PLoS Computational Biology, 2005; 1(2): (más artículos en esta revista)

El silenciamiento de ARN vía: los bits y piezas que importa

Marian A. C Groenenboom [*], Atanasio F. M Marée, Paulien Hogeweg
Resumen

Celular vías son regularmente propuestas sobre la base de los conocimientos experimentales disponibles. El proyecto de las vías, sin embargo, pueden ser inadecuados para describir los fenómenos que se supone que explicar. Por ejemplo, a través de modelos matemáticos concisa somos capaces de revelar las deficiencias en la descripción actual de la vía de silenciamiento de ARN. El silenciamiento opera por vía de dsRNA cleaving siRNAs. SiRNAs puede asociarse con RISC, que llevan a la degradación de la meta ARNm. Proponemos y analizar algunas pequeñas ampliaciones de la vía: un ARNsi degradantes RNasa, cebados de amplificación de RNA aberrantes piezas, y la cooperación entre aberrantes de ARN para activar la amplificación. Estas extensiones permiten una explicación coherente para silenciar a los diversos tipos de fenómenos, como los inducidos por el virus de silenciamiento, y transgén transposón induce silenciamiento, y evitar la auto-reactividad, así como por las diferencias encontradas entre los grupos de especies.

Introducción

ARN silenciar la célula eucariótica protege contra virus y transposones. Los virus producen doble varados RNA (dsRNA) durante la reproducción, que puede activar el silenciamiento de ARN viral [1, 2]. Silenciamiento de ARN también puede ser desencadenada por una relación suficientemente alta expresión de los transgenes, un mecanismo conocido como co-represión o silenciamiento de transgenes inducida [3 - 6]. La activación del transgén inducida silenciamiento de ARN está directamente relacionado con la actividad de la RNA polimerasa de ARN dirigida (RDR): sobreexpresión de RDR reduce significativamente el número de los transgenes necesarios para inducir el silenciamiento de ARN [7]. Silenciamiento de ARN mutantes deficientes muestran una mayor expresión de transposones [8, 9]. Transposones podría desencadenar ARN para silenciar a dos posibles razones: a menudo tienen múltiples repeticiones invertidas (IR) que forma dsRNA transcripciones [10], y su alto número de copia podría desencadenar silenciar.

El itinerario propuesto actualmente silenciamiento de ARN se muestra en la Figura 1. En general, el proceso es iniciado por la división de dsRNA por Dicer. Dicer, una RNasa III-clase de enzimas, en los procesos de dsRNA ARN interferentes pequeños (siRNAs) 21-25 nucleótidos de largo. SiRNAs puede ser incorporado en el silenciamiento de ARN inducida complejo (RISC) y "guía" a través de la compleja antisentido base-apareamiento. Esto da lugar a la división de la meta ARNm cerca del centro del ARNsi. Nos referimos a la aberrante trozos de ARN después de división como "basura RNA". Sijen et al. [11] encontraron que una fracción importante de la siRNAs en Caenorhabditis elegans no es derivado directamente de la introdujo dsRNA. Para explicar esto, la amplificación de dos vías que se han propuesto: cebados y unprimed amplificación [12 - 14]. En ambos casos, el RDR sintetiza dsRNA: en el caso de cebadas de amplificación ARNsi une al ARNm para iniciar dsRNA síntesis, mientras que en el caso de unprimed amplificación de la mera presencia de RNA aberrante basura es suficiente para activar la RDR. En resumen, la aceptación general de la vía de silenciamiento de ARN consiste en la degradación de mRNA a través de RISC y un itinerario a través de la amplificación RDR.

Aunque suena razonable que esa vía sería suficiente para montar las respuestas contra los virus y transposones, que muestran que el itinerario propuesto tiene graves limitaciones. Vamos a demostrar que no puede describir correctamente las observaciones de transitorios y sostenido de silenciamiento y de la dosis de dependencia. Por otra parte, esta vía sería muy vulnerable para el montaje de las respuestas en contra de la libre. Por último, vamos a mostrar que no puede describir transgén inducida por silenciar a todos. A continuación proponemos tres adiciones al mecanismo: (i) un ARNsi degradantes RNasa, (ii) a prueba de amplificación de ARN de basura, y (iii) la activación de RDR depende de la cantidad de basura ARN. La propuesta de cada uno de los modelos de dar una explicación coherente para silenciar a los diversos tipos de fenómenos, es decir, inducida por el virus de silenciamiento, y transgén transposón induce silenciamiento, la protección contra la auto-reactividad, así como por las diferencias encontradas entre los grupos de especies. Las extensiones, sin embargo, ¿son las mismas en las que predecir la dinámica, que podría utilizarse para discriminar entre ellos experimentalmente.

Resultados
Antecedentes biológicos y descripción de modelo básicas

Estudiamos el silenciamiento de ARN conciso itinerario utilizando modelos de ecuación diferencial con la cinética de acción de masas. Hay fuertes indicios de que existe un núcleo común de la vía de silenciamiento de ARN presente en todos los organismos capaces de silenciamiento de ARN. Nos centramos en el núcleo común experimentalmente derivados de silenciamiento de ARN (Figura 1 y la Introducción), que es la base de nuestro modelo. Estamos directamente traducir esta vía en un sistema de cuatro ecuaciones diferenciales ordinarias junto,

En la que M, D, S, G y describir la cantidad de mRNA, dsRNA, ARNsi, y aberrantes piezas de basura, respectivamente. ARNm se transcribe con una tasa i degradados y con una tasa d m. DsRNA de ARNm es sintetizado por RDR, con una pequeña tasa de p, y es en cleaved n siRNAs con tasa de un. ARNsi puede asociarse con mRNA a través de RISC con tasa b. Para simplificar, no aplicar la formación de RISC explícitamente en nuestro modelo, en cambio, el ARNsi-mRNA complejo es degradado directamente en la basura RNA aberrantes. D e s d g describir la degradación de los siRNAs y aberrantes piezas de basura, respectivamente.

DsRNA también puede entrar en la vía, de manera que no sea a través RDR: un virus puede producir dsRNA, dsRNA puede introducirse o inyectadas, o una transcripción con forma impulsiva puede dsRNA. Estamos simular la introducción de dsRNA intracelular por un gradual aumento de la cantidad de dsRNA.

A fin de permitir la formación de siRNAs secundaria, extender el modelo con las dos vías de amplificación:

El plazo subrayó g 1 G describe el unprimed amplificación-la síntesis de dsRNA de RNA aberrante basura por RDR, y la audaz plazo g 2 SM-amplificación cebados describe la síntesis de dsRNA cebados por la presencia de un ARNsi de ARNm. Consideramos que la vía con y sin la amplificación.

Dinámica del modelo básico

El comportamiento de la vía, como el modelo anterior se muestra en la Figura 2. Los paneles superiores muestran el efecto de la introducción de dsRNA, homólogo a un gen endógeno. En primer lugar, el modelo de estudio sin amplificación, que debe ser representante de los mamíferos, en la que RDR no se ha encontrado [15]. En los mamíferos, dsRNA o siRNAs han de ser continuamente a mantener un gen silenciado. De acuerdo, el modelo sin amplificación permite sólo para transitoria respuestas: siRNAs derivados de la dsRNA causar una fuerte disminución en la cantidad de mRNA, después de que el valor por defecto es el equilibrio establecido una vez (Figura 2 A). Dado que el sistema sólo tiene un atractor, el celular siempre regreso a este atractor, que es el estado con niveles normales de mRNA. Sólo cuando dsRNA es suministrado continuamente, se mantiene el gen silenciado.

La amplificación de la respuesta a través de RDR se observa en los nematodos, plantas, lodo moldes, y hongos. La dinámica del modelo básico con cebados o unprimed amplificación son muy similares, por lo que sólo muestran los resultados obtenidos para el apresto de amplificación. En una baja tasa de amplificación, la dinámica no se diferencia del modelo sin amplificación (Figura 2 B), pero a un alto índice de la amplificación por defecto se convierte en equilibrio inestable, lo que resulta en perpetuo silenciamiento (Figura 2 C). Aunque la celda permanecerá en el estado por defecto, siempre y cuando siRNAs y dsRNA están completamente ausentes, de un solo capítulo o dsRNA ARNsi basta para activar el silenciamiento.

Un modelo de silenciamiento de ARN también debe ser capaz de explicar transgén inducida silenciar. Por eso, hemos analizado el efecto de aumentar el número de copias de genes. Estamos aquí por supuesto que cada gen copia tiene la misma tasa de transcripción, dado por el parámetro i. En el modelo sin o con una baja tasa de amplificación, un creciente número de copias lleva a un aumento proporcional de los niveles de mRNA (Figura 2 D y E). En cambio, cuando la amplificación tasa es alta, la cantidad de mRNA no depende del número de copias de genes (Figura 2 F). En este régimen, el celular está siempre en el estado silenciada, y por lo tanto la cantidad de mRNA por célula no puede aumentar. Por lo tanto, silenciar a transgén inducido no es posible en el modelo básico, con o sin amplificación se tiene en cuenta.

Deficiencias del modelo básico

El modelo básico sin amplificación es capaz de explicar sólo transitoria de las respuestas. En cambio, en plantas de silenciamiento de ARN se puede mantener incluso después de la eliminación de la desencadenar [16, 17], y, en C. Elegans silenciar incluso puede persistir durante más de una generación [18]. Intuitivamente parece plausible que la amplificación de la respuesta podría resolver este problema. El núcleo vía con amplificación, sin embargo, los resultados en todo o ninguno tipo de comportamiento: o bien sostenido es imposible silenciar, o de un solo capítulo o ARNsi dsRNA es suficiente para activar el silenciamiento perpetua. Esto significa que la dinámica de la vía central con amplificación implica inevitablemente la destrucción de la libre.

Este problema de la autodestrucción también ha sido observado por Bergstrom et al. [19]. En su modelo de estudio, añadieron unidireccional de amplificación, para obtener una respuesta transitoria de silenciamiento. La amplificación de las plantas, sin embargo, puede ser bidireccional [20], por lo unidirectionality no puede ser el único mecanismo que impide que las respuestas a la libre. Por otra parte, aunque unidireccional amplificación puede prevenir sostenido respuestas, que no impedirá que las respuestas transitorias dirigidas contra la libre, lo que implica la hipótesis poco realista de una infinita serie de auto-destructivos respuestas.

Otra gran deficiencia de la vía central es que no se pueden describir o explicar transgén inducida silenciar. Análisis matemático de las ecuaciones muestra que la incapacidad del transgén inducida silenciamiento y la de todo o ninguno tipo de comportamiento son inherentes propiedades básicas de la vía (véase Materiales y Métodos): la dinámica cualitativos no cambian cuando una parte o la totalidad de la masa Acción en términos de los modelos que se sustituirán por la cinética de Michaelis-Menten.

Llegamos a la conclusión de que para aliviar las limitaciones que se ha dicho, el modelo básico debe ser cualitativamente alterada. A diferencia cualitativa puede ser o bien un paso que falta en el itinerario, o algún efecto de cooperación entre ARN. Por otra parte, teniendo, por ejemplo, más detalles de la formación de los complejos RISC en cuenta, no haría el modelo cualitativamente diferente, y, por lo tanto, el modelo que todavía sufren de las mismas limitaciones. Es decir, este modelo de estudio muestra que el núcleo vía, que en general se presentan como el mecanismo básico, con las ampliaciones de la vía de la simple (sutil) modificaciones de la misma, es esencialmente incompleto, y por lo tanto no pueden ser considerados como el núcleo De la vía.

Antecedentes biológicos y descripción de la ampliación de los modelos

Nuestro objetivo es encontrar a las ampliaciones de la vía central que son capaces de proporcionar una visión en el tipo de interacciones necesarias para explicar la complejidad de silenciamiento de ARN. Estas vías ampliado debería ser capaz de describir las respuestas dependientes de la dosis y la posibilidad de actuar tanto transitorios y sostenido de las respuestas; transgén o transposón inducida silenciamiento, y evitar la auto-reactividad. Todos los modelos extendido necesidad de incluir al menos una de las vías de amplificación, para dar cuenta de secundaria y siRNAs para permitir sostenido silenciar.

En la primera prórroga, proponemos que, además de los no específicos ARNsi degradación de un ARNsi degradantes RNasa con saturar la cinética está involucrado ( "RNasa modelo"). Esta proteína ha sido recientemente encontrado en C. Elegans [21]. Suponemos que la RNasa ha cinética de Michaelis-Menten:

El porcentaje máximo de la degradación del ARNsi de la RNasa está dada por . La degradación no específica de siRNAs tiene que ser incluido en el modelo de RNasa: desde la RNasa tiene una saturada respuesta, el ARNsi niveles iría hasta el infinito sin que esto no específicos de la degradación.

En nuestra segunda prórroga, generalizar el proceso de amplificación cebados. Considerando que el modelo estándar en el proceso se limitaba a la amplificación de mRNA, suponemos que aquí siRNAs también puede obligar a la basura ARNm para activar la síntesis dsRNA ( "modelo de la basura"):

La tasa de dsRNA de síntesis preparado por la amplificación de ARN de basura se da por g 3.

Como tercera prórroga, que consideramos una revisada, unprimed amplificación. Estamos estudiando la posibilidad de que cualquiera de RDR se activa por la presencia de ARN de basura, o que hay otra forma de cooperación entre la basura y pedazos de ARN RDR. Esto se ha aplicado mediante la sustitución de la acción de masas unprimed amplificación por una sigmoide (unprimed) amplificación ( "modelo sigmoide"):

El porcentaje máximo de unprimed dsRNA por RDR síntesis está dada por .

Dinámica de la ampliación de los modelos

El problema con el apresto y unprimed amplificación en la vía central es que el número de primaria secundaria siRNAs por ARNsi es básicamente independiente de la dosis inicial. En consecuencia, los resultados de amplificación, ya sea en la explosión de la reacción, en el caso de que el número de primaria secundaria siRNAs por ARNsi es entonces un concepto más amplio, o la reacción va a morir, en el caso de que el número de primaria secundaria siRNAs por ARNsi es más pequeño que Uno. En cambio, en el ampliado el número de vías secundarias siRNAs se convierte en dependientes de la dosis mediante la introducción de una retroalimentación positiva en el sistema. En la RNasa modelo, la dosis de dependencia es causada por la saturación de la RNasa ARNsi degradantes: un pequeño número de siRNAs son rápidamente degradados por la enzima, mientras que en un número mayor de la enzima se satura, lo que conduce a mayores cantidades de secundaria siRNAs. En la basura y el modelo sigmoide, la cooperación entre la basura y siRNAs, entre basura y piezas propias, respectivamente, a la dosis de dependencia.

El comportamiento de la ampliación de los modelos es más complejo que el modelo básico. Podemos distinguir tres regiones principales de cualitativamente diferente comportamiento. Una forma de cambiar el sistema a otro cualitativamente diferente comportamiento está cambiando el número de copias de genes presentes en la célula. Los diagramas de bifurcación con las tres regiones de los tres modelos se extendió muestra en la Figura 3 A, B, y C. Plotted equilibrio es la cantidad de mRNA contra el número de copias de un gen, un equilibrio estable, se indica con una línea sólida, Inestable con una línea discontinua. En la región I, sólo hay un atractor: después de una perturbación, el sistema siempre regreso a este atractor. En la región II, hay dos atractores, y el sistema puede acabar en uno de ellos. En la III región, es sólo un nuevo atractor. En primer lugar, se discutan cada región por separado, con los correspondientes tipos de dsRNA inducida por silenciar y, a continuación, vamos a seguir debatiendo el diagrama de bifurcación en su conjunto, para entender el proceso de silenciamiento de transgenes inducida.

En la primera región, cuando hay pocos ejemplares presentes, sólo hay un equilibrio estable. En este equilibrio por defecto, hay un escaso número de dsRNA y siRNAs. En esta región, mRNA puede ser silenciada transitoriamente por la introducción de dsRNA homóloga (Figura 4 A, B, y C): cuando se introduce dsRNA, siRNAs derivados de dsRNA causa un fuerte, la rápida disminución de la cantidad de mRNA, después de que la Por defecto es el equilibrio va restableciendo. Transitoria después de silenciar a dsRNA inyección se ha observado en los nematodos, moscas, y el pez cebra [22 - 24]. A diferencia de la vía central, la ampliación de las vías son estables en el rostro de las respuestas en contra de la libre: una dosis baja de dsRNA provocará una menor respuesta a una dosis alta, y un solo capítulo dsRNA tiene un efecto insignificante. Esto se debe al hecho de que la amplificación en todas las vías se extendió flujo dependiente. Esto significa que mientras el número de copias no es demasiado elevado, una dosis baja de dsRNA siempre lugar a sólo una pequeña respuesta, y sostenido no se puede silenciar desencadenado.

La segunda región, con un número de copias intermedias, es bistable, es decir, hay dos atractores: el estado predeterminado y el estado silenciadas. (Hay una tercera equilibrio, que es el tipo de la silla de montar. Estables El colector de la silla separa las cuencas de atracción de los dos equilibrios estables.) Al arrancar en el estado por defecto (dsRNA y siRNAs están casi completamente ausentes), la introducción De una pequeña dosis de dsRNA, causan una respuesta transitoria de silenciamiento, después de lo cual el valor por defecto es el equilibrio establecido una vez más (véase la figura 4 D, E, yF, líneas de puntos). Una alta dosis de dsRNA, sin embargo, puede aportar el sistema de equilibrio de la omisión en la cuenca de atracción de los silenciados de equilibrio, lo que significa que se activa el silenciamiento sostenido (Figura 4 D, E, yF, sólidas líneas). Silenciamiento sostenido se ha demostrado en C. Elegans, donde puede silenciar persisten e incluso se transmitirán a la siguiente generación [18]. También en las plantas infectadas con un virus con un gen homólogo a un gen vegetal, el silenciamiento de genes endógenos persiste incluso después de la eliminación del virus [16]. El silenciamiento de respuesta en las plantas también pueden ser transmitidas a través de injertos de muy alta eficiencia de las existencias silenciado a los no silenciada existencias [17].

La existencia de dos atractores impide indeseable sostenido respuestas: sólo cuando el importe de dsRNA supera un valor umbral es la respuesta sostenida montado. Lamentablemente, hasta ahora pocos experimentos se han centrado en la correlación entre el dsRNA dosis y la duración de la respuesta de silenciamiento. Lipardi et al. [12] mostró que en el embrión de Drosophila extracto, dosis por debajo de un umbral de concentración no inducir el silenciamiento de ARN, mientras que diez veces mayores dosis fueron capaces de activar el silenciamiento. Este estudio indica la existencia de un umbral, la duración de la respuesta, sin embargo, no se ha investigado. Los resultados de Li et al. [24] indican también la existencia de un umbral: se demostró que en pez cebra (Danio rerio) embriones de pequeñas dosis de dsRNA dar lugar a cambios fenotípicos sólo parcial, mientras que altas dosis de dsRNA conducir a más del 50% parcial y 35% completo los cambios fenotípicos . El parcial fenotípica efectos podría indicar que era sólo una respuesta transitoria de los embriones, mientras que la plena fenotípica cambios provocados por una alta dosis de dsRNA podría indicar una respuesta sostenida.

En el modelo de basura, la cantidad de mRNA, dsRNA, y siRNAs son estables en ambos atractores, pero en la RNasa y el modelo sigmoide, oscilaciones pueden ocurrir en esta región. Las oscilaciones en torno a la omisión de equilibrio son siempre de pequeña amplitud, sino en todo el silenciado de equilibrio que pueden convertirse en grandes. Con oscilaciones de la región es mucho menor en el modelo sigmoide que en el modelo de RNasa. Por lo tanto, muestran la dinámica con oscilaciones de la RNasa modelo y sin oscilaciones para el modelo sigmoide (Figura 4 D y F, respectivamente).

Por último, en la tercera región, con un alto número de copia, sólo el estado silenciada, con bajos niveles de mRNA y de los altos niveles de siRNAs, es estable. La introducción de nuevos dsRNA sólo tendrá un pequeño efecto en el ya reducido en gran cantidad de mRNA. Cuando un gen está presente en muy alto número de copias, su ARNm se silencia continuamente.

Técnicamente, las transiciones entre las regiones puede ser caracterizada por diferentes bifurcaciones. En el modelo de basura, el estado por defecto y el estado silenciada desaparecer debido a veces bifurcaciones (Figura 3, círculos cerrados) cuando el número de transgenes es aumentado o disminuido, respectivamente. En los otros dos modelos, poco antes de las bifurcaciones veces el equilibrio se vuelva inestable debido a Hopf bifurcaciones (Figura 3, círculos abiertos), lo que lleva a un comportamiento oscilatorio en torno a los equilibrios. Estas oscilaciones luego desaparecer debido a la conexión homoclinic bifurcaciones. Cuando, al cambiar el número de los transgenes, un pliegue o homoclinic conexión bifurcación es pasado, la dinámica de inmediato salto a la otra de equilibrio (o en su entorno, en el caso de que hay oscilaciones).

La bifurcación diagrama describe el proceso de silenciamiento de transgenes inducida. En la figura 4 G, H, I, parcela y gráficos de barras, donde cada barra indica la cantidad de mRNA de equilibrio para un determinado número de copias de genes, comparar nuestros resultados con los gráficos obtenidos experimentalmente en Drosophila por Pal-Bhadra et al. [5]. Ellos insertar de una a diez copias de un Adh plena inserción de transgenes utilizando diferentes sitios. Las poblaciones con el mismo número de copias similar a los niveles de mRNA, independiente de dónde se insertaron los genes en el genoma. Un ejemplar dado lugar a una cantidad normal de ARNm, mientras que hasta cinco copias, una copia adicional dado lugar a un aumento proporcional de los niveles de mRNA. Sin embargo, cuando una sexta copia se insertó, el silenciamiento de ARN se inició, indicada por la presencia de siRNAs, y disminuyó drásticamente los niveles de mRNA. Incluso en mayor número de copias, la cantidad de mRNA se encuentra alrededor de la cantidad esperada para uno o dos ejemplares. Los gráficos de barras que obtuvimos con nuestros modelos están en estrecha correspondencia: la cantidad de mRNA en la célula inicialmente aumenta con un número cada vez mayor de los transgenes, sin embargo, cuando el número se incrementa de los transgenes más allá de un nivel de umbral, el silenciamiento de ARN se activa.

Parámetros de la dependencia y las predicciones

Sólo hay una cantidad limitada de parámetros medidos experimentalmente disponible, que generalmente se obtienen de diferentes organismos modelo. Además, la gama de valores medidos a menudo pueden ser muy grandes. Nosotros, por lo tanto, no se centran en los valores de los parámetros específicos, y usar en su lugar los valores medios para mostrar la dinámica cualitativa. Luego variar los valores de los parámetros y deducir qué tipo de cambios cualitativos y cuantitativos se espera que acompañar esos cambios de parámetros. Cuando se dispone de datos, comparamos estas predicciones del modelo en el que los experimentos con parámetros específicos han sido variadas.

Los parámetros por defecto se presentan en la Tabla 1. Hemos asumido ARNm estable (vida media de 5 h), un 20 × más rápida descomposición de la basura piezas (vida media de 15 min), y un poco más estable siRNAs (vida media de 21 min, medidos en células humanas [25]]. Los demás parámetros son elegidos para representar como la plena capacidad de los modelos.

Se distinguen cinco tipos de efectos cualitativamente diferentes que pueden ser causadas por cambios en los valores de los parámetros (Figura 5]. Los cambios en el comportamiento puede ser descrito en términos del umbral, que es el número de los transgenes necesarios con miras a activar el silenciamiento, y en términos de la bistable punto, que es el límite inferior de la bistable región. Tenga en cuenta que en el modelo sigmoide, la cantidad de mRNA en la célula vuelve a crecer siempre a un alto número de copias.

Comportamiento de tipo I se produce en el modelo de basura al cambiar los parámetros n, b, yg, y en los tres modelos al cambiar p. El cambio de estos parámetros, no influye en la bistable punto (es decir, el valor por encima del cual sostenido silenciamiento puede ser activado), pero se mueve el umbral de número de copias y los diferentes niveles de mRNA. Esto significa que el tamaño de la región bistable cambios: cuando el umbral es más bajo que el bistable punto, no hay bistable región, y el silenciamiento de transgenes se dispara a bajo número de copias. Cuando se convierte en el umbral muy alto, bistable la región es muy grande: sólo un alto número de copia desencadena silenciar, al mismo tiempo sostenido silenciamiento provocado por la introducción de dsRNA se hace posible en una gran región.

Tipo II es el comportamiento típico de la RNasa y modelo sigmoide. En ambos modelos, los cambios en los parámetros n, b, g 1,2, y k resultado en el comportamiento del tipo II, así como d r en el modelo de RNasa, y d g en el modelo sigmoide. Parámetro cambios bistable mover el punto y el umbral de la siguiente manera: un bajo umbral coincide con un punto aún más baja bistable; un alto umbral con un mayor bistable punto. Esto significa que, en contraste con el comportamiento del tipo I, la región bistable desaparece cuando el umbral es alto, sostenido y silenciamiento se convierte en imposible. En el modelo sigmoide, también la posibilidad de silenciar transgén inducida desaparece, ya que no hay una notable disminución de los niveles de ARNm más allá del umbral. En la RNasa modelo, este no es el caso: los niveles de mRNA siempre con disminución suficientemente alto número de copias, aunque el umbral de número de los transgenes a veces pueden quedar fuera de los gráficos en la Figura 5.

Tipo III comportamiento se produce por cambios en d m en los tres modelos. En este caso, el umbral se desplaza a diferentes números de copia, pero la cantidad de mRNA en el umbral sigue siendo el mismo. En lugar de ello, la pendiente inicial de los cambios en el nivel del ARNm. El bistable punto no se ve afectada, y desde el umbral se mueve, la bistable región puede aumentar o disminuir de tamaño (e incluso desaparecer).

Tipo IV es el comportamiento típico de los cambios en d y s d g en el modelo de basura. Estos parámetros de la escala completa diagrama de bifurcación.

Tipo V se produce en el comportamiento de la RNasa y el sigmoide modelo de los cambios en d s. En este caso, lo único que cambia es la cantidad de mRNA justo después de silenciar transgén se dispara.

Cambios en el umbral de copias de genes han sido observados experimentalmente. Varios estudios sugieren que la cantidad de mRNA transcrito desempeña un papel importante en la capacidad de las transcripciones para activar el silenciamiento de transgenes inducida. Cuando un transgén está bajo control de un promotor 35S con un doble potenciador, el gen se transcribe a tan alto que la tasa de un solo transgén puede ser suficiente para activar el silenciamiento [26]. Asimismo, en la fuerza de petunia el promotor se correlaciona con la frecuencia y grado de silenciamiento [27], y plantas homocigotos para un transgén son mucho más a menudo silenciada que hemicigotos plantas [27 - 32].

Estas observaciones son consistentes con nuestros modelos: cuando un gen es más altamente expresado (en nuestros modelos descritos por un mayor valor de i, la tasa de transcripción), un menor número de copias se necesitan para activar el silenciamiento. Esto se debe a que el cambio de manera efectiva i rescales el eje "x" de los diagramas de bifurcación.

Nuestros modelos indican que la cantidad de mRNA por dsRNA es un factor importante que determina el umbral. Cuando más dsRNA por ARNm se produce, el umbral para activar el silenciamiento de transgenes será inferior. Por ejemplo, un aumento en el parámetro p, la tasa de síntesis de dsRNA RDR, los resultados en todos los modelos en una disminución de los umbrales. El aumento de la amplificación (g) tendrá un efecto similar. Nuestros resultados están en línea con las observaciones experimentales: Forrest et al. [7] mostró que en las cepas que sobreexpresa RDR, el número de los transgenes necesarios para inducir el silenciamiento está disminuido. Asimismo, junto con transcripciones impulsiva, que producen mucho más por dsRNA ARNm, han demostrado ser muy eficaces inductores de silenciamiento de ARN [10, 33]. Por último, a menudo contienen transposones largo impulsiva y están presentes en alto número de copias, tanto de las que hemos mostrado para inducir el silenciamiento.

Estos resultados experimentales son consistentes con nuestros modelos, pero no permiten distinguir entre ellas. En lugar de ello, necesitamos experimentos en los que determinados parámetros específicos son variados. Por ejemplo, los modelos predicen un efecto completamente diferente de la sobreexpresión de RISC (todos sus componentes tienen que sobreexpresa). En la basura y el modelo de RNasa, RISC sobreexpresión conduce a un aumento y, en definitiva, el umbral de la desaparición. En el modelo sigmoide, encontramos el contrario: la desaparición del umbral no es causado por la sobreexpresión RISC, pero por underexpression RISC (Figura 5].

Discusión

La ampliación de los modelos de cada proporcionar un marco unificado para los diferentes fenómenos de silenciamiento de ARN. Ofrecen explicaciones coherentes para (i) dependientes de la dosis dsRNA inducida silenciar, (ii) la estabilidad en contra de la libre dirigidas las respuestas, (iii) la dependencia inducida por silenciamiento de transgenes en RDR, (iv) el efecto de la respuesta impulsiva, (v) múltiples copias; (Vi) la eficiente promotores, y (vii) la capacidad de transposones para activar el silenciamiento.

Anteriormente se ha propuesto que transgén inducida silenciamiento se activa sólo si el número de los transgenes supere cierto nivel, [5, 6, 29 - 31]. También se ha observado que la sobreexpresión de RDR reduce el umbral [7]. Nuestros modelos de apoyo a la hipótesis de umbral y dar una explicación mecanicista de que: se propone que el importe de dsRNA por cuestiones de transcripción.

Las extensiones también explicar las diferencias en los fenómenos silenciamiento de ARN en diferentes grupos de especies. Según nuestros modelos extendido, en los organismos que han RDR homólogo (s), tales como plantas, hongos, nematodos, y celulares limo moldes, silenciamiento puede ser inducido por transgenes, impulsiva, transposones, y dsRNA. En contraste, se ha demostrado aquí que los organismos sin RDR no están en condiciones de activar el silenciamiento de transgenes inducida. En consecuencia, los experimentos han demostrado que las plantas con una mutación en RDR ya no son capaces de lograr silenciar transgén inducida, mientras que el virus (dsRNA) inducida por silenciar aún es posible en estas cepas [34]. La presencia de un RDR en Drosophila está actualmente en disputa. Algunos experimentos sugieren fuertemente la presencia en Drosophila de un RDR o una proteína que funciona como un RDR [5, 12, 35]. Otros experimentos, sin embargo, argumentan en contra de la presencia de dicha enzima (una búsqueda BLAST, por ejemplo, no arrojaría un homólogo RDR) [36 - 38]. Dado de alta transgén números (sin IR) son capaces de inducir el silenciamiento del ARN en Drosophila, nuestro modelo indica que una proteína con la misma función que debe estar presente RDR. Mamíferos falta RDR, y de acuerdo con nuestros modelos, que son capaces de silenciar sólo transitoria inducida por siRNAs [39] (en los mamíferos, dsRNA no desencadena varias respuestas concretas [40, 41]; silenciamiento sostenido en los mamíferos sólo se puede lograr por Continua expresión de siRNAs).

Nosotros no incluyen el efecto de ADN en la cromatina siRNAs, que se denomina silenciación o transcripcional heterochromatinization. Silenciamiento transcripcional desempeña un papel en el transposón silenciar [42 - 45]. Nolan et al. [46] Sin embargo, recientemente mostró que en el hongo Neurospora crassa la LINE1-como transposón, Tad, es posterior a la transcriptionally silenciada y no significativamente metiladas, lo que indica que en el transposón induce silenciamiento N. Crassa puede ser independiente de la metilación del ADN. Por otra parte, también en Drosophila transgén inducida silenciamiento ha demostrado ser el único post-transcripcional [5]. Aunque heterochromatinization puede desempeñar un papel importante en el transposón silenciar, nuestro modelo de estudio indica que la adición de heterochromatinization sola-es decir, la parada en la transcripción-a la vía central no hará posible silenciar transgén. Heterochromatinization sólo disminución del mRNA de transcripción, y no ofrece la necesaria retroalimentación positiva.

Aunque se ha demostrado recientemente que RISC pueden realizar varias rondas de división [47], suponemos sólo una división por complejo RISC. Añadiendo múltiples volumen de negocios de RISC, sin embargo, no afecta el comportamiento cualitativo del modelo (datos no publicados).

Hemos propuesto tres diferentes adiciones a la vía. Nosotros sugerimos aquí algunas maneras de probar o rechazar experimentalmente las predicciones realizadas por las diferentes extensiones. En el parámetro de la sección, que ya hemos discutido los diferentes comportamiento de la modelo sigmoide cuando se sobreexpresa RISC. Otra diferencia es que sólo en el modelo sigmoide, después de silenciamiento se activa, aún mayor número de copias provocará un aumento en los niveles de mRNA de nuevo. Ese aumento, sin embargo, también pueden indicar otros sigmoide respuestas en la vía, por ejemplo, en Dicer o RISC. Cinética sigmoide por sí solas no son capaces de permitir que los niveles de ARNm de bajo número de copias cuando se vuelven muy grandes. Se puede argumentar, sin embargo, que una combinación de heterochromatinization con una sigmoide respuesta será capaz de mantener los niveles de mRNA silenciada.

Recientemente, un ARNsi degradantes RNasa se ha encontrado en C. Elegans [21]. El itinerario con el ARNsi degradantes RNasa, sin embargo, es capaz de causar transgén silenciar sólo cuando siRNAs degrada muy rápidamente y cuando se satura rápidamente. De hecho, aún cuando este es el caso, esta vía sólo permite limitedly sostenido silenciamiento de ARN, ya que el rango de parámetros para silenciar sostenida es muy pequeña. Nos gustaría que los experimentos que se centran en la correlación entre la dosis de dsRNA y la duración de la respuesta de silenciamiento. Esos experimentos dará a conocer la existencia de una respuesta positiva y se mostrará si hay una bistable región. El siguiente paso sería la de investigar la dependencia de ambos el umbral y el tamaño de la región bistable el número de copias de genes, y cómo esto depende de los cambios en los parámetros. Estas observaciones pueden ser comparados con las dependencias previsto en el parámetro de la sección.

El modelo de la basura podría ser probado mediante la investigación de la posibilidad de siRNAs para servir como iniciadores para RDR aberrante basura en pedazos. Cuando es posible, esperamos que este cebados amplificación de la basura es que le falta un paso en la vía de silenciamiento de ARN. Esto representa sólo una pequeña además de la actualmente conocida vía, pero tiene un gran impacto en la dinámica, haciendo transgén transposón y silenciamiento, así como los dependientes de la dosis sostenida silenciamiento, la posibilidad de una amplia gama de parámetros. Por lo tanto, se concluye que en el ARN es silenciar "los bits y piezas" ese asunto.

Materiales y Métodos
Prueba matemática de las limitaciones de la vía central.

En esta sección, demostrar que la vía central, con o sin amplificación, es incapaz de silenciar transgén inducida y sostenida silenciar.

En transgén inducida silenciamiento, la cantidad de mRNA en la célula inicialmente aumenta cuando el número de los transgenes aumente, pero un nuevo aumento en el número de transgenes lleva a un repentino descenso de la cantidad de mRNA de equilibrio, debido a silenciamiento de ARN [5] . Esto implica que dos diferentes números de copia puede llevar a exactamente la misma cantidad de mRNA de equilibrio (véase la figura 1 o la figura 3 en [5]]. Nos referimos a la de equilibrio para un bajo número de copias por omisión el estado, y para el equilibrio de un alto número de copias como el estado silenciadas. A pesar de la alta transcripción de ARNm, en el estado silenciado la cantidad de mRNA sigue siendo baja, debido a los altos niveles de dsRNA y siRNAs que están presentes. Por consiguiente, cuando sería posible mantener la cantidad de mRNA en la célula constante (cf, técnicas de patch clamp en la neurociencia), no debería existir para los niveles de mRNA que hay al menos dos equilibrios estables en el sistema, cada uno con una cantidad diferente De dsRNA. Matemáticamente, este requisito puede ser estudiado por considerar la variable M como un parámetro fijo m. Luego de un cierto intervalo de valores de m, no debería existir, al menos, dos equilibrios estables, lo que implica la existencia de al menos tres equilibrios, ya que uno de equilibrio será inestable. Vamos a demostrar aquí que el propuesto anteriormente itinerario no puede cumplir con este requisito y, en consecuencia, no es capaz de describir y explicar transgén inducida silenciar.

El requisito es analizada por el estudio de equilibrio dsRNA (D). Sin amplificación, la dinámica de dsRNA constará de dos partes solamente: una corriente positiva (por la tarde) y un decaimiento por Dicer (dC). En la Figura 6, que representan la llegada y distribución de D en función de D. Para conseguir un equilibrio, la afluencia debe equilibrar la ruptura-es decir, la descrita líneas deben cruzar. Por lo tanto, sin amplificación habrá un equilibrio único (Figura 6 A). Así, el número de copias de cada gen conduce a un único nivel de ARNm, de modo que, por lo tanto, sólo puede ser el caso de que el nivel de equilibrio del mRNA monotonically transgén se eleva con el aumento de número de copia (véase la figura 2 D). La adición de una de las cebadas o unprimed amplificación no permite un aumento en el número de equilibrios estables. Esto puede deducirse por la solución de los equilibrios a través de la puesta tanto dS / dt y de / dt a cero:

Esto significa que los términos de amplificación puede escribirse como una función lineal de la D, que nunca puede dar lugar a más de un equilibrio estable (Figura 6 B):

Cuando la acción de masas-lo que se sustituirán por la cinética de Michaelis-Menten, la amplificación puede ser reescrito como la suma de las respuestas y saturados: . Cuando el desglose no es saturada, esto todavía trivially lleva a un equilibrio único. Sin embargo, cuando se desglose por Dicer muestra una saturación de la respuesta, más de un equilibrio se puede encontrar (pero también sin equilibrios, en el caso de que la saturación es muy rápido). Para permitir por lo menos dos equilibrios estables, la línea Debe cruzar la línea Por lo menos tres veces, debido a un segundo equilibrio será siempre inestable. (Tenga en cuenta que, dado que en este análisis m puede ser tratada como una constante, la expresión horas podría también tener un más complicado-por ejemplo, la dependencia de la saturada-m.) Esto, sin embargo, nunca es posible. El modelo puede reajustarán a . Considerar la relación de ambas funciones:

Equilibrios se encuentran al R (D) = 1; a obtener tres equilibrios, la derivada de R (D) debe tener por lo menos dos raíces:

Sin embargo, por la multiplicación de las dos partes con la función de aumentar monotonically (1 + D) 2, se puede demostrar que existe una raíz en la mayoría, ya que el lado izquierdo es una función creciente de monotonically D:

En consecuencia, dR / dD tiene sólo una raíz, y no habrá, como máximo, dos equilibrios, de los cuales a lo sumo, uno es estable (Figura 6 C). Así, en el itinerario propuesto anteriormente transgén inducida silenciamiento es imposible.

Del mismo modo, el modelo que describe la dinámica de sostenida requieren respuestas múltiples estados constante para un conjunto único de parámetros. Este requisito está implícitamente equivalente a la anterior, ya que la existencia de un segundo de equilibrio estable (con un menor nivel de mRNA) automáticamente implica que el mismo nivel de equilibrio ARNm se puede encontrar para un menor número de copias del transgén. Es decir, el itinerario propuesto anteriormente no puede ni describir ni explicar transgén inducida silenciar, ni sostenido silenciamiento provocado por la inyección de dsRNA.

Programas usados.

El timeplots en las figuras 2 y 3 se producen con Triture, un programa de ordenador para el estudio de la ecuación diferencial por medio de modelos numéricos de integración, el estado de equilibrio de análisis, y la fase de análisis espacial ( Http://theory.bio.uu.nl/rdb/software.html ). Los diagramas de bifurcación son producidos con CONTENIDO, un entorno integrado para el análisis de bifurcación de los sistemas dinámicos ( Http://www.math.uu.nl/people/kuznet/CONTENT/ ).

Damos las gracias a M. van Hoek y T. Sijen útil para los comentarios sobre el manuscrito. Esta investigación fue financiada por la Organización de los Países Bajos para la Investigación Científica (NWO) a través de la subvención 050.50.202 de la BioMolecular Informática programa.