Environmental Health, 2005; 4: 9-9 (más artículos en esta revista)

Efecto de Cr (V) en la morfología de los órganos reproductivos y los parámetros espermáticos: un estudio experimental en ratones

BioMed Central
Maria de Lourdes Pereira (lpereira@bio.ua.pt) [1], Ricardo Pires das Neves (rdoneves@bio.ua.pt) [1], Elena Oliveira (holiveira@bio.ua.pt) [1], Teresa Margarida Santos (teresa@dq.ua.pt) [2], Júlio Pedrosa de Jesús (jpedrosa@dq.ua.pt) [2]
[1] Departamento de Biología, Universidad de Aveiro, 3810-193, Aveiro, Portugal
[2] Departamento de Química, CICECO, de la Universidad de Aveiro, 3810-193, Aveiro, Portugal

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Resumen
Antecedentes

Cr (V) de las especies se forman durante el intracelular de reducción de Cr (VI), un contaminante ambiental ubicuo. En este estudio, la toxicidad aguda de una fisiológicamente estable Cr (V) compuesto, [Cr V-BT] 2 - (BT = bis (hidroxietil) aminotris (hidroximetil) metano) se ha investigado en el sistema reproductivo masculino de la madurez sexual 60 -- Días de edad de sexo masculino ICR-CD1 ratones.

Métodos

Ocho semanas de edad, los animales fueron inyectados por vía subcutánea con una dosis diaria de aproximadamente 8 μ mol de Cr / ratón, durante 5 días. El grupo control fue inyectado con 0,5 ml de buffer de BT. Testículo y del epidídimo morfología se evaluó usando la luz y microscopía electrónica de transmisión. Epidídimo recuento de espermatozoides, la motilidad y la integridad acrosomal También se ensayada mediante métodos estándar.

Resultados

Epitelio seminífero se detectaron anomalías en el Cr V-BT grupo experimental, incluyendo intraepitelial vacuolización, y notable degeneración de las células de Sertoli, espermatocitos y espermátidas. La puesta en libertad prematura de las células germinales en el lumen tubular también fue evidente. Evaluación histológica de epidídimo compartimentos reveló características aparentemente normales. Sin embargo, el epitelio del epidídimo presenta vacuolización. [Cr V-BT] 2 - inducido una reducción de los espermatozoides integridad acrosomal. Sin embargo, la motilidad espermática y la densidad no se vio significativamente afectada.

Conclusión

Este estudio in vivo utilizando un Cr (V) compuesto, proporciona evidencia de los posibles peligros causados reproductiva en el sistema reproductor masculino por las especies que contienen cromo en los estados de oxidación intermedia.

Antecedentes

Cr (VI), compuestos han sido declarados potentes carcinógenos ocupacionales por la IARC [1]. Aunque el primer informe sobre el desarrollo de cáncer de pulmón en la industria del mineral de cromo ca apareció hace 80 años [2], varios estudios epidemiológicos realizados entre los trabajadores de casi un centenar de categorías profesionales (chapado de cromo, acero inoxidable soldadura, pigmentos y el curtido de cuero) Desde que se publicaron [3 - 5]. Numerosos y diferentes in vitro y / o los estudios in vivo, se han llevado a cabo ya sea en animales o en seres humanos y en la actualidad se sabe que existe una estrecha relación entre la salud de los trabajadores y los importes de la contaminación industrial provocada por las industrias de fabricación de materiales que contienen cromo [1, 6, 7].

Citotoxicidad y la carcinogenicidad de Cr (VI) dependerá de la reducción intracelular inerte y estable a Cr (III), compuestos [8, 9]. Durante este proceso de Cr (V) y Cr (IV) de los estados intermedios han ido adquiriendo mayor relevancia [10 - 12]. Cr (V) de los compuestos aparecen como buenos candidatos para aclarar el no se entienden por completo mecanismo intracelular de la pista de cromo [11, 12].

Cr (V) de los complejos de la posesión de α-hidroxi-carboxilato fracciones se cree que actúan como estructurales y biomiméticos modelos para una serie de Cr (V) de las especies generadas in vivo de Cr (VI) en los medios de comunicación intracelular [11, 12]. El [Cr V-BT] 2 - complejo, tiene un "diseño", que explota una adecuada coordinación de la capacidad de Cr metal centro junto con un fuerte efecto quelato, y es estable bajo condiciones fisiológicamente durante un período bastante largo de tiempo , Y, por tanto, parece ser una adecuada Cr (V), complejos que se han de estudiar para estudios in vivo [13].

Cromo estudios in vivo en pequeños roedores se han ocupado fundamentalmente a los efectos de este elemento en el habitual toxicológicos órganos diana. Obras recientes se refieren, por ejemplo, los riñones y el hígado [10, 14], [15] el páncreas, los pulmones [6, 16 - 18], [19] el cerebro, los órganos reproductores masculinos [20], [21] la piel, o incluso de sangre [22]. Estos estudios han compuesto tanto de partículas de compuestos de cromo, principalmente relacionadas con la patología pulmonar [16], junto con los compuestos solubles que contienen cromo disponibles en todos los estados de oxidación, más adecuados o disponibles para llegar a otros órganos diana.

En trabajos previos, hemos llevado a cabo estudios sobre el Cr (VI) y Cr (V) inducida por alteraciones en el hígado de ratón [14], el bazo y la histología [23]. Además, las propiedades funcionales de las células de Sertoli de ratones expuestos a Cr (V), se investigaron [24]. El propósito del presente estudio fue evaluar los efectos de [Cr V-BT] 2 - de la morfología del testículo y del epidídimo de ratones.

Métodos

Bis (hidroxietil) aminotris (hidroximetil) metano, (BT) de amortiguación (Fluka) y se utilizó el pH de la solución se ajustó a 7,4 por adición de HCl diluido.

Preparación de la Cr (V) compuesto [Cr V-BT] 2 --

[Cr V-BT] 2 - fue preparado in situ de un Cr (V) de los precursores, Na [Cr V O (ehba) 2] (= ehba sodio bis (2-etil-2-hydroxybutanoate) oxochromato (V)), Siguiendo un método descrito en otra parte [13].

Animales y Tratamiento

Los estudios in vivo, se llevaron a cabo el 10 (por grupo) a la madurez sexual de 60 días de edad, de sexo masculino-CD1 ratones ICR (Harlan Interfauna Ibérica SA, Barcelona, España). Los ratones fueron alojados a una temperatura constante (22 +2 º C), humedad relativa (40-60%) en un vivero de luz-oscuridad 12 h/12 h ciclo, el agua y los alimentos se proporcionaron ad libitum; se permite a los animales para aclimatarse Una semana antes de uso experimental. Después de este período, un grupo de ratones fue inyectado por vía subcutánea con una dosis diaria de 8 μ mol de Cr / ratón más de 5 días [15]. Un grupo de control de los animales fue inyectado de manera similar con el vehículo (0,5 mL BT). El día seis, todos los animales fueron sacrificados, bajo anestesia con éter, de testículo y del epidídimo eliminación.

Todos los ensayos con animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales para la ética en los experimentos con animales (Regla n ° 86/609/CEE - 24/11/92).

Estudios ultraestructurales

Cuerpo y peso de los órganos se registraron. Algunos fragmentos del testículo y del epidídimo cauda fueron fijados por inmersión en glutaraldehido al 2,5%, durante 2 horas, postfixed con tetróxido de osmio, y habitualmente preparado para estudios de microscopía electrónica de transmisión. Semithin secciones, realizados con una supernova ultramicrótomo Reichert, se tiñeron con azul de toluidina para la observación al microscopio de luz. Ultrathin secciones (color dorado de la interferencia) también fueron preparados utilizando un cuchillo de diamante. Luego, estos fueron teñidos con acetato de uranilo y citrato de plomo, y observó bajo un microscopio electrónico de Hitachi a 100 kV.

La motilidad de los espermatozoides

Epidídimos Ambos fueron trasladados a una cápsula de Petri que contiene el medio Tyrode modificado preparado según Fraser [25]. La cauda del epidídimo fue interrumpido a través de una incisión con una tijera previamente envuelto con Parafilm ®, y se mantuvo durante 30 min a 35 ° C para promover la liberación de los espermatozoides en el medio. Después, los espermatozoides fueron recogidos con un micropipette (alícuota de 20 μ l) a una diapositiva para el análisis de la motilidad. Motilidad de los espermatozoides fue determinado por el recuento de espermatozoides todos los progresistas, a la no-progresivo y la immotile esperma en el mismo campo. En cada preparación por lo menos 100 espermatozoides fue contado. Esta evaluación de la motilidad se repitió en una nueva preparación de la misma muestra de semen.

La concentración de espermatozoides

Una pequeña cantidad de esperma suspensión se recogieron mediante un tubo y se centrifuga para 5 1000 g. La bolita se suspende en los nuevos medios de comunicación. Una pequeña cantidad (20 μ l) de la suspensión fue diluido 1:1 con agua destilada. La concentración de esperma fue determinada contando el número de células en un haemocytometer (Neubauer Mejora de la Cámara).

Integridad acrosomal

Integridad acrosomal se determinó de acuerdo con Lu y Shur [26]. Los espermatozoides fueron fijadas en formol al 5% en PBS por 30 minutos a 23 ° C. Fijo espermatozoides fueron recogidos por centrifugación a 1000 g por 5 min y luego se resuspendió en 500 μ l de acetato de amonio 0,1 M pH 9,0. Espermatozoides se lavaron una vez en el buffer y luego resuspendido en 100 μ l de acetato de amonio. Una alícuota (20 μ l) de esta suspensión se seca en un portaobjetos de vidrio, y fue manchada por 2 min a 23 ° C con 0,22 Coomassie G250 azul en el 50% methanol/10% de ácido acético glacial. Después de la tinción, las diapositivas fueron lavadas con agua del grifo, y secado al aire montadas. La integridad de acrosoma fue ensayada por una intensa tinción en la región anterior de la cabeza espermática de menos de 400 × magnificación.

Resultados

En el estudio actual, todos los animales que sobrevivieron hasta el final del periodo de dosificación. Además, no se observó comportamiento anormal, y en el sacrificio, ninguno de los animales de cualquier evidencia lesiones macroscópicas. Su peso corporal al inicio y al final del experimento fue de 32 ± 3 g, y no la pérdida o ganancia en el peso corporal se observó a lo largo de los experimentos. Además, no se encontraron diferencias entre el peso de los órganos de control y Cr (V) de los animales inyectados en el período de esos experimentos (testículo peso = 267 ± 2 mg; epidídimo = 96 ± 1 mg). Los túbulos seminíferos en el control de ratones demostró ordinario de características (Figura 1A]. Sin embargo, degenerativas histológico se observaron cambios en el epitelio de los túbulos seminíferos de los animales tratados (Figura 1B]. Estos cambios fueron uniformes en el testículo, que van desde las células de Sertoli a muy maduro células germinales. Intraepitelial vacuolas se observó claramente. Anomalías que afectan a casi todas las etapas del desarrollo de células germinales se observaron en los túbulos seminíferos, siendo evidente necrótico masa de las células germinales. Además, todos los animales inyectados con [Cr V-BT] 2 - se vieron afectados por igual.

Las características ultraestructurales de la membrana basal, así como los compartimentos de la parte superior de los túbulos seminíferos, en el control de los animales reveló ordinario de la morfología. Sin embargo, [Cr V-BT] 2 - inyectaron ratones pone de manifiesto los cambios degenerativos en las células de Sertoli y las características irregulares de espermátidas, y el desplazamiento hacia el lumen (Figuras 2A-C]. Necrótico y vacuolar células germinales también estuvieron presentes.

Células epiteliales de la cauda del epidídimo [Cr V-BT] 2 - los animales tratados también mostraron un gran número de vacuolas (Figura 3]. Sin embargo, al igual que otras partes de la frontera de tejido, reveló características aparentemente normales.

El cuadro 1 muestra que [Cr V-BT] 2 - inducida por una ligera reducción de la motilidad espermática y la densidad, aunque las diferencias en comparación con los controles no fueron estadísticamente significativos. Integridad acrosomal esperma de los ratones tratados con [Cr V-BT] 2 - fue significativamente más bajos que los espermatozoides acrosomal integridad de los controles.

Discusión

Cr (VI) es conocido por ser tóxicos para los animales y los seres humanos [3]. Sin embargo la aplicación de los reglamentos ambientales y ocupacionales se han establecido para la reducción de los riesgos causados por los distintos tipos de compuestos de este elemento. No obstante, su mecanismo de la toxicidad asociada (s) siguen siendo poco claros. Por esta razón, un mejor conocimiento de la acción de las especies de cromo en los estados de oxidación intermedia, por ejemplo, que el Cr (V), es relevante en la comprensión de los efectos perjudiciales de cromo.

Principalmente debido al escaso conocimiento de la función de cromo en el estado de oxidación intermedia Cr (V), que se considera el primer paso en el largo y potencialmente perjudiciales Cr (VI) reducción intracelular [1, 3, 11, 12], en Estudios experimentales in vivo con [Cr V-BT] 2 - se han realizado en el presente trabajo.

Los resultados de este estudio indican que el Cr (V), en forma de [Cr V-BT] 2 -, es un tóxico para la reproducción masculina, causando varios cambios histológicos y ultraestructurales de la espermatogénesis en ratones, incluidas las modificaciones en los dos Sertoli y las células germinales. La presencia de exfoliadas fuertemente teñidas las células germinales en el lumen de los túbulos seminíferos de [Cr V-BT] 2 - los animales tratados demuestra el proceso degenerativo en este epitelio. Como demuestran los resultados del presente trabajo, el proceso de exfoliación es notable si se compara con las lesiones testiculares reportado en otras sustancias tóxicas [20, 27].

Cauda epidídimo también presentó algunas vacuolización epitelial. Resultados similares se han descrito para el epidídimo células epiteliales de las ratas tratadas, por ejemplo, con acetato de plomo [28].

Estos resultados sugieren que [Cr V-BT] 2 - más allá de inducir alteraciones en el testículo y del epidídimo histología y ultraestructura también induce una reducción de la motilidad espermática y la densidad. Otros autores también han descrito una reducción de espermatozoides del epidídimo y motilidad espermática en ratas tratadas con otros compuestos de cromo, es decir, CrO 3 [20]. En este sentido, la reducción de la integridad acrosomal espermática en ratones expuestos a Cr (V), es un signo de los espermatozoides de fertilizar el potencial perdido, que refleja su incapacidad para penetrar en la zona pelúcida [29]. Nuestros estudios previos han demostrado que el Cr (V) afectadas las propiedades funcionales de las células de Sertoli [24]. Estos resultados muestran evidencia de que otros componentes del testículo son importantes toxicológicos objetivos de Cr (V) de los compuestos.

Teniendo en cuenta que los mamíferos testículo y del epidídimo proporcionar un medio ambiente adecuado y necesario para la espermatogénesis, maduración y almacenamiento de los espermatozoides, los daños provocados por [Cr V-BT] 2 - compuesto parece de gran importancia en la comprensión de los efectos biológicos de la De cromo en lo que respecta a la función reproductora masculina.

Otros estudios están actualmente en curso en nuestros laboratorios en relación con otros órganos y otro tipo de experimentos, que combinan diferentes factores como varias dosis, intervalos de tiempo, y los diferentes compuestos de cromo. El objetivo es obtener datos de dosis-respuesta y, finalmente, para determinar la toxicidad de la toxicología límites para este tipo de compuestos y, por último, para aclarar los mecanismos de la toxicidad inducida por el cromo.

Lista de abreviaturas

BT - bis (hidroxietil) aminotris (hidroximetil) metano

Ehba - sodio bis (2-etil-2-hydroxybutanoate) oxochromato (V)

CrO 3 - Chromic ácido

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MLP, TMS, y JP concibe el estudio, y participaron en su diseño y la coordinación y la ayudó a redactar el manuscrito. TMS participó en la preparación de la Cr (V) compuesto [Cr V-BT] 2 -, y concluyó la revisión de la literatura. RPN, y HO llevó a cabo el estudio experimental en ratones, es decir, el histológico, y de la motilidad, la integridad acrosomal, y contar las células de esperma en virtud de Cr (V) de la exposición, y realizó el análisis estadístico. MLP llevó a cabo el estudio ultraestructural. Todos los autores leído, debatido, y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Centro de Investigación de Cerámica y Materiales Compuestos (CICECO) y CTS/22 Proyecto de Investigación de la Universidad de Aveiro.