Genetic Vaccines and Therapy, 2005; 3: 5-5 (más artículos en esta revista)

Silenciar el receptor del factor de crecimiento epidérmico de genes con RNAi puede ser desarrollado como un potencial para la terapia de células no pequeñas de cáncer de pulmón

BioMed Central
Zhang Min (zhangmin712@sina.com) [1], Xin Zhang (xinhaier@sina.com) [1], Chun-Bai Xue (cxbai@zshospital.com) [1], Xian-Rang Song (songxianrang @ hotmail. Com) [2], Jie Chen (j.chen @ sina.com) [1], Lei Gao (l.gao @ zshospital.com) [1], Hu Jie (j.hu @ zshospital.com) [1] , De Hong Qun-Ying (q.hong @ sina.com) [1], Malcolm J Occidental (malcolm.west @ uq.edu.au) [2], Q Wei Ming (d.wei @ mailbox.uq.edu. AU) [2]
[1] Departamento de Enfermedades pulmonares, Zhong Shan Hospital, Fudan University, Shanghai, PR China
[2] Departamento de Medicina de la Universidad de Queensland, el Príncipe Carlos Hospital, Brisbane, Australia

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen

El cáncer de pulmón se ha convertido en una de las principales causas de muerte por cáncer en el mundo. De células no pequeñas de cáncer de pulmón (CPNM) representa el 75-80% de todos los casos de cáncer de pulmón. Terapias actuales son ineficaces, por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques para mejorar la relación terapéutica. Doble varados RNA (dsRNA) mediada por RNA de interferencia (RNAi) ha mostrado promesa en el silenciamiento génico, la posibilidad de que en el desarrollo de nuevos métodos para el tratamiento del CPNM necesita ser probado. Presentamos aquí RNAi inducida eficaz silenciamiento de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) gen, que es expresado en más de CPNM. CPNM líneas de células A549 y SPC-A1 fueron transfectadas con secuencia específica de dsRNA así como los diversos controles. Inmune fluorescentes etiquetado y citometría de flujo se utilizan para supervisar la reducción de la producción de la proteína EGFR. Cuantitativo-la transcriptasa inversa se usó PCR para detectar el nivel de EGFR mRNA. Celular, colonia ensayo, el ensayo de la nada, MTT de ensayo in vitro y el crecimiento tumoral en el ensayo athymic nude mice in vivo se utilizaron para evaluar los efectos funcionales de EGFR silenciamiento sobre el crecimiento de las células tumorales y la proliferación. Nuestros datos muestran transfección de células con CPNM dsRNA resultado en la secuencia específica silenciamiento de EGFR con 71,31% y 71,78% de proteína EGFR disminuciones en la producción y el 37,04% y el 54,92% en la transcripción del mRNA en el A549 y SPC-A1 células respectivamente. La disminución en la producción de la proteína EGFR causado un crecimiento significativo de inhibición, es decir: reducir el número de células total de 85,0% y 78,3%, y los números de formadoras de colonias por el 63,3% y el 66,8%. Estos efectos retardados mucho la migración de células de cáncer en más de un 80% tanto a las 24 horas y a las 48 h, y el aumento de la sensibilidad a la quimioterapia-cisplatino por cuatro veces en células A549 y siete veces en RCP-A1. Además, dsRNA específicas para EGFR inhibe el crecimiento tumoral in vivo, tanto en el tamaño de 75,06% y en 73,08% por peso. Nuestros datos demuestran un nuevo efecto terapéutico secuencia específica de represión de la expresión de genes EGFR por RNAi, que permite la inhibición de la proliferación tumoral y el crecimiento. Sin embargo, in vivo uso de dsRNA de transferencia de genes a las células tumorales se limitaría dsRNA porque sería rápidamente degradada, una vez emitido en vivo. Por lo tanto, puso a prueba un nuevo vector lentiviral bovina y mostró lentivector mediada RNAi efectos fueron eficientes y específicos. Combinar RNAi con el sistema de entrega de este gen puede permitir desarrollar RNAi para silenciar EGFR en un tratamiento efectivo para CPNM.

Antecedentes

El cáncer de pulmón es una de las principales causas de muerte por cáncer en Australia y en el mundo [1, 2]. Hay dos tipos de casos de cáncer de pulmón, de células no pequeñas (NSCLC) y de células pequeñas (SCLC). CPNM representa el 75-80% de todos los casos de cáncer de pulmón. En general, cáncer presenta una baja de cinco años la tasa de supervivencia de sólo el 8-14%. Además, aproximadamente el 75% de todos los pacientes con CPNM avanzado de cáncer [3]. Los objetivos para la gestión de este grupo de pacientes ya no son curativos, pero en lugar de ello, paliativos, para prolongar el tiempo de supervivencia a través de la paliación de quimioterapia o la mejor atención de apoyo [4]. La mediana de supervivencia de un paciente con CPNM avanzado o metástasis es de aproximadamente seis a ocho meses [4, 5]. Evidentemente, el futuro de la terapia depende de la creación de nuevas' objetivo de los agentes que explorar métodos de inhibir el crecimiento tumoral, o la sensibilización de los tumores a la quimioterapia o la radiación que añadir a insatisfactoria actual armamento terapéutico.

La terapia génica es una estrategia de este tipo que se está considerando. Varios genes que se han explorado, incluyendo el factor de necrosis tumoral [6], el gen P53 tumor suppresser [7], el virus de Herpes simple tipo 1 (HSV-1), la timidina kinasa (TK), y bacteriana cytosine deaminasa (CD) de genes [8] . Estos enfoques generalmente trató de entregar el gen (s) a las células del cáncer, y espera que el transgén se traduciría en una proteína para proporcionar un efecto terapéutico. Sin embargo, los ensayos clínicos han demostrado que el resultado terapéutico es muy limitada por la escasa eficiencia de los actuales sistemas de vectores de transferencia génica, la insuficiencia de la debilidad de los promotores para conducir expresión de los transgenes. Por lo tanto, hasta el momento, sólo tres protocolos de terapia genética del cáncer ha llegado a ensayos de la fase III antes de ser terminado.

Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es una glicoproteína con un peso molecular de 170000 a 180000. Se trata de una intrínseca específica de la proteína tirosina quinasa, que se estimula a los del factor de crecimiento epidérmico (EGF) vinculantes. El conocido los efectores de EGFR incluir PI3-K, RAS-RAF-MAPK P44/P42, y la proteína quinasa C vías de señalización. EGFR señalización participan en el crecimiento celular, la angiogénesis, la reparación del ADN, y en la regulación del crecimiento autocrina CPNM, así como en un amplio espectro de las células del cáncer humano [9]. Así, recientemente ha surgido como un innovador objetivo para el desarrollo de la nueva terapia de cáncer, en particular para NSCLC [10].

Recientemente, un anticuerpo monoclonal denominado cetuximab contra el EGFR se ha desarrollado. Ha demostrado excelentes efectos clínicos para el tratamiento del cáncer de pulmón y cáncer de cabeza y cuello en un ensayo clínico en seres humanos [11, 12]. Otros pequeños inhibidores químicos, como el ZD-1839 también se han desarrollado y demostrado efectos anti-tumor en los estudios in vitro e in vivo [13]. Sin embargo, el uso clínico de ZD-1839 en los seres humanos no ha sido muy exitosa. Aunque a largo plazo, evaluación de las drogas sigue siendo necesaria, ZD-1839, como un anticuerpo monoclonal de drogas (una proteína en forma), y al igual que con cualquier otra droga terapias, fue decepcionante, lo que demuestra la necesidad de que el desarrollo de nuevas tecnologías y eficaz [ 14].

Otros nuevos productos basados en el ADN y el ARN corto también están actualmente en desarrollo. Estos incluyen LY900003 (Affinitac ™), la OST-774 (Tarceva ™) y trastuzumab (Herceptin). LY900003 es un oligonucleótido antisentido, conocido para modificar la expresión de genes por la interacción con el ARNm involucrados en la producción de proteínas específicas de la enfermedad [15]. Sin embargo, las terapias antisentido tienen deficiencias en la especificidad y coherencia.

RNA de interferencia (RNAi) es un conservadas evolutivamente proceso en el que el reconocimiento de la doble-stranded RNA (dsRNA) posttranscriptional en última instancia conduce a la supresión de la expresión génica. Esta supresión es mediada por corto doble varados RNA (dsRNA), también llamado interferencia de ARN pequeñas (ARNsi), que induce la degradación de ARNm específicos complementarios a través de la base que se aparea. En varios sistemas modelo, es decir,.: La mayoría de orden inferior de animales, esta respuesta natural se ha convertido en una herramienta de gran alcance para la investigación de la función de genes [16, 17]. Más recientemente se descubrió que la introducción de síntesis de nucleótidos dsRNA 21-duplex en células de mamífero podría silenciar la expresión de genes de manera eficiente. Aunque el mecanismo exacto todavía no está claro, RNAi ofrece una nueva manera de inactivar los genes de interés. En comparación con las tecnologías tradicionales knockout antisentido, que proporciona un posible nuevo planteamiento para la modulación de la función de genes cancerígenos en las células del cáncer [18]. En este estudio, se determinó la posibilidad de si podría RNAi silencio gen EGFR de uso común en líneas celulares de cáncer de CPNM, A549 y SPC-A1. También evaluaron el grado de silenciamiento de genes EGFR y su resultado funcional en términos de efectos sobre la proliferación celular y la inhibición del crecimiento in vitro e in vivo. Nuestros resultados sugieren que la RNAi mediada por silenciamiento de EGFR puede proporcionar una oportunidad para desarrollar una nueva estrategia de tratamiento para CPNM.

Materiales y métodos
Líneas celulares y cultivo celular

A549 y SPC-A1 están bien caracterizados humanos CPNM líneas celulares, obtenidas a partir de la instalación de recogida de células chino (Shenergy Biocolor Biológica Ciencias y Tecnología de la compañía, Shanghai, China). Las células fueron cultivadas en forma rutinaria Dulbecco modificada de Eagle's Medium (MEDM, Gibco, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (HyClone, EE.UU.) humidificado en una atmósfera de 5% CO 2 a 37 ° C.

DsRNA preparación

SiRNAs correspondiente al EGFR mRNA con dTdT en 3'-domina fueron diseñadas y sintetizadas químicamente de acuerdo a la recomendación del fabricante (Dharmacon Research, EE.UU.) [19]. Las siguientes secuencias fueron realizados con éxito: ARNsi-EGFR sentido 5'-GGAGCUGCCCAUGAGAAAUdTdT-3 'y antisentido 5'-AUUUCUCAUG GGCAGCUCCdTdT-3'. El no vinculados dsRNAs inespecíficos como control fueron diseñados como texto siguiente: sentido 5'-GAACUUCAGGGUCAGCUUG CCdTdT-3 'y antisentido 5'-GGCAAGCUGACCCUGAAGUUCdTdT-3'. Capítulo único sentido y antisentido secuencias fueron recocidos en dsRNA siguiente las instrucciones del fabricante. El recocidos dsRNAs se confirmaron en un 15% PAGE electroforesis en gel.

In vitro de transfección

Transfección de dsRNA se realizó con el reactivo comercial, Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.) a los 6 y placas siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, el día antes de transfección, confluente capas de células se trypsinized, contados y resuspendido. Suspensión de 1 × 10 5 de las células fue chapada en cada pocillo de la 6-así placas, de manera que podría convertirse en alrededor del 70% confluencia día siguiente en el momento de la transfección. La formulación de la mezcla continuación a temperatura ambiente y se aplicó 25 minutos más tarde en un volumen final de 2 ml por pocillo. Las células fueron incubadas durante otros 48 h. El número de células se determinó utilizando un hemocitómetro antes de los posteriores ensayos.

Evaluación de los números de EGFR

El número de EGFR en las dos líneas celulares fueron determinados por un ensayo inmuno-fluorescencia como en el informe anterior [20]. Las células fueron cosechadas por trypsinization, lavados dos veces con 1 × PBS, y se incubaron con ratón anti-EGFR anticuerpos monoclonales (mAb), (generosamente donado por el Instituto de Shanghai de Biología Celular, Academia China de Ciencias) durante 1 h a 37 ° C . Las células fueron lavadas y teñidas con FITC-conjugado de conejo anti-ratón de anticuerpos (Anticuerpos de diagnóstico Inc, Shanghai) y dejó para la incubación en la oscuridad. Después de 45 minutos, las células fueron lavadas dos veces y subsquently fija en 0,5 ml de 4% para-formaldehído. Las células teñidas se analizaron por microscopía fluorescente o en una Becton Dickinson FACScan con excitación y de emisión en la configuración de 488 nm y 530 nm, respectivamente. El número de EGFR en las células NSCLC finalmente se calcula como el porcentaje de células positivas × intensidad media de fluorescencia.

ARN aislamiento y síntesis de ADN complementario

ARN total fue extraído a partir de células pellets utilizando Trizol reactivo según las instrucciones del fabricante (Gibco BRL, Canadá) y disuelta en buffer TE. Total RNA se cuantificó con un espectrofotómetro (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Para librarse de la posible contaminación por el ADN genómico, el total de ARN, fue tratada con DNasa I (Invitrogen, EE.UU.) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por adición de 25 mM EDTA y calentada a 65 ° C durante 10 min seguido de 95 ° C durante 5 min. Para complementarias de ADN (cDNA) de síntesis, 400 ng de ARN total fue transcrito con cDNA transcripción utilizando reactivos 0,8 μ g de la oligo (dT) 18 primer para su posterior cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Cuantitativas de PCR transcriptasa inversa -

Esto se realizó utilizando un ABI Prism 7700 sistema de detección de secuencias (Applied Biosystems), como se describe anteriormente [21]. Primers y sondas TaqMan fueron diseñados utilizando el Primer Express TM 1.0 (Applied Biosystems) de software para amplificar aproximadamente 150 pares de bases de las secuencias. Sondas fueron etiquetados a los 5 'finales con el reportero molécula colorante FAM (6-carboxi-fluoresceína) y en el extremo 3' con tinte quencher molécula TAMARA (6-carboxytetramethyl-rodamina). Real-time PCR se realizaron en un volumen total de 50 μ l con 1 × TaqMan Master Mix (Applied Biosystems) y en 300 nM primers y sondas a 200 nM. Primer secuencias son las siguientes: en primer gen EGFR adelante, 5 '-CGAGGGCAAATACAGCTTTG -3'; atrás ejemplo, 5'-CCTTCGCACTTCTTACACTTG -3 '; sonda 5'FAM-ACGCCGTCTTCCTCCATCTCATA GC-TAMRA3'. Termociclador parámetros incluyen un ciclo a 94 ° C por 2 min, y 45 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 10 s recocido a 53 ° C durante 30 s y extensión a 72 ° C durante 40 s, seguida de una última prórroga a 72 ° C durante 10 min. La cantidad relativa de EGFR cDNA de cada muestra se calculará dividiendo el valor T C con el correspondiente valor de la limpieza de genes glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Se incluyeron controles negativos en cada prueba para asegurar los reactivos son libres de contaminación.

Formadoras de colonias de ensayo

El número de colonias se determinó como se describe anteriormente [21]. En pocas palabras, después de transfección con dsRNA y diversos controles, las células fueron trypsinized, contados, y la semilla para la formación de la colonia de ensayo en 60 mm platos a 300 células por plato. Después de una incubación de 14 días, las colonias se tiñeron con cristal violeta y el número de células positivas se cuentan. Colonias que contienen más de 50 células fueron anotadas, y triplica contienen 10-150 colonias / plato fueron contados en cada tratamiento.

Scratch ensayo

Esto se realizó a lo descrito previamente [22]. Las células fueron sembradas por triplicado en el colágeno IV de 60 mm con revestimiento de cultivo de tejidos platos en el 1 × 10 5 células / plato. Un cero a través del eje central de la placa se hizo suavemente usando una pipeta de punta 4 h después de las células fueron transfectadas con dsRNA específicos o diversos controles. La migración de las células a los cero, se observó a dos puntos de tiempo de 24 horas y 48 h.

Chemo-sensibilidad de ensayo

Esto se realizó como se describió anteriormente [23]. En pocas palabras, después de transfección con dsRNA específicos o diversos controles a los 6 y 24 h para las placas, las células fueron trypsinized, sin semillas y así en 96 placas. Las células fueron, la noche a la mañana después de la cultura, expuestos a la creciente concentración de cisplatino varía de 0 a 50 ng / ml para los otros 24 h. MTT, de 20 μ l (1 mg / ml) se añadió a cada pocillo durante 4 horas a 37 ° C para permitir MTT formazan para formar cristales por reaccionar con células metabólicamente activas. Posteriormente, la formazan cristales fueron solubilizados por 150 μ l de DMSO. La absorbancia de cada pozo se midió en un lector de microplacas a 490 nm (A 490). El porcentaje de crecimiento de las células se calculó por comparación de la A 490 lectura específica de las células transfectadas dsRNA versus control transfectadas las células.

La inhibición del crecimiento tumoral en ratones nude athymic

Athymic ratones nude (3-4 semanas de edad de sexo masculino) fueron obtenidos de Shanghai Instituto de Biología Celular, Academia China de Ciencias, mantenido en condiciones asépticas y cuidadas, de conformidad con las directrices institucionales. Luego fueron asignados al azar en cinco grupos de 6 ratones por grupo: es decir.: Control negativo, control positivo, control reactivo de transfección, que no guardan relación dsRNA control, y dsRNA grupo específico de EGFR (dsRNA-EGFR). Después de enchapado en 10 cm y la placa de transfección in vitro, las células SPC-A1 (~ 1 x 10 6) de 50 μ l de PBS fueron inyectados sc. En el flanco izquierdo de la zona de ratones. Un volumen igual de PBS se inyecta en grupo control negativo. Tumor volúmenes fueron determinadas por medición directa con calibradores y calculado utilizando la fórmula π / 6 × (diámetro mayor) x (de pequeño diámetro). Xenoinjertos de tumores humanos se les permitió crecer hasta un tamaño de 10 mm × 10 mm antes de los ratones fueron sacrificados y eliminados los tumores y pesado.

Análisis estadístico

El silenciamiento de los efectos sobre dsRNA EGFR en el crecimiento celular, la formación de colonias, la migración celular y el crecimiento tumoral in vivo fueron analizados por la prueba t de estudiantes. Las diferencias se consideraron significativas a P <0,05. SPSS10.0 software fue utilizado para realizar el análisis estadístico. En experimentos para probar la quimio-sensibilidad que participan múltiples dosis de cisplatino, el modelo lineal cuadrático fue equipado con software de origen 6,0.

ResultsSignificant baja regulación de la expresión génica con EGFR ARNsi específicas de EGFR

Única varados ARN sintético fueron recocidos en primer lugar para formar dsRNA y luego transfección transitoria en líneas celulares tumorales. Cuarenta y ocho horas después de transfección, la expresión del EGFR se examinó. El etiquetado fluorescente inmune ensayo demostró que el número de la EGFR en la membrana celular y, concretamente, fue significativamente inhibida por la transfección de dsRNA específicas para EGFR, pero no por no vinculados dsRNA (Fig. 1A c-d], ni por el control reactivo de transfección Y control negativo (sin un mAb, Fig. 1A a-b]. El número de la EGFR evaluado por un citometría de flujo fue también de acuerdo con el ensayo inmunológico en el que dsRNA-EGFR EGFR reducido drásticamente a los niveles de expresión de genes que son 71,31% y 71,78% menos que los observados en los grupos control (P <0,001) . No hubo diferencias en la intensidad de fluorescencia en los grupos de control, es decir: tanto de la transfección de reactivos de control, así como no vinculados dsRNA grupo, no mostraron ninguna reducción significativa (P> 0,05) (Fig. 1B y 1C], lo que sugiere La reducción de la proteína EGFR fue significativa y específica.

Más análisis molecular reveló que la baja regulación de la expresión EGFR fue el resultado de una marcada disminución de la actividad transcripcional de EGFR. Como se muestra en la Fig. 1E, EGFR mRNA específicos se establecen firmemente regulado por 37,04% y el 54,92% en el A549 y SPA-A1 células tratadas con dsRNA-EGFR (P <0,01). Como se preveía, la transcripción ARNm no se inhibió en grupos (P> 0,05).

DsRNA específicas para EGFR también inhibe el crecimiento de células tumorales

Para investigar el efecto de la funcional en la regulación de la expresión EGFR, hemos realizado dos experimentos, uno fue un ensayo de células y otro, formando una colonia de ensayo. Células resultados mostraron una disminución significativa del número de células por 85,0% en el A549 y el 78,3% en RCP-A1 (P <0.001) (Figura 2A] cuando transfectadas con dsRNA-EGFR. En comparación, el número de células en el control de los grupos es alto y constante en los dos tipos de células.

Los resultados del ensayo son formadoras de colonias de acuerdo con las de células. Una disminución significativa en el número de colonias por el 63,3% en el A549 y el 66,8% en RCP-A1 fue evidente cuando las células fueron transfectadas con dsRNA-EGFR. En cambio, las células de los grupos de control mostró poca disminución en el número de colonias. Estos resultados sugieren la transfección de células con CPNM dsRNA-EGFR provocado un dramático crecimiento de la inhibición de las células del tumor (P <0.001) (Figura 2B].

DsRNA específicas para EGFR retrasado la migración de CPNM

Para determinar si el silenciamiento génico afectado a la capacidad del A549 y SPC-A1 células a migrar, un rasguño ensayo fue realizado por la introducción de un rasguño en la monocapa de células cultivadas en placas de colágeno IV revestidos. Los resultados fueron evaluados cuantitativamente a las 24 h y 48 h, y demostró que las células transfectadas con CPNM dsRNA-EGFR tenido una muy baja movilidad en ambos puntos temporales, lo que supone un retraso en la migración de más de 80% (Fig. 3] (P <0.01) . Los resultados mostraron que dsRNA-EGFR células transfectadas casi había perdido la capacidad de migrar, por lo tanto, lo que sugiere que ARNsi tenía el potencial de reducir la invasión de CPNM, por lo tanto, el bloqueo de la migración y las metástasis de los tumores NSCLC.

DsRNA sensibilizado CPNM células quimio-agente terapéutico cisplatino

Para probar qué efecto tendría sobre RNAi la sensibilidad de las células NSCLC a un agente quimioterapéutico, hemos diseñado un experimento para examinar los cambios de sensibilidad a cisplatino antes y después de transfección con dsRNA. El cisplatino es un agente químico de uso común clínicamente. El experimento se realizó mediante el examen de las células' viabilidad utilizando un ensayo de MTT. Como se muestra en la Fig. 4, se demostró que las células transfectadas con dsRNA-EGFR son más sensibles a cisplatino que diversos grupos de control. Más importante aún, sensitizating este efecto fue dependiente de la dosis, que muestra una correlación significativa con la inhibición de crecimiento de dosis de cisplatino utilizado. Cuando los datos se analizaron sobre la base del valor de IC 50 utilizando software de origen 6,0, hemos demostrado que la transfección de dsRNA-EGFR aumento de la sensibilidad de los A549 y SPC-A1 a cisplatino por cuatro y siete veces, respectivamente.

DsRNA específicas para EGFR inhibe el crecimiento tumoral in vivo

Evidentemente, sería más pertinente para el desarrollo de un protocolo terapéutico si pudiéramos demostrar que transfección de ARNsi podría causar la inhibición del crecimiento in vivo. En este experimento, se determinó la posibilidad de usar un ratón modelo de xenoinjertos de tumores humanos. SPC-A1 Humanos de las células fueron seleccionadas para el experimento in vivo, ya que su subcutánea xenoinjertos más rápido que formó A549 (Zhang et al., Datos no publicados). Aproximadamente 1 × 10 6 de SPC-A1 células fueron transfectadas con dsRNA específicas para EGFR o varios controles, y luego se inyecta en el flanco izquierdo de la zona de ratones. Se vigila el crecimiento del tumor y xenoinjertos se permitió que crecen a un tamaño aproximado de 10 mm × 10 mm. Después de los ratones fueron sacrificados, los tumores fueron retirados y pesado. Como se muestra en la Fig. 5, el momento en que los tumores fueron visibles en el control de los grupos es 6-8 días antes de lo que en dsRNA-EGFR transfectadas grupo. Tumores en el simulacro de grupo de control, el control y la transfección de reactivo no vinculados dsRNA transfectadas grupos control fueron de un tamaño similar, todos los cuales tenían un tumor mucho más grande y sólida apariencia rojiza, mientras que los de dsRNA-EGFR transfectadas grupo sigue siendo pequeño y pálido. Cuando los ratones fueron sacrificados y el tamaño de los tumores en comparación, de los tumores EGFR-dsRNA transfectadas grupo mostraron un menor tamaño de 75,06% y el peso de 73,08% (P <0,01), lo que demuestra un efecto inhibitorio del crecimiento vivo.

Uniqe Desarrollo de un sistema de codificación vector lentiviral dsRNA

Sin duda, la utilización in vivo de dsRNA de transferencia de genes a las células tumorales se limitaría dsRNA porque sería rápidamente degradada, una vez emitido en vivo. Además, la eficiencia de dsRNA mediada por la transferencia de genes en los tejidos in vivo sería muy bajo y, por tanto, muy limitada. Para mejorar la entrega de genes para una variedad de células de cáncer in vivo, se desarrolló un nuevo vector lentiviral bovina (Enfermedad de Jembrana Virus, JDV) mediada por la entrega de RNAi. El vector JDV sistema fue desarrollado recientemente en nuestro laboratorio y se ha demostrado eficiente la entrega de genes a una variedad de tipos de células, tanto en la división y la no división de los ciclos [24, 25].

Sobre la base de la columna vertebral JDV, dos de 56 pb que contienen fragmentos de ADN de 19 pb en la EGFP sentido y anti-sentido de la orientación con una horquilla liker fueron sintetizados, en la doble annealled capítulos y clonado en un cassettes descendentes de una polimerasa-III-H1 ARN promotor (PIII). Este promotor dirige la transcripción de la dsADN en dsRNA con bien definidas de inicio del sitio con una señal de terminación que consta de cinco thymidines en una fila. Lo que es más importante, la división de la dsRNA transcripción en el sitio después de la terminación de la segunda uridine, produciendo una transcripción parecido a la final de dsRNA sintéticas.

El nuevo JDV vector de codificación específica para el dsRNA EGFR se llama pjLPIIIRE. Introducción de pjLPIIIRE junto con la construcción de los envases, y la dotación pjPack construir, pCMV-293T en la VSVG células producidas VSV-G pseudotyped JDV vectores. El vector cosechas fueron más concentrado y se titula como se había informado anteriormente [24, 25]. Estos vectores se utilizaron para transductor A549 y SPC-A1 células. En una multiplicidad de infección (MOI), de 10 y 72 horas después de la transducción, RNAi mediada por silenciamiento génico de EGFR fue evidente. Alrededor del 75% de los A549, y el 80% de SPC-A1 se convirtió en células EGFR negativos, lo que demuestra una eficaz RNAi mediada por silenciamiento del gen EGFR. Control de vectores construye de JDV dsRNA una codificación específica para mejorar la proteína verde fluorescente (EGFP) no mostraron un importante efecto inhibitorio en una mayor concentración del vector (MDI, de 15). Sin embargo, en las células que antes se transduced con EGFP gen marcador y expresar la proteína EGFP en aproximadamente el 100% de las células, alrededor del 75% del A549, y el 80% de SPC-A1 células EGFR se convirtió en negativo, un resultado similar al EGFR silenciar. Estos resultados sugieren lentivector mediada RNAi efectos fueron eficientes y específicos y sería una herramienta útil para la entrega de genes in vivo de la terapia.

Discusión

El aumento de EGFR expresión es común en diversos tipos de cáncer. Esto ha correlacionado con la progresión neoplásica de estos tipos de cáncer. El bloqueo de esta vía de señalización EGFR oncogénicos pueden representar una estrategia prometedora para el desarrollo de enfoques selectivos contra el cáncer. Sin embargo, aunque se han hecho considerables progresos en el desarrollo de EGFR orientada por anticuerpos o moléculas pequeñas inhibidores de la tirosina quinasa, los datos de los actuales ensayos clínicos demostraron que existían algunas deficiencias con estos enfoques, a saber, ineficaces y en algunos casos de aparición de resistencia en otros [14]. En un esfuerzo por desarrollar nuevas estrategias para bloquear más de la expresión de EGFR en las células NSCLC, se examinaron las posibilidades de un dsRNA mediada RNAi enfoque específico para silenciar a la EGFR en CPNM líneas celulares in vitro e in vivo. Hemos demostrado una inhibición significativa de la expresión de genes EGFR en los dos A549 y SPC-A1 células. RNAi reducido drásticamente el EGFR transcripción y regulada por la producción de proteínas. Esto, a su vez, se tradujo en una serie de efectos inhibitorios sobre el crecimiento de las células tumorales in vitro e in vivo, con una presencia muy significativa el crecimiento del tumor y retrasar el deterioro en xenoinjertos modelos animales. Nuestros resultados son los primeros que muestran un importante silenciamiento de un gen endógeno de celulares y la inhibición del crecimiento in vivo.

Los datos actuales apoyan la idea de que en células de mamífero, RNAi es superior a antisentido establecen criterios para la regulación de la expresión génica antisentido aunque ha sido ampliamente utilizado [26]. Además, se dsRNA más sensibles, específicos y estable que el ADN o ARN antisentido en parte debido a su dTdT 3'-domina en cada capítulo [27]. Hemos seleccionado a los 21-nt ssRNAs sentido y antisentido dirigidos contra el EGFR de la codificación de las regiones, y añadió dTdT 3'-domina en cada línea de acción para aumentar la estabilidad ARNsi. Nuestros resultados actuales están de acuerdo con los datos de informes de que se tope dsRNA activa y estable [28]. El RNAi efectos que hemos logrado más del doble de los efectos de antisentido que es normalmente alrededor de 30% abajo de la regulación de la expresión génica (datos no publicados).

Se ha sugerido que el grado en que la expresión de una determinada proteína que se inhibió a través de RNAi depende de la vida media y su tasa de síntesis de esa proteína. Debido a su volumen de negocios mucho más rápido, EGFR se consideró que era más difícil de tumbar utilizando RNAi. Esto se debía a que aun cuando la actual listas para usar la proteína fue bloqueado, previamente sintetizado moléculas persisten en la membrana plasmática de un tiempo relativamente largo [29]. No obstante, el hecho de que hemos podido inhibe la expresión de EGFR, así como la función de EGFR en las células NSCLC proporcionado pruebas convincentes de que RNAi es una técnica muy potente. A nuestro entender, estos resultados representan la primera demostración de que la química sintética 21-nt ARNsi fue entregado fácilmente en líneas celulares de NSCLC y eficazmente suprimida la expresión de genes oncogénicos y función.

Experimentales y de los datos clínicos han indicado que más de expresión EGFR correlacionado con diversos procesos críticos en el desarrollo, mantenimiento y difusión de los tumores malignos. [30] La reducción de EGFR puede llevar a un fracaso en señal de cascadas río abajo incluyendo PI3-K, RAS - MAR-MAPK P44/P42, y la vía de la proteína quinasa C, y posteriormente a bloquear la activación de las rutas más directas mitogenesis moduladores de cáncer y otros fenotipos de promover [13]. Inicialmente, debido a la creencia general de que sólo RNAi induce un gen tumbar, en lugar de una completa sacude, no estábamos muy seguros de lo que el resultado funcional se podría lograr derribando EGFR, en su caso. Nuestros resultados fueron más sorprendentes e importantes que, aunque en la transcripción EGFR se redujo sólo en un 50% y la producción de proteínas en un 70%, lo que significa que las células transfectadas se expresa todavía más del 20% de los receptores, estas células muestran, sin embargo, dramática Inhibición del crecimiento en el número de células, y la formación de colonias y significativamente retrasados crecimiento de las células. Estos resultados sugirieron que convincente incluso una supresión incompleta expresión de EGFR fue suficiente para obstaculizar el factor de crecimiento de señalización mediada. Esto fue consistente con la hipótesis de que la activación de la fosforilación de la tirosina respuesta podría estar completamente apagado si el número de EGFR se redujo por debajo de un determinado umbral [31]. Esta noción es muy importante para el desarrollo de una terapia RNAi mediada de CPNM porque una completa inactivación de genes en estas células, que es difícil de lograr, ya no es necesario que sugiere RNAi basado silenciamiento génico se pueden desarrollar en una terapia que podría mitigar las invasividad De las células del cáncer, incluso detener las metástasis.

Hasta ahora, los efectos de EGFR en la quimio-sensibilidad son menos claros y se sugirió que podría ser dependiendo de la particular línea celular o tipos de células o particular, fármacos utilizados para el experimento. Sin embargo, un número creciente de informes ha apoyado la idea de que la activación de la vía de transducción de señal de EGFR podría inducir quimio-resistencia en las células NSCLC [32]. Esto podría servir de justificación para regular el EGFR, por lo tanto, la mejora de chemosensitivity. Una de las drogas más comúnmente usadas se cisplatino, un ADN-perjudicial agente contra el cáncer. Se ha demostrado que el cisplatino modificado la actividad de reparación del ADN en una variedad de diferentes sistemas experimentales [33]. Nuestro estudio encontró que la reducción de EGFR dado lugar a una mayor sensibilidad a la quimioterapia-cisplatino por cuatro veces en células A549 y por siete veces en RCP-A1 células. En estudios anteriores utilizando diferentes inhibidores de los receptores, el grado de EGFR inducida por aumento de la sensibilidad a cisplatino fue sólo en el rango de 2 - 4 - veces. Nuestro siete veces en la mejora SPC-A1 células sugirió que mejor RNAi causado la represión de los EGFR y el aumento de un número significativamente mayor de quimio-sensibilidad que los anteriores enfoques. Esto representaría un significado clínico si se traduce en el establecimiento de clínicas debido a la resistencia a cisplatino puede ser potencialmente superar por este enfoque [34]. La quimio-sensibilización de las células con CPNM dsRNA-EGFR indicó que dsRNA-EGFR es un candidato más fascinante para un mayor desarrollo en un mejor tratamiento. Evidentemente, para el desarrollo de esta estrategia terapéutica para uso clínico, un adecuado sistema de vectores es necesario. Hemos mostrado el nuevo sistema de vector lentiviral era capaz de entrega dsRNA y causó un importante efecto silenciar. Nuestro desarrollo de las especies bovina vector lentiviral sistema para la entrega de dsRNA se beneficiarían del uso de la tecnología in vivo para CPNM. Esperemos que en un futuro próximo, las estrategias basadas en RNAi estarán listos para los ensayos clínicos o preclínicos.

Agradecimientos

Estamos agradecidos por el apoyo de la concesión de la Comisión de Ciencia y Tecnología, Municipio de Shanghai (n 02DJ14027). También damos las gracias a Queensland fondo para la concesión del Cáncer (Q49-02) el apoyo a MW. Expresa también su agradecimiento a los colegas en el laboratorio de terapia génica para el debate y demostrar la lectura del manuscrito.