3) la calidad de colonia. Estamos decididos colonia de caracteres morfológicos de la evaluación utilizando un microscopio invertido con contraste de fase óptica. Normalmente, los CES son grandes y demostrar un alto nuclear: ratio citoplasma (Figura 3]. Cada colonia se clasificó de acuerdo a la proporción de las células madre presentes en la colonia, cuando> 70% (bueno), 40-70% (promedio), o <40% (pobres) son las tres divisiones. Para todas las colonias CES, la actividad de la fosfatasa alcalina y Octubre-4 fueron utilizados como marcadores de totipotency. TROMA-1 anticuerpo (monoclonal) contra citoqueratina-como filamentos de las células endodermales trophectoderm y sirve como un marcador negativo. Como un adicional control de estos marcadores fueron probados en ampliado blastocistos. Las muestras fueron fijadas con paraformaldehido 4% y permeabilized con 0,2% Triton X-100. Actividad de la fosfatasa alcalina en células fijo se detectó a través de tintes azoicos-Texas-con filtro rojo bajo microscopía de fluorescencia. CES fueron expuestos a octubre-4 de anticuerpos policlonales (1:100 dilución) y TROMA-1 monoclonal de anticuerpos (1:6 dilución), seguido de enjuague con PBS / BSA para eliminar los anticuerpos sin encuadernar. A partir de estos experimentos, se obtuvieron 16 murino CES líneas de 164 blastocistos fuente. Las evaluaciones a través de la fosfatasa alcalina y Octubre-4 para verificar la pluripotencia de las líneas de la CES están de acuerdo (χ 2 = 0,105), mientras que TROMA-1 identificó endoderm y trofoblasto. Pluripotencia se ha confirmado en al menos algunas células de cada colonia estudiado, y se pudo establecer concordancia entre criterios morfológicos y marcador de la actividad. Más estudios serán de ayuda para mostrar si parámetros adicionales CES puede refinar este sistema de puntuación.

La investigación con células madre: los factores sociales y políticos

Pública de compartir la información sobre la ciencia básica de la CES ha demostrado ser importante, ya que los que son conscientes de las células madre de debate tienden a ser más de apoyo de la investigación en este ámbito en comparación con aquellos menos familiarizados con el tema [24]. A la opinión pública nacional estudio (n = 1512) realizada en 2004 encontró que una ajustada mayoría (52%) de los estadounidenses respecto del adelanto de la CES como la investigación más importante que la destrucción de embriones; cuando esta cuestión se plantea sólo dos años antes, el apoyo a la CES La investigación fue del 43% [24].

Debate sobre humanos CES investigación contra un tormentoso sociopolíticas de fondo - una circunstancia que no se diferencia de los avances anteriores en la banca de esperma, anticonceptivos orales, la fertilización in vitro y la inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Para CES, el debate fue vocal y se intensificó rápidamente a los más altos niveles de gobierno. En respuesta a la Presidencial de 2005 el Estado de la Unión, algunos dirigentes en el Congreso de los EE.UU. han propuesto normas para autorizar más amplia utilización de embriones humanos en la investigación. En concreto, está prevista legislación para permitir la investigación con embriones humanos pero sólo si tales embriones han sido "éticamente derivados" - es decir. Embriones desarrollados a los efectos de la FIV que de otra forma serían descartados [25]. Esta iniciativa de ley es aprobado por la Coalición para la Promoción de la Investigación Médica, la Asociación de Universidades de América, la Fundación de Investigación de Diabetes Juvenil, y la de Parkinson's Action Network, así como la Investigación y la Prevención del Cáncer Foundation.

Este tipo de financiación de la investigación federal actual estrategia de líneas de células madre embrionarias está en consonancia con el Presidente de la creencia en el valor fundamental y el carácter sagrado de la vida humana. La decisión del Presidente refleja un compromiso de preservar el valor y la santidad de la vida humana equilibrada con el deseo de promover la investigación médica vital. La Orden Ejecutiva permisos de la financiación federal de investigaciones con las más de 60 líneas de células madre existentes, pero no sanción o alentar la destrucción de nuevos embriones humanos. En efecto, los embriones de la que se originó la actual CES ya han sido destruidos. La financiación federal de la investigación médica sobre estas líneas de células madre existentes se promoverá la santidad de la vida "sin menoscabar" y permitirá a los científicos explorar la posibilidad de que esta investigación resulte beneficiosa para la vida de millones de personas que padecen enfermedades de la destrucción de la vida.

Sólo algunas líneas celulares se considerarán elegibles para el gobierno federal-patrocinado humanos CES investigación. Estas líneas celulares debe ser derivados (1) con el consentimiento informado de los donantes, (2) de los no transferidos embriones creados exclusivamente con fines de reproducción, y (3) sin ningún tipo de incentivos financieros a los donantes. Con el fin de garantizar que los fondos federales se utilizan para apoyar la investigación que sólo CES es científicamente sólida, legales y éticos, el INS examinará la derivación de todas las líneas de células madre existentes, y crear un registro de esas líneas, que satisfagan estos criterios. Hasta el momento, 23 líneas CES han demostrado viables y han cumplido con los criterios NIH, aunque hasta el 60 de las líneas existentes CES genéticamente diversas poblaciones son elegibles para la investigación financiados por el gobierno federal [26].

Conclusión

Aunque otros investigadores han señalado que por el momento no es posible transformar una sola blastomere en células madre sin recurrir a la formación y la destrucción intencional de todo blastocistos [16], en nuestros estudios de novo embriones no fueron generados. De hecho, sólo ICM-como grupos de células se obtuvieron para un análisis más detallado. Perfeccionamiento y aumento de la eficiencia de estos dos protocolos CES trae el potencial para ofrecer un suministro fiable de las células madre embrionarias sin producción de embriones o comprometer su conjunto existente de otra fuente blastocistos seleccionados para la transferencia de embriones o la crioconservación.

Nuestro trabajo confirma la importancia de identificar los factores que facilitan el crecimiento y la diferenciación de inhibir la CES. Liberación de un alimentador de células pueden ser requisito indispensable para ciertos tipos de experimentos, así como para la producción de células para el trasplante [27]. Pese a la amplia experiencia de embriones de ratón con células de fibroblastos de alimentación de las capas de la "cultura", exactamente lo que estas células de alimentación para proporcionar CES aún no se ha caracterizado a nivel molecular. Microarray tecnología aplicada a la biología del embrión temprano promete responder a muchas de esas preguntas. Sin embargo, como esfuerzo continuado se aplica a elucidar estos mediadores, una oferta adecuada de la fuente CES será fundamental para todo el proceso. Desde esta perspectiva, nuestro trabajo en un modelo murino ofrece algunos nuevos enfoques que permiten avanzar en la investigación que el CES no dañar o destruir embriones humanos existentes. Es de esperar que un mayor estudio de la biopsia del embrión + cultura, así como blastomere donación de los embriones no viables permitirá CES éticos de investigación para alcanzar su pleno potencial.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

ESS, TT, NT, QVN PIB y contribuyeron por igual a este trabajo. PIB concebido del proyecto, coordinó la investigación, y editado el manuscrito.