Filaria Journal, 2005; 4: 9-9 (más artículos en esta revista)

Estudios sobre Acanthocheilonema viteae cystatin: organización genómica, promotor de estudios y de expresión en Caenorhabditis elegans

BioMed Central
Smitha Pillai (smitha_humboldt@yahoo.com) [1], Bernd H Kalinna (bernd.kalinna @ rz.hu-berlin.de) [1], Eva Liebau (liebau@uni-muenster.de) [2], Susanne Hartmann (Susanne.hartmann @ rz.hu-berlin.de) [1], Franz Theuring (franz.theuring @ charite.de) [3], Richard Lucius (richard.lucius @ rz.hu-berlin.de) [1]
[1] Department of Molecular Parasitology, Institute of Biology, Humboldt University Berlin, 10115 Berlin, Germany
[2] Department of Biochemistry, Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine, 20359 Hamburg, Germany
[3] Institute for Pharmacology and Toxicology, Charitée, 10115 Berlin, Germany

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Resumen

Cystatins son reversibles, fuertemente vinculante de los inhibidores de proteasas de cisteína. Filarial cystatins se le han atribuido propiedades inmunomoduladoras y han estado implicados en la inmunidad protectora. Para continuar la exploración de este potencial, en este ejemplo, hemos determinado la secuencia, la estructura y la organización de la genómica cystatin gen locus de A. Viteae. El gen está compuesto por 4 exones separados por 3 intrones y abarca ~ 2 kb de DNA genómico. La secuencia genómica aguas arriba contiene factor transcripcional sitios de unión, como AP-1 y NF-Y, un invertido CCAAT secuencia, y una caja TATA. Para investigar los sitios de cystatin expresión, gusanos Caenorhabditis elegans fueron transformados por microinyección putativo promotor con la región y el primer exón de la A. Viteae cystatin gen fusionado al reportero GFP. En transgénicos gusanos fluorescencia se observó en la faríngea y rectal células de la glándula cystatin sugiriendo que se secreta. Además, A. Viteae cystatin se expresó en C. Elegans para explorar su potencial como un sistema de expresión de los genes filarial.

1. Introducción

Filarial nematodos residen entre otros vasos linfáticos en la hipodermis o la de sus hospederos vertebrados, en el que a menudo persisten durante muchos años a pesar de una serie de mecanismos inmunes efectoras. La persistencia de los parásitos ha sido atribuido en parte al hecho de que se interfiera con la regulación de la respuesta inmune y anti-inflamatorios inducir reacciones inmunitarias [1]. Uno de los parásitos derivados de las moléculas descritas en este contexto es la filarial excretor / secretor de proteínas cystatin. Cystatins son reversibles, fuertemente vinculante de los inhibidores de proteasas cisteína [2]. Cystatin de Onchocerca volvulus fue descrita por primera vez por Lustigmann et al. [3]. Desde entonces, los estudios sobre cystatin de otros nematodos como la filaria de roedores Acanthocheilonema viteae [4], Brugia malayi [5, 6], Litomosoides sigmodontis [7], Nippostrongylus brasiliensis [8] y O. Vólvulo [9] han puesto de manifiesto que se trata de un modulador de la respuesta inmune del huésped. Cystatins de nematodos han demostrado interferir en la respuesta inmune por inhibición de las proteasas y la inducción de citoquinas [10 - 13] y por lo tanto puede ser considerado como un importante factor de patogenicidad. Cystatin de O. Vólvulo [14] y A. Viteae (inédito) también se han verificado como antígenos de la vacuna.

Funcional estudios sobre cystatin hasta la fecha se han basado en proteínas recombinantes expresadas en E. Coli [4]. La investigación de su función sin embargo podría ser simplificada por un exceso de expresión, knock-down de la proteína por RNAi [15] o la producción de mutantes knock-out. Aunque transfección transitoria de los estudios se han reportado en nematodos [16, 17], que se encuentran todavía en sus inicios y creó la C. Elegans sistema ofrece a sí mismo como un proxy modelo para estudios funcionales de los promotores filarial y antígenos. Krause et al. [18] informó de los estudios de expresión de O. Vólvulo GST-1a en C. Elegans y Kampkötter et al. [19] han demostrado que la O. Vólvulo GST-3 sobreexpresa en C. Elegans que podría conferir mayor resistencia a estrés oxidativo. Del mismo modo, un estudio de Redmond et al. [20] mostró que transgénicas C. Elegans fueron capaces de expresar una proteína glicosilada vacuna candidata de los nematodos gastrointestinales de los rumiantes, Haemonchus contortus. Expresión de antígenos de la vacuna candidata en C. Elegans, por lo tanto, podrían representar una forma de avanzar para producir proteínas recombinantes que están correctamente dobladas y llevar nematodos específicos después de la traducción modificaciones, que podrían ser pertinentes para la inducción de la respuesta inmunitaria protectora en hospederos vertebrados.

C. elegans ha sido explotado como un sistema de transformación heteróloga a examinar la actividad y la especificidad de nematodos parásitos de los promotores de genes [21, 22]. Más allá de una mera función como una expresión de acogida, la realización de estudios sobre transgénicos C. Elegans, que expresan el gen reportero GFP bajo el control de la filarial cystatin promotor también podría dar una idea en cuanto a la localización y, por tanto, a la hasta ahora desconocida cystatin en funciones de los nematodos. Además de su función como un inmunomodulador, cystatin se ha planteado la hipótesis de que para regular las proteasas están involucradas en procesos como la muda, y se ha demostrado que la inhibición de las proteasas de cisteína con productos químicos en realidad interfiere con la muda de O. Vólvulo [3, 23]. Por lo tanto, es posible que el proceso de la muda podría ser inhibido en C. Elegans expresando filarial cystatin, o que otro fenotipo resultados. Además, la expresión y liberación de transgénicos en cystatin nematodos podría alterar su interacción con el anfitrión, por ejemplo, inducir a un aumento de baja regulación de la respuesta inmune inflamatoria.

Como preludio a tales estudios funcionales analizamos la organización genómica de la cystatin de A. Viteae (Av17) y definió su promotor elementos. Hemos demostrado además que el promotor es funcional Av17 C elegans y en la comparación de la expresión de cDNA y la secuencia genómica de Av17 en C. Elegans.

2. Material y Métodos
2,1 Mantenimiento de las cepas de C. elegans

Wild tipo C. Elegans (N2 var Bristol), phaI (e2123) mutantes y transgénicos gusanos nematodos se cultivaron en el crecimiento medio (NGM) placas sembradas con E. OP50 coli y mantenido tal como se describe [24]. Los animales fueron cultivadas a 25 ° C (N2 var Bristol transgénicos y gusanos) o a 15 ° C (phaI mutantes).

La detección de un 2,2 A. viteae biblioteca genómica y el aislamiento de un clon Av17

Un A. Viteae biblioteca genómica, que se construyó en λ-guión se proyectó por hibridación ADN-ADN utilizando un producto de PCR de 405 pb amplificado de Av17 cDNA (GenBank adhesión # L43053) con primers (Av17fw, 5'-GTT TTG CGC GTG TGT GAA-3 '; Av17rv, 5'-CAC TGA TGA GAG TTC TAC-3') que abarca la región de 89 pb a 493 pb del cDNA. Mediante amplificación por PCR se realizó bajo las siguientes condiciones ciclismo: 94 ° C durante 5 min, 35 ciclos de 94 ° C durante 45 segundos, recocido de 1 min a 58 ° C, y la extensión a 72 ° C durante 2 minutos, con una prórroga final A 72 ° C durante 10 min. El producto resultante fue purificado por la separación a través de un gel de agarosa al 1% y DIG-DIG etiquetados con el Primer Alto ADN etiquetado Kit (Roche). Clones positivos fueron re-examinados por PCR utilizando combinaciones de los λ-guión universal primers T3 y T7 y el primer Av17 inversa. Ciclismo condiciones fueron: 94 ° C por 1 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 45 segundos, recocido de 1 min a 53 ° C, y la extensión a 72 ° C por 2 min, con una extensión final a 72 ° C durante 20 Min. Un producto de aproximadamente 2800 bp, que fue amplificado utilizando T3 y la Av17 invertir primers fue subcloned en pGEM-T Easy (Clontech) y secuenciados.

2,3 Síntesis de cDNA A. viteae

Para generar cDNA de A. Viteae, gusanos fueron interrumpidas por moler en nitrógeno líquido y luego suspendido en buffer de lisis (ARN RNAeasy Extracción Kit, Qiagen). ARN total fue extraído de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Después de ARN aislamiento, la contaminación residual de ADN fue removido por la digestión con RNAse libres de DNAse (Promega). El ARN se precipitó para eliminar el DNAse, disuelto en RNAse libre de agua, y se utiliza como plantilla para oligo (dT) cebados invertir transcripciones, con el Virus de la Leucemia Moloney Murine H (-) Punto Mutant RT (Promega). El cDNA sintetizado se utiliza para la reacción de PCR con cebadores diferentes.

2,4 Secuencia de análisis

Secuencia de análisis se realizó a través de ABI Dye Terminator química. El fragmento clonado de la A. Viteae gDNA que abarcan el putativo 5 'upstream secuencia genómica de cystatin se analizó la presencia de elementos promotor y factor de transcripción sitios de unión utilizando el PromoterInspector y MatInspector público en http://www.genomatix.de software (Software Genomatix, Braunschweig, Alemania ).

2,5 Construcción de Av17 promotor: reportero plásmidos

Por Cos7 transfección de células, el plásmido pGEM-T que contiene el clon genómico aislado se utilizó como plantilla en una reacción de PCR para amplificar la región río arriba genómica utilizando el plásmido específicos SP6 y un KpnI KpnI vinculados clon específicos primer inversa (Av17rvKpn, 5 'GTA CCA CCG TAT TCG TCG TTA GCT TTG TTT 3'). El producto fue digerida con SacI SacI y KpnI KpnI y ligated en pEGFP-N1 (Clontech). El plásmido resultante fue digerido con SacI SacI y AflII AflII. El fragmento de 1710 bp que codifica el potencial Av17 promotor, EGFP y el SV40 poli-A fue purificado por electroforesis en agarosa y ligated en pSL1180 (Pharmacia). Para construir un promotor de menos control negativo plásmido, pEGFP-N1 fue digerido con EcoRI EcoRI y AflII AflII. El fragmento de 1010 bp que comprende el gen reportero y el SV40-polyA fue entonces ligated en pSL1180. Como control positivo en estudios de transfección pEGFP-N1 fue utilizado.

Para construir un plásmido Av17 promotor de la transformación de la C. Elegans, el plásmido pGEM-T que contiene el clon genómico aislado se utilizó como plantilla en una reacción de PCR para amplificar la región putativo promotor junto con el primer exón de la Av17 utilizando primers específicos (prAvfw, 5'-AAG CCC CTT TAA CCC TCA CTA AAG GGA-3 'y prAvrv, 5'-AAC TGC AGA TTG TCC TGC CGT CAT CC-3'). El producto fue clonado en el vector pPD 95.77 (kit de laboratorio de Fuego, 1995), en el marco de genes con el reportero GFP para obtener pPrAvGFP.

2,6 Construcción de plásmidos para la expresión de Av17 en C. elegans

El Av17 cDNA y la pGEM-T clon que contiene la secuencia genómica de Av17 se utilizan como plantillas en las reacciones de PCR con cebadores que se incorporó la restricción NheI NheI sitio en el 5 'final de la secuencia (Av17fwNhe Av17fwNhe, 5'-TAT GGT TCA AGC ATG ATG TTG AAG TCA ATA-3 '), junto con una cartilla que se incorporó la C-terminal 6X Su etiqueta y una restricción KpnI KpnI sitio en el extremo 3' (Av17rvHisKpn Av17rvHisKpn, 5'-TAT TCA CGG AAT CTC TAC GGT GAT GGT GAT GGT GAT GCA CTG ATG AGA GTA C-3 '). Los productos de PCR fueron clonados en el vector pPD49.83, que contiene el C. Elegans hsp16/41 promotor y un intrón sintéticas, para obtener p49Av17c (Av17 cDNA) y p49Av17g (Av17 gDNA). Proteína expresada bajo el control de este promotor de choque térmico se dirige a las células del tubo digestivo de los gusanos transgénicos [25].

La secuencia de cDNA Av17 también fue amplificado utilizando los primers específicos, 5'-TAT TCA GCT AGC ATG CAC CAC CAT CAT CAT CAC ATG TTG ATG TCA ATA AAG-3 '(Av17fwHisNhe) incorporando NheI y una secuencia N-terminal y la etiqueta 6XHIS 5'-TCC CCC CGG GTC ATG TAC TTT ACA A-3 '(Av17rvUTRSma) la incorporación de la 3'UTR de los genes y Av17 restricción SmaI SmaI sitio. El producto fue clonado en el vector pPD103.05 para obtener p103Av173 '. Este plásmido se ha elegido ya que el dejar-858 promotor doquier la expresa en todas C. Elegans tejidos [26].

2,7 Transformación de las células Cos7

Cos7 células se mantuvieron en RPMI 1640 (Biochrom) suplementado con 10% de FCS (Biochrom) en condiciones normales de cultivo de tejidos y las condiciones fueron transfectadas utilizando lipofectamin reactivo (Invitrogen). Las celdas eran de plata de las (10 5 por pocillo) en placas de 12 y 24 h antes de la transfección. Dos μ g del plásmido deseado y 8 μ l lipofectamin se resuspendió en 100 μ l de medio libre de suero por separado. Después de los 30 min de incubación a temperatura ambiente (RT) de las soluciones se mezclaron y se incubaron durante otros 30 minutos a TA. Con este, 800 μ l medio libre de suero fue añadido y se aplica a las células. Después de 6 horas de incubación en condiciones normales de cultivo de tejidos condiciones de la transfección de reactivos fue removido y las células se mantuvieron en completo RPMI 1640 antes de examen microscópico después de 48 h.

2,8 Transformación de C. elegans

Para promotor estudios, de jóvenes adultos hermafroditas de tipo salvaje (WT) gusanos fueron inmovilizados en agarosa almohadillas overlayed con aceite mineral y la construcción de pPRAvGFP junto con el marcador pRF4 plásmido (una especie de regalo de James M. Kramer, Northwestern University Medical School) fue microinjected En las gónadas en una concentración de 100 ng / μ l. La inyección se realiza a una presión de 460 psi usando femtotips (Eppendorf, Alemania). La transformación de amortiguación figura 2% w / v PEG 6000, 20 mM KH 2 PO 4 y 3 mM citrato de potasio. El marcador plásmido confiere transgénicos gusanos con un rodillo fenotipo. Sólo gusanos de la segunda y posteriores generaciones, que mostraron tanto el rodillo fenotipo expresión y las buenas prácticas agrarias se utilizaron para un análisis más detallado de la Av17 promotor. Como control negativo, WT gusanos se microinjected con pRF4 y promotor de menos pPD95.77.

Por la expresión de Av17, C. Elegans elegans, pha-1mutants (e-2123) fueron transformados por la microinjecting construye p49Av17c, p103Av173 'y p49Av17g en las gónadas junto con el plásmido pBX marcador en una concentración de 100 ng / μ l cada uno. El transformado gusanos fueron seleccionados por su capacidad de sobrevivir y reproducirse a 25 ° C. El seleccionado 103cAv173 gusanos ", 49cAv17 y 49gAv17 se mantiene en las líneas discretas a 25 ° C. Integración de las extracromosómicos arrays se logró por la irradiación gamma de los transgénicos gusanos con 35 Gy. La progenie de estos gusanos fue entonces examinado por el 100% de transmitancia para obtener líneas con chromosomally integrado transgens. Para verificar si el transformado C. Elegans Av17 construcción de la figura, de un solo gusano de PCR se realizó en la generación F2 primers utilizando el mismo como para la RT-PCR. Única gusanos fueron recogidos de las placas y NGM suspendida en 2,5 μ l de buffer de lisis (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 2,5 mM de MgCl 2, el 0,45% w / v Nonidet P 40. 0,45% v / v Tween 20, 0,1% de gelatina y 200 μ g / ml de proteinasa K) y congelado en hielo seco por 20 min. Las muestras fueron incubadas a 60 ° C durante 1 h para la digestión de las proteínas y a 95 ° C durante 15 min para inactivar la proteinasa K. El ADN resultante se mezcla con maestría la mezcla de PCR, ciclismo condiciones fueron de 94 ° C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 94 ° C durante 1 min, 57 ° C por 1 min y 72 ° C por 1 min y una extensión final de 72 ° C durante 10 min. Los productos fueron resueltos en gel de agarosa al 1%.

2,9 Microscopía

La luz y microscopía de fluorescencia para EGFP observaciones en la detección de células Cos7 se realizaron utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan (Oberkochen, Alemania) con un azul (número 487909) filtro de excitación serie. Los transgénicos C. Elegans gusanos con promotor-reportero se construye inmovilizado en agarosa pastillas y observó usando un Microscopio Confocal Leica (TCS SP2) (Heidelberg, Alemania).

2,10 Análisis de la transcripción de ADN

Transcripción de la construcción fue inyectada analizados por RT-PCR usando ARN total preparado a partir de 0,5 mg de peso húmedo transformado gusanos (103Av173 ', 49cAv17 y 49gAv17) como se ha descrito anteriormente. 49cAv17 líneas transgénicas y 49gAv17 recibieron un choque térmico a 33 ° C durante 3 h antes de RNA total aislamiento. El sintetizó cDNA se utilizó como modelo en una reacción de PCR usando primers específicos Av17 (Av17fwNhe y Av17rv, véase más arriba). La amplificación de los no transgénicos gusanos se incluyó como control. PCR se realizó con los siguientes ciclos térmicos condiciones: 94 ° C, 1 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 1 min, recocido 1 min 57 ° C, y la extensión a 72 ° C por 2 min, la última prórroga de 72 ° C 10 min. Los productos fueron separados en gel de agarosa al 1%.

2,11 Análisis de la expresión de Av17 transgénicos en C. elegans lisado

Gusanos transgénicos se cultivan en grandes cantidades en las culturas NGM líquido a 25 ° C con E. OP50 coli como fuente de alimentos. Worm línea con el gen Av17 aguas abajo del promotor inducible hsp (49cAv17) se ha dado un choque térmico a 33 ° C por 3 h. Los principales contaminantes del nematodo de la cultura fueron limpiados por centrifugación a través de un 60% de sacarosa en 0.1M NaCl [27]. Los gusanos se congelaron en nitrógeno líquido y homogeneizada con un mortero y pestle en buffer de lisis (20 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, pH 7.4). El lisado se separó en un 14% SDS-gel de poliacrilamida. Western Blot se realizó un análisis como se describe [28]. La mancha se incubaron con una dilución de 1:5000 monoclonal anti-Su ratón anticuerpos (Qiagen, Alemania) y la fosfatasa alcalina junto cabra anti-ratón diluido 1:5000 de anticuerpos se utilizó como conjugado.

Además, la progenie de los gusanos transgénicos que expresan constitutivamente Av17 (103cAv173 ') y se cuantificó en comparación con el uninduced transgénicos gusanos con Av17 aguas abajo de hsp promotor (49cAv17). Adultos jóvenes hermafroditas (seis de cada uno) fueron trasladados a los gusanos NGM placas y el número de huevos y de larvas en cada muda se cuantificaron.

3. Resultados
3,1 aislamiento de un clon genómico Av17

Después del control de ~ 10.000 placas de un A. Viteae λ-guión biblioteca genómica, un clon (gAv17) se obtuvo. El inserto de gAv17 se ~ 2,8 kb de longitud, y la secuencia cuando se llegó a la conclusión de incluir a toda la Av17 gen. Comparación con la secuencia publicada del cDNA de la A. Viteae Av17 reveló que la secuencia genómica se compone de 702 pb de la región promotora putativo, 4 exones de 166 pb, 158 pb, 51 pb y 97 pb, intercaladas por 3 intrones de tamaños de 222 pb, 158 pb y 1020 bp, seguido por 191 bp de 3 'sin traducir secuencia (Fig. 1].

Varios putativo secuencias reguladoras podrían ser identificados por ordenador en el análisis de los 702 pb aguas arriba secuencia genómica (Fig. 1]. Un putativo TATA-box se encuentra en la posición -296. Consenso de reconocimiento de los sitios a los factores de transcripción NF-Y AP-1 y fueron identificados en las posiciones -37, -353 y -583, respectivamente. Un invertido CCAAT caja se ubicó en la posición -603.

3,2 Funcional de estudios Av17 promotor

El putativo promotor región de 702 pb fue capaz de promover la expresión transitoria del reportero EGFP en células de mamífero. EGFP fluorescencia fue detectado en el 5% de Cos7 células transfectadas con el promotor de la construcción de EGFP (datos no presentados) con la misma intensidad que el control positivo. Cos7 células transfectadas con un promotor-plásmido menos control no mostró ningún EGFP fluorescencia.

3,3 Promotor estudios en C. elegans transgénicos

C. elegans se utilizó como un sistema heterólogo para analizar la capacidad de la secuencia genómica de aguas arriba Av17 para promover la expresión de los genes reportero, las buenas prácticas agrarias. El promotor se microinjected construir en las gónadas de los jóvenes salvajes tipo C. Elegans junto con el plásmido marcador. Animales transgénicos transformado a partir de tres líneas fueron examinadas. Todas las líneas de expresión mostraron las buenas prácticas agrarias en todas las etapas de los gusanos, L1, L2, L3 y adultos, pero no en los huevos. Expresión más fuerte se observó en las células glandulares de la faringe, que constará de 2 células (g1 y g2; Fig. 2A, B]. Expresión de las buenas prácticas agrarias también se observó en las glándulas rectal (Fig. 2C, D], que consta de tres grandes células (recD, recVL, rectVR), y está conectado a la luz intestinal sólo posterior a la válvula rectal.

3,4 Transformación de C. elegans con A. viteae cystatin

La temperatura sensible pha I mutante de C. Elegans se utiliza para la microinyección experimentos para facilitar la selección de los transgénicos que expresan Av17 gusanos. El factor de transcripción pha-1 es necesaria para la morfogénesis de la faringe [29, 30]. En la pha-1 mutante gusanos de la faringe no se someten a la diferenciación y la mutación interfiere en el desarrollo embrionario a 25 ° C, lo que hace más fácil para la selección de los transgénicos gusanos, que se co-transfectadas con el plásmido de rescate. Líneas transgénicas de gusanos, 103cAv173 '(inyectados con p103Av17), 49cAv17 (inyectados con p49Av17c) y 49gAv17 (inyectados con p49Av17g) se establecieron y mantuvieron como líneas discretas. Con el fin de integrar el plásmido construye en el genoma, los gusanos fueron expuestos a la radiación γ-y sometidos a otra ronda de cribado. El F2 y las posteriores generaciones de transgénicos líneas se utilizaron para el análisis. Única gusano a prueba de PCR para detectar la presencia de construcciones inyectados mostraron que los gusanos (49cAv17, 103cAv173 'y 49gAv17) eran transgénicos. No fue producto de la amplificación de pha-1 control de los gusanos (Fig. 3A].

3,5 Transcripción y traducción de C. elegans en Av17

La transcripción de Av17 en C. Elegans fue demostrada por RT-PCR. Un producto de 475 pb en consonancia con el tamaño previsto de la codificación de la región se obtuvo de los clones de cDNA que contiene la secuencia de Av17 (Fig. 3B, carril 2). En los gusanos con la secuencia genómica (49gAv17), transcripciones de mayores dimensiones se ampliaron, que se encontraron en la secuencia de incluir una parte de la primera intrón (Fig. 3B, carril 3). Además los análisis revelaron que el empalme de donantes conservadas intrón sitio AG / gt aparentemente fue leído a través de la segunda y AG / gt abajo en el primer intrón fue reconocido como el empalme del área donante. Los restantes intrones son empalmados a cabo correctamente para obtener una transcripción de 626 pb (Fig. 4, ii), incluyendo 152 pb del primer intrón, en lugar de una transcripción tamaño de 475 bp, si empalme se habían producido correctamente. Ningún producto de amplificación se obtuvo del control pha-1 gusanos.

En un western blot, anticuerpos anti-Su específicamente una banda de 17 kDa en el transgénicos C. Elegans líneas 103cAv173 'y 49cAv17 expresando constitutivamente Av17 y en virtud de choque térmico (Fig. 3C]. No se observó expresión pha-1 en el control de gusanos y 49gAv17.

En Av17 gusanos expresando constitutivamente (103cAv173 '), de 20 ± 15,9 huevos sólo 5,2 ± 3,8 desarrollados para adultos. La reducción en la capacidad de los huevos para desarrollar a los adultos es significativa (p <= 0.0129) en comparación con los gusanos transformado con Av17 aguas abajo de hsp promotor uninduced pero, en caso de los huevos de 24 ± 16,4, 10,2 ± 19 desarrollado para adultos (datos No se muestra).

4. Discusión

En este estudio, hemos determinado toda la organización genómica y la secuencia de A. Viteae cystatin gen. Se identificaron putativo promotor elementos de la secuencia genómica aguas arriba y utilizado C. Elegans como un sistema heterólogo para determinar la localización de Av17 en el gusano de los tejidos. También hemos expresado la proteína del parásito en C. Elegans, lo que demuestra que es posible utilizar nematodo de vida libre como un sistema para la expresión de proteínas de nematodos parásitos.

Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado un gen de cystatin A. Viteae, aunque 2 isoformas de cystatin se han notificado en B. Malayi [6] y en el C. Elegans [13]. En C. Elegans la cystatins también son secretadas como en los gusanos parásitos, pero no tienen las mismas propiedades inmunomoduladoras [13], en lugar de que podría desempeñar un papel durante la muda. RNAi de C. Elegans cystatins no muestra fenotipos visibles, posiblemente debido a su pérdida de la función es compensada por otros inhibidores de la proteasa.

La secuencia genómica de Av17 contiene 3 intrones de tamaños de 222 pb, 158 pb y 1020 pb, respectivamente. Todos los intrones en el gen Av17 tener un consenso empalme de donantes sitio, y tb un consenso sitio aceptor de empalme, AG [31]. Los 702 pb aguas arriba de la secuencia genómica Av17 contiene una caja TATA, una caja invertida CCAAT secuencia consenso y el reconocimiento de los sitios a los factores de transcripción AP-1 y NF-Y. Sitios de unión para el factor de transcripción AP-1 se encuentran en numerosos mamíferos immunoregulatory y genes inflamatorios [32]. En la región promotora de los mamíferos salival Cystatin S la presencia de un AP-1 sitio de unión ha sugerido a desempeñar un papel en la regulación de la expresión [33]. Entre los parásitos, AP-1 ha demostrado ser implicados en la regulación transcripcional de Schistosoma mansoni calreticulin [34]. Upstream secuencias de los genomas de C. Elegans cystatins no tienen factor de transcripción sitios de unión comparable a Av17. Estudios adicionales sobre el promotor son los elementos necesarios para determinar el papel que desempeñan en la regulación de cystatin. La secuencia promotora putativo fue sin embargo capaz de impulsar las buenas prácticas agrarias Cos7 expresión en las células, lo que demuestra que es funcional.

El patrón de expresión de Av17 se analizó en líneas transgénicas de C. Elegans obtenidos por microinyección de la Av17promoter:: GFP construir. Hemos observado las buenas prácticas agrarias de expresión en todas las etapas de larvas y los adultos de los transgénicos C. Elegans, que muestran que es Av17 temporalmente expresado como los gusanos parásitos en [4]. La expresión más fuerte se observó en el microscopio de luz en g1 y g2 glándula células de la faringe y las células de la glándula rectal transgénicos C. Elegans. Sin embargo, inmunoticción por inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos anti-Av17 localizados en Av17 A. Viteae y el uso de anti-C. Elegans cystatin anticuerpos localizados en cystatins C. Elegans a la hipodermis y en el desarrollo de los ovocitos y embriones (propios datos no publicados). Es posible que la expresión en las glándulas faríngeas y rectal también se produce en filarias, estos nematodos, pero como no puede ser transformado con construcciones genéticas como reportero, sin embargo, un análisis de la expresión de estas glándulas requerirá una amplia estudios ultraestructurales. El immunolocalization por inmunofluorescencia indirecta en la hipodermis y en el desarrollo de las etapas, es decir, en los compartimentos que no fueron manchados por reportero de la expresión de genes, sugiere immunolocalization podría ser más sensible que la expresión de genes reportero. Alternativamente, es posible que la secuencia promotora Av17 utilizado puede ser incompleto y requiere de elementos adicionales de reglamentación para conducir a la expresión más fuerte hipodermis. La incapacidad de la C. Elegans transcripción maquinaria para leer correctamente las secuencias reguladoras filarial también no se puede descartar. Futuros análisis de la expresión de la secuencia promotora de C. Elegans cystatins resolvería esto.

El reportero de la expresión de genes en células de la glándula y faríngea, es decir, células que liberan productos al exterior medio ambiente, es compatible con la anterior muestra y sugiere las funciones de cystatin como un inmunomodulador [13] y en la muda [37], respectivamente. Como estas glándulas son estimuladas faríngeos sincrónicamente con la actividad de bombeo, se plantea la cuestión de si cystatin tiene un papel en la digestión. En general, en el C. Elegans células de la glándula se han propuesto para almacenar las enzimas digestivas, ya que la digestión y absorción de nutrientes se producen en el intestino. Sin embargo, en filarial nematodes transcuticular transporte se considera como la vía principal para la absorción de nutrientes [36]. Esto sugiere que Av17 en filarial nematodos no pueden ser involucrados en la regulación de las proteasas digestivas. En lugar filarial cystatin pueden haber evolucionado para convertirse en un inmunomodulador que permanentemente es secretada por los parásitos. Ello estaría en consonancia con la observación de que las moléculas de las filarias tienen la capacidad de inducir la producción de citocinas antiinflamatorias en los macrófagos de acogida y cambiar el fenotipo de estas células, mientras que C. Elegans cystatins no tienen estas propiedades [13] .

Desde cystatin es una posible vacuna contra el candidato [14], destinadas a uso C. Elegans como sistema de expresión. Una posible ventaja de utilizar C. Elegans como anfitrión para la expresión de antígenos de la vacuna filarial candidatos, en comparación con procaryotic sistemas de expresión, es que después de la traducción modificaciones, que podrían ser pertinentes para la inducción de la respuesta inmunitaria protectora, probablemente se conservan entre los nematodos. A. Viteae cystatin se prevé que tengan una O-glicosilación y dos sitios de fosforilación. El ADN y la secuencia de aminoácidos de Av17 difiere considerablemente de la C. Elegans cystatins excepto conservadas evolutivamente en el sitio de unión enzima [13]. Adicionalmente C. Elegans es un sistema apropiado para la evaluación de su potencial para expresar esta vacuna desde la detección del antígeno de la proteína recombinante es posible por anticuerpos específicos.

La expresión de Av17 fue detectable en transgénicos C. Elegans líneas transformadas con la secuencia de cDNA por inmunoblotting con anticuerpos anti-Su y anticuerpos específicos para Av17 si bien, no fuimos capaces de purificar la proteína usando Ni-quelato cromatografía de afinidad. Esto se debe probablemente a la inaccesibilidad de los 6-Su líder en lisados, un efecto que no es raro que otras proteínas recombinantes (propias observaciones no publicadas) y probablemente depende de la interacción de la acusada 6-Su etiqueta con otros tramos de la proteína. Un aumento de la expresión de Av17 recombinante y la utilización de otros métodos de purificación podría conducir a la producción de C. Elegans-Av17 expresado en cantidades susceptibles de nuevos estudios. Además, la reducción en el número de huevos a adultos en el desarrollo de los gusanos expresando constitutivamente Av17 sugiere que la expresión de inhibidor de la proteasa interferido con las proteasas implicadas en la diferenciación o la muda de los gusanos.

En la C. Elegans líneas, 49gAv17, Av17 transcripciones incluía una parte del primer intrón. Una secuencia de 152 pb río abajo en el primer intrón fue reconocido como el 5 'empalme de donantes sitio y tiene el consenso de la secuencia AG / gt. Tiene una guanina (g) +5 en la posición (es decir, AG / gtttga gtttga gtttga), a diferencia de la original de donantes sitio de empalme del primer intrón de Av17, que tiene una cytosine (es decir, AG / gttacc gttacc gttacc). Intrones 2, 3 y 4 tienen una guanina en la posición +5 (Tabla 1]. La mayoría de C. Elegans intrones [38] También se han conservado esta guanina +5 en la posición de la zona donante incluidas las de los homólogos cystatins. Esto sugiere que la conserva G +5 en la posición de los donantes en el sitio de empalme podría ser necesario que se le reconozca el intrón 5 'en el sitio C. Elegans. La mayoría de los intrones (70%) de otro gen de A. Viteae, chitinase, han conservado la G en la posición +5 (Babila Tachu, comunicación personal), pero no hay suficiente información sobre la organización de los genes de esta especie filarial para permitir una conclusión acerca de la especificidad de exón / intrón reconocimiento. El 3 'aceptor de empalme intrón secuencia de uucag / A fue reconocido correctamente y el otro intrones son empalmados en la normal en sitios como A. Viteae. Estudios anteriores con la expresión de O. Vólvulo y H. Contortus proteínas GFP fusiones como en C. Elegans mostraron que los intrones son empalmados a cabo normalmente [18, 20]. Nuestros resultados, por primera vez, sugieren que el intrón de empalme y el reconocimiento pueden diferir entre C. Elegans y A. Viteae por lo menos con respecto a cystatin. Debido a esas diferencias, la expresión de genes extraños en C. Elegans podría tener más éxito si ADNc de las secuencias de genes se utilizan, en comparación con el uso de ADN genómico.

Contribuciones de los autores

SP llevado a cabo la clonación, promotor de los estudios y de expresión en C. Elegans y redactó el manuscrito. BK trabajado en la secuencia genómica, analizó el promotor y contribuyó al manuscrito. EL participó en la generación de transgénicos C. Elegans. SH contribuido a la revisión del manuscrito. FT participó en la generación de transgénicos C. Elegans. RL concibe el estudio, y participaron en su diseño y la coordinación y la ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la concesión de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Lu 325/8-1 a RL). Damos las gracias a Cora Burmeister (Instituto Bernhard Nocht de Medicina Tropical) por la ayuda con microinyección de la CGC y de proporcionar C. Elegans cepas. Damos las gracias a Jörg Hirzmann (Universidad de Giessen) de la prestación de los genómica A. Viteae biblioteca.