Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 16-16 (más artículos en esta revista)

Quinolinic ácido selectiva induce la apoptosis de los astrocitos humanos: papel potencial en el complejo demencia del SIDA

BioMed Central
Gilles J Guillemin (G. Guillemin @ cfi.unsw.edu.au) [1], Lily Wang (flowerlily@iinet.net.au) [1], J Bruce Brew (bbrew@stvincents.com.au) [1]
[1] Centro de Inmunología, St Vincent's Hospital, Sydney, Australia
[2] Departamento de Neurología, St Vincent's Hospital, Sydney, Australia
[3] Universidad de Nueva Gales del Sur, Facultad de Medicina, Sydney, Australia

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Resumen

Hay pruebas de que la vía kynurenine (KP), y en particular uno de sus productos finales, ácido quinolinic (QUIN) desempeñar un papel en la patogénesis de varios de los principales neuroinflammatory enfermedades, y más particularmente complejo demencia del SIDA (ADC). QUIN La hipótesis de que pudieran estar implicados en la apoptosis astrocyte porque: 1) apoptosis astrocitos se han observado en los cerebros de pacientes con ADC, 2) ADC pacientes han elevado líquido cefalorraquídeo QUIN concentraciones, y 3) QUIN astrocyte puede inducir la muerte. Cultivos primarios de astrocitos humanos fetal fueron tratados con tres concentraciones de QUIN fisiopatológicos. Numeración de apoptosis se evaluó a través de la doble inmunocitoquímica de expresión de la caspasa 3 y activo núcleo de condensación. Hemos encontrado que el tratamiento de astrocitos humanos con QUIN morfológicos inducidos (disminución cuerpo celular) y cambios bioquímicos (núcleo de condensación y la sobre expresión activa de la caspasa 3) de la apoptosis. Después de 24 horas de tratamiento con QUIN 500 nM y 1200 nM respectivamente el 10 y el 14% de los astrocitos fueron sometidos a la apoptosis. Esto se habrá de dar lugar a una relativa falta de apoyo factores tróficos con la consiguiente disfunción neuronal y, posiblemente, la muerte. Astroglial la apoptosis inducida por el QUIN proporciona otro posible mecanismo para la neurotoxicidad de QUIN durante ADC.

Apreciación

El kynurenine pathway (KP) es una vía principal de L-triptófano catabolismo, lo que resulta en la producción de nicotinamida adenina dinucleotide y otros neuroactive intermedias [1]. De los metabolitos, la N-metil-D-aspartato (NMDA) y agonista de los receptores de ácido quinolinic neurotoxina (QUIN) es probable que sea uno de los más importantes. Hay pruebas de que QUIN participa en la neurocytotoxicity asociada con varias de las principales enfermedades inflamatorias del cerebro [2, 3] como complejo demencia del SIDA (ADC) [4, 5] y otras infecciones virales del cerebro [2]. En el sistema nervioso central (SNC), astrocitos desempeñan funciones esenciales incluyendo la homeostasis metabólica neurotrófico en particular proporcionando apoyo, de desintoxicación, el mantenimiento de la barrera hematoencefálica y de la respuesta inmune. Durante el cerebro la inflamación asociados a la ADC, muchos mediadores son liberados y astrocitos se activan con miras a su celular hipertrofia y / o la proliferación [6]. Para algunos astrocitos, esta activación prolongada puede inducir la apoptosis y la muerte de estos astrocitos reactivos pueden directa o indirectamente afectan a las funciones y la supervivencia de las neuronas y astrocitos vecinos [7]. Las consecuencias de astrocyte apoptosis podría ser neuroprotector [8] o neurodamaging [7, 9]. Apoptosis de los astrocitos se ha descrito en el cerebro de pacientes con ADC [10 - 12]. Además, en ambos ADC parénquima cerebral y líquido cefalorraquídeo (LCR) de las concentraciones son muy elevadas QUIN [4, 5, 13], respectivamente, 300 y 100 veces en comparación con los controles. El VIH-1 y las proteínas Nef Tat inducir a los macrófagos para producir QUIN [14]. La asociación entre la apoptosis de las células del cerebro y el aumento de los niveles de QUIN se han encontrado en otras enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, la hipótesis de que QUIN podría vincularse con astrocyte apoptosis.

Hemos utilizado cultivos primarios de astrocitos humanos fetal tratada con tres fisiopatológicos QUIN, respectivamente, las concentraciones de 350, 500 y 1200 nM (similares a los de ADC parénquima cerebral de los pacientes [15]] y se evaluó la apoptosis con ellos para inmunocitoquímica. Se encontró que el 99% de las células GFAP positivas (manchas verdes, Fig. 1, la columna de la izquierda) que demuestra la gran pureza de los cultivos primarios de astrocitos humanos. No se detectó tinción para CD68, MAP2, el factor VIII o 5B5 (datos no incluidos). Apoptosis comenzó a ser detectada después de sólo 6 horas (datos no presentados). Apoptosis astrocitos mostró una morfología atípica con un cuerpo disminuido y los procesos anormales. Además, la mayoría de estas células están en proceso de separarse de la cultura matraz. Estas células apoptóticas se puede divisar por su condensada y muy brillante núcleo con la DAPI (cian tinción, Fig. 1]. Todas estas células también muestran un fuerte citoplásmica y tinción perinuclear de la anti-activa la caspasa-3 (tinción de rojo, Fig. 1, columna de la derecha). El porcentaje de células apoptóticas se calculó después de 24 horas de tratamiento (tal y como se describe en la sección metodológica a continuación) (Fig. 2]. Después de 24 horas, el porcentaje de células apoptóticas en cycloheximide tratados con diapositivas se aumentó 5 veces, mientras que en QUIN 350, y 500 QUIN QUIN 1200 nM tratados con diapositivas que fueron, respectivamente, el aumento de un 2,2, 4,2 y 5,6 veces en comparación con la base de referencia. El p-valores entre los cycloheximide tratados con diapositivas y los QUIN 500 y 1200 nM tratados con diapositivas no fueron de 24 horas, pero fueron significativas entre los tratados de control de diapositivas y transparencias, con excepción de QUIN 350 nM (ver Fig. 2 leyenda).

Este estudio demostró que los tratamientos con QUIN fisiopatológicos en concentraciones inducido cambios morfológicos y bioquímicos de la apoptosis en un subgrupo de astrocitos humanos en una forma dependiente de dosis. Algunas cuestiones pueden ser planteadas en el plazo de las posibles limitaciones de nuestros experimental in vitro resultados. En primer lugar, hay dos subtipos conocidos de astrocitos [16], pero sólo type1 astrocitos pueden ser cultivadas en los cultivos primarios obtenidos por la aplicación de este método [17]. Las diferencias entre estos subtipos no se conocen bien y es posible que pueden tener una sensibilidad diferente a QUIN. En segundo lugar, se puede argumentar que fetales y adultos astrocitos pueden tener una sensibilidad diferente a QUIN. Esto es poco probable, ya que anteriormente mostraron el alto grado de similitud entre astrocitos inmaduros y maduros [18, 19]. Además, en ADC cerebro altos niveles de QUIN [15] están asociados con una alta tasa de apoptosis de los astrocitos adultos [10]. Por último, el escaso número de astrocitos apoptosis (<15%) implica que sólo un subconjunto de astrocitos QUIN es susceptible a la toxicidad. Los receptores y vías de señalización que astroglial iniciar la apoptosis no ha sido identificar aún. Sin embargo, dos principales mecanismos pueden ser potencialmente afectados. La primera es la activación de los receptores NMDA por QUIN [4], que ya es conocida para mediar en la apoptosis neuronal con activación de la caspasa-3 [20 - 23]. Sin embargo, la presencia de los receptores NMDA en astrocitos es muy controvertida [24, 25]. La misma vía pueden intervenir en neuronas y astrocitos, pero la presencia funcional de los receptores NMDA en astrocitos todavía tiene que ser demostrado. La segunda posibilidad, que representan otro aspecto importante de QUIN toxicidad, es la peroxidación lipídica [26]. QUIN en concentración tan baja como 120 nM induce la peroxidación lipídica y la formación de radicales libres conducen a la muerte neuronal [27]. Este segundo mecanismo es más probable que participen astrocyte la apoptosis inducida por el QUIN.

Curiosamente, nuestros resultados in vitro de la toxicidad en humanos QUIN astrocitos se correlacionan bien con anteriores estudios in vivo con modelos animales. Después de QUIN inyección en el cerebro de rata, una reducción de la densidad de GFAP-inmunoreactividad de astrocitos ocurre más temprano (dentro de las 6 horas de la inyección) sugiriendo astrocytic muerte, que podría estar asociado con necrosis en vez de la apoptosis [28, 29]. Otro estudio in vivo utilizando fetos derivados de ovejas y dañadas por la hipoxia y la hipoglucemia mostraron un incremento significativo en la concentración de QUIN asociados con reducción de la GFA en el cerebro fetal [30]. Sin embargo, si QUIN es capaz de inducir astrogliosis y / o astrocytosis aún es motivo de controversia [28, 29]. QUIN puede aumentar la inflamación local al inducir la producción de citocinas y quimiocinas por astrocitos humanos [18]. QUIN neuronal aumenta la liberación de glutamato e inhibe su absorción por los astrocitos, que se llegue a una concentración excesiva de glutamato en el microambiente neuronal y en segundo lugar a neurotoxicidad [9].

Todavía es la activación astroglial debatido si es beneficioso o perjudicial para las neuronas [7]. Para algunos astrocitos, la activación de este dará lugar a una temprana muerte celular, como se mostró aquí con QUIN. Esto puede ser parte de un mecanismo neuroprotector selectiva porque, por un lado, reactiva astrocitos pueden contribuir a la disminución de la función neurológica a través de distintos mecanismos [8]. Por otro lado, la pérdida de astrocitos compromisos a sus efectos benéficos sobre la función neuronal y la supervivencia [31]. Los resultados de este estudio son relevantes porque biológicamente apoptosis de las células del cerebro (neuronas y astrocitos incluidos) y el aumento de los niveles de QUIN se han encontrado asociados en diversas enfermedades neurodegenerativas y trastornos cerebrales como la ADC [10], la enfermedad de Alzheimer [32, 33], cerebral Paludismo [34], y la lesión cerebral traumática [35].

Una gran mayoría de los in vivo o ex vivo astrocyte estudios relativos a la apoptosis están relacionados con la infección por el VIH y el cerebro ADC [12]. Thompson et al. [10] encontró que existe una correlación entre el aumento del número de ADN del VIH-positivas astrocitos y un mayor número de apoptosis astrocyte y rápida progresión de los pacientes con demencia. Además, QUIN producción está directamente relacionada con la carga viral en los pacientes con ADC [36]. Hay fuertes indicios de que este producto se asocia con activación de los receptores NMDA [37, 38]. Hemos demostrado que el VIH-1 y las proteínas Nef Tat conducir a la producción de altos niveles de QUIN por macrófagos humanos [14]; QUIN que la inhibición de la producción de infectados por VIH-1 neurotoxicidad reduce fuertemente los macrófagos [39] y, por último, que puede amplificar QUIN Neuroinflammation y aumentar astroglial expresión del VIH-1 co-receptores [18]. Curiosamente, la inducción de la IDO viral en macrófagos humanos varía de acuerdo al particular aislados del VIH-1 [40] y de manera similar diversos primaria del VIH-1 aislados tienen diferentes efectos sobre la astrocyte apoptosis [11]. El presente estudio proporciona un vínculo directo entre la astrocyte apoptosis y los altos niveles de QUIN ADC en el cerebro. Estos datos proporcionan un nuevo mecanismo por el que el VIH-1 pueden participar en la apoptosis astrocyte directa e indirectamente a través de la producción QUIN. La caracterización molecular de las vías conducentes a QUIN astrocyte apoptosis inducida tiene el potencial para el desarrollo de agentes que reducen la gliales y de la muerte neuronal relacionada con QUIN-toxicidad. El desarrollo de agentes farmacológicos específicos dirigidos KP enzimas fue examinado recientemente [41].

Todos los medios de cultivo de células y aditivos eran de Invitrogen (Melbourne, VIC, Australia), salvo indicación en contrario. QUIN, DAPI, cycloheximide se obtuvo de Sigma-Aldrich Chemical Co (Sydney, NSW, Australia). Anti-activa la caspasa-3 de anticuerpos (policlonales) fue de BD Pharmingen. Mouse mAb anti-GFAP (clon GA-5) se obtuvo de Novacostra (Newcastle, Inglaterra). Secundario de cabra anti-ratón IgG y anti-conejo Alexa 488 (verde) o Alexa 594 (rojo) conjugado anticuerpos fueron comprados a Molecular Probes (Eugene, OR, EE.UU.). Todos los comerciales de anticuerpos fueron utilizados en las concentraciones recomendadas por el fabricante. Fetal cerebros humanos se obtuvieron de 16 a 19 semanas de edad fetos recogidos consentimiento informado. Astrocitos se prepararon utilizando un protocolo adaptado de los métodos descritos anteriormente [17]. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado en todo. Inicialmente, las células fueron incubadas en suero libre de AIM-V. El control negativo células fueron incubadas en AIM-V. El grupo QUIN se incubaron en 350, 500 y 1200 nM en QUIN AIM-V. El control positivo células fueron incubadas en cycloheximide (20 μ g / ml) [42] en AIM-V. Dosis-respuesta y tiempo (3, 6, 12, 24, 48, 72 horas) se han hecho para QUIN y cycloheximide (datos no presentados). El tiempo óptimo de incubación es de 24 horas para la detección activa de la caspasa 3. QUIN concentraciones entre 350 nM a 1200 nM se sabe que se encuentran en los pacientes con ADC [15]. La caracterización de células de cerebro humano utilizando inmunocitoquímica fue descrito previamente [17]. Los tres siguientes se realizaron controles de etiquetado para cada experimento: 1) isotypic controles de anticuerpos, 2) de incubación con sólo la secundaria anticuerpos etiquetados, y 3) la estimación de las auto-fluorescencia de células no etiquetados. El conteo celular se realizó en un ciego. El conjunto de controles y tratados fueron contados cámara de diapositivas. La enumeración de cada una de las diapositivas fue revisado por el experimentador células y clasificados de acuerdo al siguiente programa: DAPI para el número total de células, GFAP inmunoreactividad para astrocitos, y activa la caspasa 3 inmunoreactividad junto con DAPI de apoptosis. Los experimentos se realizaron por triplicado utilizando células cerebrales a partir de tres diferentes tejidos del cerebro. Valores medios y errores estándar se calcularon para cada tratamiento y los resultados se trazarán en un histograma (Fig. 2]. Unpaired t se realizaron pruebas sobre los resultados obtenidos a las 24 horas. La prueba t de Student se utilizó para analizar la significación de las diferencias entre pares de los tres tratamientos. Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativa.

Lista de abreviaturas

Complejo demencia del SIDA (ADC), líquido cefalorraquídeo (LCR), 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), Glial proteína fibrilar ácido (GFA), el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), kynurenine pathway (KP), NMDA ( N-metil-D-aspartato), Quinolinic ácido (QUIN).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

GG era responsable de la concepción y planificación de los experimentos, por la realización de la inmuno estudio y para la escritura del manuscrito. LW fue la creciente cultivos primarios de astrocitos humanos y que los diversos tratamientos. BJB contribuido a la interpretación de los resultados, discusión y redacción del manuscrito.

Agradecimientos

La Clínica San Vicente de la Fundación, la Fundación Alzheimer de Australia, el Consejo Nacional de Salud e Investigaciones Médicas, el Departamento de Salud de Nueva Gales del Sur y la Universidad de Nueva Gales del Sur han apoyado este trabajo. Agradecemos a la Sra Belinda Creighton (UNSW) para el asesoramiento y la alícuota de la lucha contra la caspasa 3 pAb.