Estren promueve andrógenos fenotipos primaria en los órganos linfoides y glándulas submandibulares
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.
Los estrógenos y andrógenos tienen importantes efectos sobre el sistema inmunitario, por ejemplo, se suprimen las dos y B lymphopoiesis T en el timo y la médula ósea. Glándulas submandibulares son sexualmente dimorfo en roedores, que redunda en mayor granular células de los túbulos en los hombres en comparación con las mujeres. El objetivo del presente experimentos fue investigar los efectos estrogénicos y androgénicos, de 4-estren-3 α, 17β-diol (estren), el timo, la médula ósea y las glándulas submandibulares, y comparar los efectos a los de 17 β-estradiol (E2) y 5α-dihidrotestosterona (DHT), respectivamente. Receptores de estrógenos (RE) fueron bloqueados por el tratamiento de ratones con la ER-antagonista ICI 182780; también, los ratones knock-out que carecen de uno o ambos de Emergencia se utilizaron.
Como era de esperar, la presencia de RE funcional es obligatoria para todos los efectos de E2. Similar a la DHT-tratamiento, tratamiento estren-timo generado una disminución en el peso, así como la disminución de la frecuencia de células B de la médula ósea. El tratamiento con estren o DHT también dio lugar a un cambio en las glándulas submandibulares hacia un fenotipo de andrógenos. Todos los efectos de la DHT estren y son independientes de las exigencias ambientales.
Nuestro estudio es el primero en mostrar que estren tiene efectos similares como el andrógeno DHT sobre lymphopoiesis en el timo y la médula ósea, y en las glándulas submandibulares, y que dichos efectos son independientes de los receptores de estrógeno. Esto apoya la hipótesis de que se estren en condiciones de la señal a través del receptor de andrógenos.
Los efectos de los estrógenos y andrógenos en el sistema inmunológico en ratones han sido ampliamente estudiados. Por ejemplo, y T lymphopoiesis B en la médula ósea y el timo se suprime por tanto el tratamiento con estrógenos [1 - 6] y andrógenos [7 - 9].
Glándulas submandibulares (SMG) son sexualmente dimorfo en roedores. La actividad secretora de las glándulas localizadas principalmente a las células acinares y el tortuoso granulares (TCG) juvenil tubular de las células. El GCT células se encuentran bajo control hormonal de andrógenos, que redunda en mayor GCT en los hombres en comparación con las mujeres [10 - 12].
Las señales de los estrógenos y andrógenos se transmiten en las células objetivo conocido por los dos receptores de estrógenos (RE), ER ER α y β [13, 14], o por el receptor de andrógenos (AR), respectivamente.
Posmenopáusicas con terapia de reemplazo hormonal (TRH) tiene efectos beneficiosos sobre el esqueleto, pero también se asocia con efectos secundarios conocidos. Esto ha conducido a una mayor concentración en la búsqueda de estrógeno sintético similar a las sustancias que sólo se reproducen los efectos beneficiosos de los estrógenos. 4-estren-3 α, 17β-diol (estren) es un compuesto sintético con similitudes estructurales a E2 que ha sugerido a la señal a través de la RE y RA [15 - 17].
El objetivo del presente experimentos fue investigar los efectos estrogénicos y androgénicos de estren en lymphopoiesis en el timo y la médula ósea, y sobre SMG. Mostramos aquí que estren tiene efectos similares en estos órganos como el andrógeno DHT, y que los efectos son independientes de las exigencias ambientales, el apoyo a los estudios previos que muestran que estren es capaz de señal a través de la AR [15, 16].
Queríamos investigar los efectos estrogénicos de estren en lymphopoiesis y glándulas submandibulares (SMG), en ratones hembra. Con el fin de hacer esto, de 3 meses de edad C57/B16 ratones fueron ovariectomizadas y tratadas durante 18-21 días con diaria subcutánea (sc), inyecciones de la antagonista de los receptores de estrógenos ICI 182780 (200 μ g / día) o vehículo Miglyol 812. Al mismo tiempo, tanto el vehículo y la ICI grupos recibieron inyecciones diarias sc de E2 (0,7 μ g / día), estren (75 μ g / día) o el control del petróleo Miglyol 812.
Los efectos inhibitorios de E2 el timo de peso (fig. 1] y la frecuencia de células CD19 + en la médula ósea (fig. 2] en el vehículo de ratones expuestos fueron bloqueados por los antagonistas de ER-ICI 182780. En contraste, el tratamiento con estren resultado en la parte baja del timo de peso (fig. 1], y menor frecuencia de las células CD19 + en la médula ósea (fig. 2], en tanto vehículo de ICI y ratones expuestos.
El granular en células de los túbulos SMG son sexualmente dimorfo en roedores, siendo mayor en hombres que en mujeres. En hematoxilina-eosina secciones de tejido teñido de SMG, el grado de los andrógenos fenotipo se puntuó de 0 a 3. 0 no representa andrógenos fenotipo y 3 es el valor más alto de andrógenos fenotipo. Representante imágenes de los diferentes puntos de puntaje se presentan en la fig. 3. El tratamiento con E2 no afecta a la SMG de peso (fig. 4 bis] Resultado de andrógenos o fenotipo (fig. 4b], ya sea en vehículo o ICI ratones. Por otra parte, tanto el peso de SMG (fig. 4 bis] y la SMG Resultado de andrógenos fenotipo (fig. 4b] se incrementó en estren en tanto vehículo de ICI y ratones.
En conjunto, los resultados de este experimento indican que estren afecta lymphopoiesis y ER-SMG a través de vías independientes.
Dado que estudios previos han demostrado que estren tiene la capacidad de la señal a través de RE y RA [15, 16], queríamos investigar el estrógeno-, y los andrógenos, como efectos de la estren en femenino ER ratones knock-out. Para ello, de 11 meses de edad y mujeres WT DERKO (ER α - / -, ER β - / -) ratones fueron ovariectomizadas y dado de inyecciones diarias sc E2 (0,7 μ g / día), DHT (120 μ g / día) O estren (75 μ g / día) durante cuatro semanas. Control de ratones recibió aceite de oliva.
Como era de esperar, la E2 mediada por la reducción de la frecuencia de células B220 + en la médula ósea de ratones WT faltaba en ratones DERKO (fig. 5]. E2 tratos no afectar dramáticamente el peso (datos no presentados) o fenotipo de los andrógenos, ya sea en SMG WT o DERKO ratones (fig. 6].
Anteriormente hemos demostrado que estren-en la disminución de los resultados del tratamiento en ambos timo celularidad WT DERKO y ratones que indican un efecto a través de las vías ER independiente [17]. Ahora también muestran que el tratamiento con DHT o estren traducido en menor frecuencia de las células B220 + en la médula ósea de los ratones WT y DERKO (fig. 5]. Además, fig. 6 muestra que la SMG Resultado de andrógenos fenotipo fue alto para ambos DHT-estren-y los animales tratados, de ambos WT y DERKO genotipo, en comparación con ratones control. Curiosamente, la SMG de peso fue significativamente mayor en los animales tratados DHT-en comparación con los controles, pero no en estren-E2-o los animales tratados (datos no presentados).
En conjunto, los resultados de este experimento muestran una vez más que estren afecta a las células B en la médula ósea, y el fenotipo de SMG, a través de ER-independiente de las vías de manera similar a la DHT tratos. Esto indica estren de señalización a través de la AR.
Con el fin de estudiar cómo E2-y DHT tratos afectados masculino ER ratones knock-out, 9 meses de edad de sexo masculino y DERKO WT orchidectomized y ratones fueron tratados durante 4 semanas con E2 (0,05 μ g / día) o DHT (45 μ g / Día), administradas por sc implantes de silastic en la región cervical [18]. Vehículo vacío animales recibieron implantes.
El E2 mediada por la reducción de la celularidad timo WT visto en ratones podría no ser detectado en ratones DERKO (fig. 7]. Sin embargo, E2-tratamiento no afectó el peso (datos no presentados) o andrógenos fenotipo de SMG en ninguno de los dos ratones WT o DERKO (fig. 8].
El tratamiento con DHT reducido drásticamente como resultado timo celularidad independiente de ER genotipo (fig. 7]. Además, fig. 8 muestra que la SMG Resultado de andrógenos fenotipo DHT se aumentó en los ratones tratados de ambos WT DERKO y genotipo. El peso de SMG también fue significativamente mayor en los animales tratados DHT-ER de ambos genotipos en comparación con el control, y los ratones tratados con E2 (datos no presentados).
En conclusión, estos datos ponen de manifiesto que también en ratones machos DHT afecta tanto timo celularidad, y SMG peso y fenotipo, independientemente de las exigencias ambientales.
Por último, la falta de tratamiento de 18 meses de edad, WT, ERKO, BERKO, y DERKO ratones fueron investigados. Se encontró que en edad no ovariectomizadas ratones hembra que carecen de ER α (ERKO) muestran un aumento del peso de SMG, el tamaño histológico de andrógenos y un fenotipo (9a-c). Hemos demostrado previamente que los ratones hembras ERKO tienen mayores niveles séricos de testosterona en comparación con los ratones WT [19]. Por lo tanto, estos resultados indican que los altos niveles de testosterona en ERKO ratones son responsables de la SMG el aumento de peso, el tamaño y fenotipo de andrógenos en las mujeres en edad ERKO ratones.
Posmenopáusicas con terapia de reemplazo hormonal (TRH) tiene efectos beneficiosos sobre el esqueleto, pero se asocia con conocidas efectos secundarios. Esto ha conducido a una mayor concentración en la búsqueda de estrógeno sintético similar a las sustancias que sólo se reproducen los efectos beneficiosos de los estrógenos. Estren es un compuesto sintético que recientemente hemos demostrado tener ER-dependiente represivas efectos sobre la inflamación, pero ER-independiente efectos inhibidores sobre T lymphopoiesis [17]. El objetivo del presente experimentos fue investigar los efectos estrogénicos y androgénicos de estren en lymphopoiesis en el timo y la médula ósea, y sobre SMG. Nuestro estudio es el primero en mostrar que estren tiene efectos similares en estos órganos como el andrógeno DHT, lo que apoya la hipótesis de que estren es capaz de señal a través de la AR.
En genómica vías de señalización, se une a los estrógenos o intracelular - posiblemente - membrana RE obligado, en última instancia, la activación de la actividad transcripcional en el objetivo de células. Sin embargo, los informes han demostrado que una gran variedad de tipos de células responder rápidamente, en cuestión de segundos o minutos, con lo que la vía de señalización improbable genómica y sugerir en lugar no genómica vías de señalización. En trabajos publicados previamente, Kousteni et al [20 - 22] propone que los esteroides sexuales afectan a los tejidos reproductivos por genómica clásica de señalización, mientras que el hueso escatima efecto de esteroides sexuales es mediado a través de una vía no-genómica. Se sugirió que la ER α, β ER AR puede activar o no la genómica vía de señalización, independientemente de que el ligando es un estrógeno o una andrógenos. También mostró que el tratamiento con estren aumenta la masa ósea en ratones ovariectomizadas sin afectar a los órganos reproductivos, lo que sugiere que estren es un "mecanismo específico" compuestos que sólo reproduce la falta de señalización de estrógenos genómica, y, por tanto, puede también afectar a las células diana a través de la AR .
En contraste con los resultados por Kousteni et al, hemos demostrado anteriormente que estren tiene la capacidad de afectar a los huesos y los órganos reproductivos a través de la señalización a través de genómica clásica RE [23].
Además, Centrella et al [15] encontró que estren activa osteoblastos en un genómica y AR-dependientes. Curiosamente, también pusieron de manifiesto que estren puede ser metabolizada en 19-nortestosterone por acción, de 3 de α-hidroxiesteroide deshidrogenasa, y que el 19-nortestosterone une a la AR con una afinidad que fue de aproximadamente el 40% de la de DHT.
En un documento publicado recientemente, Krishnan et al [16] encontró que se estren un potente AR ligando con la capacidad de trasladar AR en el núcleo, y poseer plena AR actividad agonista. En conclusión, los resultados de estos estudios muestran que la ER-independiente de los efectos estren puede ser mediada a través de la AR.
Recientemente hemos demostrado que estren periférica afecta a funciones inmunitarias a través de RE, mientras que los efectos inhibitorios sobre T lymphopoiesis ER-es independiente [17]. Desde AR también se sabe que la estimulación por tanto T-regular y el desarrollo de las células B [7 - 9], el ER-no mediada efectos de Mayo timo estren en el resultado de la activación de la AR.
En el presente informe se han estudiado los efectos estrogénicos y androgénicos de estren el timo, las células B en la médula ósea y el SMG. Mostramos aquí que el bloqueo de las exigencias ambientales con ICI 182780 bot no afectará a la estren inducida por la inhibición de la timo de peso (fig. 1]. Anteriormente hemos demostrado que la exposición a estren resultados en la disminución de celularidad timo independientemente de las exigencias ambientales [17]. En este estudio también muestran que el tratamiento con resultados en la disminución de DHT timo celularidad en ambos ratones WT y DERKO (fig. 7].
Del mismo modo, mostramos aquí que el bloqueo de las exigencias ambientales con ICI 182780 no afecta a la frecuencia de células B CD19 + en la médula ósea (fig. 2], y con independencia de las exigencias ambientales, tanto DHT-estren-y los resultados del tratamiento en el menor frecuencia de B220 + Células B en la médula ósea (fig. 5].
SMG son sexualmente dimorfo en roedores, que redunda en mayor granular células de los túbulos en los hombres en comparación con las mujeres [10 - 12]. En este estudio, la SMG se anotó secciones de acuerdo a su fenotipo de andrógenos (fig. 3], y los resultados muestran que el bloqueo del RE con ICI 182780, no afecta a la mayor puntuación de andrógenos fenotipo (fig. 4b] o el aumento de peso SMG ( Fig. 4 bis] visto después de la exposición a estren. También muestran que el tratamiento con estren o DHT de ambos ovariectomizadas femenino y masculino orchidectomized ratones, a un fenotipo de andrógenos (fig. 6 y 8] y en ambos WT DERKO ratones. Es interesante que en el experimento 2, estren-WT tratados y DERKO ratones no se ha mostrado el aumento de peso de SMG en correlación con el aumento de andrógenos su fenotipo. La razón de ello no está claro, pero una posible explicación podría ser que un largo periodo de tratamiento es necesario para inducir el aumento de peso de SMG ratones hembra de edad.
En el experimento 4, que demuestran que las mujeres de edad sin tratar ratones que carecen de ER α SMG andrógenos tienen un fenotipo (fig. 9a-c]. Esto es muy probablemente debido al aumento de los niveles de testosterona se encuentran en estos ratones [19].
Recientemente hemos demostrado que estren periférica afecta a funciones inmunitarias a través de RE, mientras que los efectos inhibitorios sobre T lymphopoiesis ER-es independiente [17]. AR-Desde que se sabe que la estimulación por tanto T-regular y el desarrollo de las células B [7 - 9], y se ha demostrado que estren tiene la capacidad de la señal también a través de la AR [15, 16], la no-mediada efectos ER De estren puede ser el resultado de la activación de la AR. En este estudio muestran que estren similar no ha mediado ER-lymphopoiesis efectos en el andrógeno DHT como en ambos timo y la médula ósea, y en el fenotipo de SMG. Esto apoya la hipótesis de estren tener la capacidad de la señal a través de la AR.
El comité de ética de la experimentación con animales en la Universidad de Göteborg aprobó este estudio. Los ratones fueron mantenidos en la instalación animal en la Universidad de Göteborg en condiciones estándar de temperatura y luz, y tuvieron libre acceso a agua dulce y el nivel de laboratorio o chow de soja libre de los alimentos pellets R70 (Lactamin AB, de Estocolmo, Suecia).
Los ratones fueron anestesiados por Ketalar ® / Domitor ®, desangrado y muerto por dislocación cervical. SMG fueron disecados, pesadas y fijo en paraformaldehyd. Thymi fueron retirados, pesadas y solo células en suspensión fueron preparados por los órganos a través de la maceración de 70 μ m cellstrainer (BD, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.). Células de la médula ósea fueron cosechadas de fémur y la tibia por el lavado con 2 ml de fosfato Buffered Saline (PBS). Las células se mantuvieron en una mezcla 50/50 de medio completo (Iscoves-medio enriquecido con 50 μ g / ml de gentamicina (Sigma), 4 mM L-glutamina (Sigma), 50 μ M Mercaptoethanol (Sigma) y 10% de suero fetal Becerro (FCS Ind) (biológicas, Beit Haemek, Israel)) y hasta el uso de PBS. Thymus y células de la médula ósea se centifuged a 515 × g durante 5 min. Pildoradas células de la médula ósea se re-suspendió en Tris de búfer 0,83% NH 4 Cl solución (pH 7.29) durante 5 minutos a lyse eritrocitos. Después de lavado en PBS el número total de timo y células de la médula ósea se calculó utilizando un contador automatizado de células (Sysmex, Kobe, Japón). Las células fueron re-suspendido en medio completo antes de su uso.
Células de la médula ósea son objeto de fluorescencia de células activado Clasificador de análisis (FACS). Las células se tiñeron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) para anticuerpos etiquetados CD45R/B220 (clon RA3-6B2, BD PharMingen) y allophycocyanin (APC) conjugado con anticuerpos CD 19 (clon 1D3, BD PharMingen). Línea citometría se realizó en un FACSCalibur y analizados mediante el Paint-A-Puerta de software (BD). La FACS datos se presentan como porcentaje positivamente manchadas células de la médula ósea de todas las células nucleadas.
El examen histológico de SMG se realizó en un microscopio de luz (× 100) después de la rutina del 4% paraformaldehido fijación, deshidratación, la incrustación de parafina y preparación de 4 μ m de espesor secciones de tejidos, seguido de tinción con hematoxilina y eosina [28]. El grado de los andrógenos en el fenotipo SMG secciones puntuaba de 0 a 3, donde 0 representa no andrógenos fenotipo y 3 es el valor más alto de andrógenos fenotipo. Representante imágenes de las diferentes puntuaciones (0-3) se presentan en la fig. 3.
Todos los valores se probaron para la distribución normal utilizando la prueba de Shapiro-Wilk. ANOVA de una vía seguida por el test de Fisher se utilizó para comparar los datos de los ratones en diferentes grupos de tratamiento (experimento 1-3), o de ratones de diferentes genotipos (experimento 4). Los resultados se presentan como media ± desviación estándar. Dos caras testículos se utilizaron y P <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los programas Prisma 4,0 Statview y 5.0.1 se utilizaron para los cálculos estadísticos.
AR: receptor de andrógenos
DERKO: doble receptor estrogénico knock-out
DHT: 5 α-dihidrotestosterona
E2: 17 β-estradiol
ER: receptor estrogénico
ER α: receptor estrogénico α
Β ER: receptor estrogénico β
Estren: 4-estren-3 α, 17β-diol
GCT: granular células de los túbulos
ORX: orchidectomized
OVX: ovariectomizadas
SC: subcutánea
SMG: glándula submandibular
WT: tipo salvaje
IU participó en la planificación, ejecución y terminación de los experimentos, analizado e interpretado los datos, redactó el manuscrito.
BH participó en la terminación de los experimentos, analizados e interpretados de la glándula submandibular secciones, revisado críticamente el manuscrito.
MCE participó en la terminación y ejecución de experimentos y analizaron datos interpretarse, revisado críticamente el manuscrito.
CJ participó en la terminación y ejecución de los experimentos, revisado críticamente el manuscrito.
SMS participó en la planificación, ejecución y terminación de los experimentos, revisado críticamente el manuscrito.
ML participaron en la planificación, ejecución y terminación de los experimentos, revisado críticamente el manuscrito.
JÅG siempre que el receptor estrogénico ratones knock-out y participó en el diseño de los estudios, revisado críticamente el manuscrito.
CO concebida de los estudios, y participaron en su diseño y coordinación, el examen crítico del manuscrito.
HC concebida de los estudios, y participó en su diseño, coordinación y ejecución, ayudó a redactar el manuscrito.
Damos las gracias a Berit Eriksson por su excelente asistencia técnica, y Stefan Nilsson en Karo Bio de proporcionar a estren experimento 2. Este estudio fue apoyado por becas de la Börje Dahlin fundación, la Sociedad Médica de Göteborg, Suecia La asociación contra el Reumatismo, el rey Gustavo V de 80 año de fundación, Reumaforskningsfond Margareta, la Facultad de Medicina de la Universidad de Göteborg (LUA), el Novo Nordiska fundación, el Sueca del Consejo de Investigación Médica, KaroBio AB y el Fondo Sueco de Cáncer.