Malaria Journal, 2005; 4: 26-26 (más artículos en esta revista)

El análisis molecular de dos brotes locales de la malaria por Plasmodium falciparum en la costa de la Guayana Francesa confirma la msp1 B-K1 / varD genotipo asociación con malaria grave

BioMed Central
Eric Legrand (elegrand@pasteur-cayenne.fr) [1], Beatrice Volney (bvolney@pasteur-cayenne.fr) [1], Anne Lavergne (alavergne@pasteur-cayenne.fr) [1], Caroline Tournegros (cnrcp @ Pasteur-cayenne.fr) [1], Loïc Florent (cnrcp@pasteur-cayenne.fr) [1], Doris Accrombessi (cnrcp@pasteur-cayenne.fr) [1], Micheline Guillotte () [mguillot@pasteur.fr 2], Odile Mercereau-Puijalon (omp@pasteur.fr) [2], Philippe Esterre (pesterre@pasteur-cayenne.fr) [1]
[1] Centre National de Référence sur la Chimiorésistance du Paludisme dans la région Antillas - Guayana, el Instituto Pasteur de la Guyane, BP 6010, F-97306 Cayenne-Cedex, Francia
[2] Unité d'Immunologie Moléculaire des Parasites, Unité de Recherche Associée 2581 du Centre National de la Recherche Scientifique, Institut Pasteur, Paris, France

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Resumen
Antecedentes

Plasmodium falciparum brotes pueden ocurrir en la zona costera de la Guayana Francesa, donde la población es esencialmente no-inmune. Dos brotes esporádicos se observó, uno de ellos con graves casos de malaria. Para caracterizar estos brotes y verificar observaciones anteriores de las características específicas de genotipo en el paludismo grave en la materia, todos los casos de cada brote se estudiaron.

Métodos

P. falciparum genotipos para seis loci genéticos se determinó mediante amplificación por PCR de sangre periférica parásitos. El msp1 / block2 y msp2 genotipos fueron determinados por la secuencia de ADN. VarD genotipado de microsatélites y se basa en el tamaño y polimorfismo locus específicos de la amplificación.

Resultados

El brote en graves casos de malaria se asoció con un solo genotipo. El otro leve brote de malaria se debe a por lo menos cinco distintos genotipos.

Conclusión

Dos tipos distintos de los brotes se produjeron a pesar de sistemático y sostenido despliegue de las medidas de control de la malaria, lo que indica una necesidad de reforzar la vigilancia. El varD / B-K1 msp1 vinculación y su asociación con malaria grave en este ámbito se confirmó.

Antecedentes

La incidencia anual de la malaria en la Guayana Francesa se ha multiplicado por diez en los últimos 30 años, alcanzando hoy en día aproximadamente el 3%, con un 60%, debido a Plasmodium falciparum y el 40% debido a Plasmodium vivax. Francés Guayana es una zona con resistencia múltiple a p. Falciparum malaria. La transmisión se produce en focos aislados de asentamiento ubicado en los bolsillos dentro de la selva amazónica ya lo largo de los ríos. Las principales áreas donde la malaria es endémica se encuentran a lo largo de los ríos Maroni y Oyapock, que sirven como fronteras naturales con Surinam y Brasil, respectivamente [1]. Como resultado de tres meses las campañas de fumigación de insecticidas, casi no hay casos de malaria a lo largo de la costa, donde el 80% de la población reside. Sin embargo, los brotes, que generalmente son de corta duración y afecta a un pequeño número de pacientes, en ocasiones se informó en la zona costera.

El p. Parásito Plasmodium falciparum población de la Guayana Francesa presenta un notablemente bajo grado de polimorfismo, con una estructura tipo clonal [2]. El parásito diversidad es tan restringido que la circulación de determinados genotipos se podía seguir en la zona, lo que permite investigar el impacto clínico de los genotipos específicos parásito. Un análisis comparativo de las características genéticas del parásito en los aislamientos de leve y grave de malaria pacientes ha puesto de manifiesto un importante desequilibrio entre un vínculo particular msp1 / block2 alelo que se llama B-K1 var y un gen llamado varD en los aislados de pacientes con graves p. Falciparum malaria [3].

Para verificar esta asociación y comprender mejor la posible causa de los brotes locales en la zona costera situada lejos de los principales sitios endémicos, dos p. Falciparum brotes fueron estudiados, uno con cinco casos, entre ellos dos casos de paludismo grave y una muerte, y el otro con nueve casos de malaria leve. Los aislamientos de cada uno de los casos se caracteriza por dos brotes utilizando un período de seis locus genotipo enfoque, incluyendo varD, msp1 / block2, msp2 [2 - 7], así como tres loci microsatélite [8].

Métodos
Parásitos aislados y la información del paciente

Los brotes ocurridos en Macouria y Matoury, ambos localizados en la costa de la Guyana Francesa, con una zona inestable, de baja transmisión, fuera de las principales zonas endémicas a lo largo de la Maroni y Oyapock (Fig. 1]. El aeropuerto internacional cercano a Cayenne, el principal de la ciudad, es en Matoury. Los aislamientos fueron obtenidos de pacientes con p. Falciparum malaria en centros de salud y se enviará al laboratorio de rutina fenotipificación sensibilidad a los medicamentos y el análisis de genotipos. La política de los servicios de control de la malaria es obtener un perfil de sensibilidad in vitro para cada diagnosticados p. Falciparum malaria caso. Con este fin, una muestra de 5 ml de sangre fue sistemáticamente recogidas por venopunción en tubos de EDTA y mantenido a 4 ° C durante el envío al laboratorio. Las muestras fueron inmediatamente procesadas para ensayos de susceptibilidad in vitro y una alícuota de 0,5 mL fue congelado a -20 ° C para su posterior preparación de ADN. Los cinco Macouria aislamientos fueron recolectados en junio y julio de 2001, tres leves (E57, E64 y E72) y de dos casos graves (E61, un caso fatal, y E62). E57 paciente había visitado la región endémica Macapa en Brasil un mes antes del ataque de paludismo. Los otros cuatro pacientes Macouria no informaron de haber abandonado la zona. Los nueve Matoury aislados, recogidos entre febrero y junio de 2002 se originó de los casos de malaria leve, ninguno de los cuales informó de una reciente visita a un área endémica.

Extracción de ADN y genotipado

Se extrajo el ADN, tal como se describe [4]. La genotipificación se realizó mediante PCR utilizando los primers enumerados en la Figura 2. Por msp1 block2, msp2 y varD, la PCR se realizó en un 50 μ l volumen final que contiene la plantilla de la DNA, 1,5 mM de MgCl 2, 2 μ M de cada primer, 200 μ M dNTPs, y 1,5 unidades de AmpliTaq Gold polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las condiciones de PCR para msp1 block2 y msp2 fueron: un ciclo a 95 ° C durante 5 min, seguido por 40 ciclos a 94 ° C por 1 min, 56 ° C durante 2 min, 72 ° C por 2 min, y la última prórroga a 72 ° C durante 10 min. El varD condiciones de PCR fueron: un ciclo a 94 ° C durante 5 min, seguido por 35 ciclos a 94 ° C por 10 seg, 61 ° C durante 1 min 30 seg, 72 ° C por 2 min, y un ciclo de 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa y directamente secuenciado (Qbiogen, Cada, Francia). Secuencias fueron alineadas utilizando el programa Clustal W, seguida de análisis manual usando el editor de la ED DEBE paquete [9].

Microsatélite escribir se hizo utilizando el C1M4, C3M27 y C4M69 loci, que se encuentra en los cromosomas 1, 3 y 4, respectivamente. El locus primers específicos descrita por Su et al. [8] se utilizaron (véase la figura 2]. La amplificación se realizó en 15 μ l de volumen de reacción que contiene la plantilla de la DNA, 1,5 mM de MgCl 2, 2 μ M de cada primer, 200 μ M de cada dNTP, y 0,5 unidades de Taq polimerasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Las muestras fueron sometidas a 1 ciclo a 94 ° C por 7 min, seguido por 35 ciclos a 94 ° C por 30 seg, 52 ° C por 30 seg, 47 ° C por 30 seg, 72 ° C durante 30 segundos, y un Paso de extensión final a 72 ° C durante 15 min. Los productos de PCR fueron analizados por Metáfora del 3% en gel de agar (FMC Bioproduct, Rockland, Maine, EE.UU.) y la electroforesis teñidas con bromuro de etidio. Fragmento tamaño se calculó utilizando el software Taxotron (PAD Grimont, Institut Pasteur, París).

Resultados y discusión

Mediante amplificación por PCR de la msp1/block2 y msp2 P. falciparum loci generado una sola banda para todos los aislamientos (Fig. 3]. Cada banda de PCR fue secuenciado. Esto demuestra tres alelos diferentes para cada locus. Todos Macouria muestras de los mismos 464-bp msp1 block2 alelo, que pertenecía a la de tipo K1 alélica familia, que corresponde a la denominada alelo B-K1 en un estudio previo [3]. Un menor (431 bp) de tipo K1 alelo, antes denominada A-K1 [3], y un 398 pb RO33 de tipo alelo se observaron en seis y tres Matoury aislamientos. Los tres RO33 de tipo secuencias son idénticas a las RO33 alelo (número Y00087). Alineación de la B-K1 y A-K1 deducir la secuencia de proteínas con secuencias disponibles en las bases de datos identificado varios alelos observado en otras regiones del mundo muestran hasta un 99% y un 97% de identidad, respectivamente. Sin embargo, no aislar en la base de datos había precisamente similares tri-péptido repite como B-K1 o A-K1. Esto está en consonancia con los datos recientes que indican que msp1 / bloque 2 (y msp2) repite evolucionan a un ritmo más rápido que en el SNP no repetidas dominios [10]. Numerosos aislados mostró además polimorfismos de nucleótido único en la falta de secuencias repetidas (Fig. 4].

Los tres alelos msp2 pertenecía a la familia de tipo 3D7 y arbitrariamente fueron llamados 3D7a (591 bp), b (561 pb) y c (603 bp). El alelo 3D7a se observó en los cinco Macouria aislados y en cinco de nueve Matoury aislamientos. El 3D7b y 3D7c alelo fueron observadas en uno y tres Matoury aislamientos, respectivamente (Fig. 3]. Alineación de deducir la secuencia de la proteína mostraba que alelo 3D7c agrupadas con un grupo específico de los aislados típico que muestra particularidades en la región, en particular, repetir la NPPA tetrapeptide intercaladas dentro de G-, A-, S-repite ricos, principalmente GAGASG (Fig. 5]. Sin embargo, el alelo 3D7c es peculiar dentro de este grupo en tener el mayor número de ambos tipos de NNPA repite y repite presentar GGSA también. El 3D7a y 3D7b también presenta cada una disposición de los repite, así como en el SNP no repetido regiones.

Para seguir estudiando la composición genética de la p. Falciparum aislamientos, tres loci microsatélites se estudiaron. Un solo 140-bp C1M4 producto se observó para todos los aislamientos, excepto F79, F89 y F113, en la que no se visualizan banda (Fig. 3]. A 150-bp C3M27 producto amplificado fue Macouria de todos los aislamientos y de la F33, F40, F52, F53, F96 y F105 Matoury aislamientos. A diferencia de 130 bp C3M27 alelo se detectó en los aislamientos F79, F89 y F113. Para el C4M69 locus, una única banda de 520-bp se obtuvo para todos los aislamientos Macouria, una banda de 430-bp para Matoury aislamientos F33, F40, F52, F53, F96 y F105 y un fragmento de 360 pb para el Matoury aislamientos F79 y F89 . Ningún producto se obtuvo para este locus de aislar F113 (Fig. 3]. Estos datos indicaron que de los cinco solo ejemplar loci investigados, todos los aislados generado una sola, monomórficos fragmento de la PCR. Por lo tanto, podemos considerar razonablemente como está monoclonal infecciones. Esto confirma resultados anteriores en esta área, donde un porcentaje muy alto de infecciones solo se observó [2, 3], y está en consonancia con los informes de otras zonas de América del Sur [5, 6].

Francés hypoendemic Guayana es una zona, donde la población se ha limitado, en su caso, la inmunidad. Hay entre 6000-7000 casos de malaria leve, y sólo entre cuatro y 20 casos severos de malaria cada año [1, 3]. Estudios anteriores han puesto de relieve las características específicas de genotipo en P. Falciparum aisladas de los casos graves de este ajuste, con la B-K1 msp1 alelo en desequilibrio fuerte vinculación con un determinado gen var, llamado varD [3]. El código de los genes var la variante adhesins que mediar en el cytoadhesion de eritrocitos parasitados a los receptores específicos de acogida que, sin duda, contribuir a la malaria grave. Como se destaca en la Figura 3, los cinco aislamientos Macouria, incluidos los dos casos graves, tienen el mismo genotipo de 5 loci, lo que sugiere que un solo virulenta aislar estuvo presente. Estas cepas fueron también la prueba de la presencia del gen varD. Un típico varD producto amplificado fue de los cinco Macouria aislamientos. Sólo dos Matoury aislamientos (cepas F33 y F52) llevó la varD lugar, ninguno de los cuales se encontraba la B-K1 msp1 alelo (Fig. 3]. En general, el mismo genotipo se observó en todos los aislamientos Macouria a pesar de que había por lo menos cinco distintos genotipos en Matoury. El Matoury 1 y 2 genotipos diferentes en el locus varD. El Matoury 2 y Matoury 3 genotipos diferentes msp2 tenía un alelo. Además, los aislados F40 y F96 tiene un perfil diferente sensibilidad a los medicamentos (datos no presentados). El Matoury 4 y Matoury 5 genotipos diferentes de la C4M69 locus microsatélite.

Estos datos confirman la varD / B-K1 msp1 vinculación y su asociación con malaria grave en este ámbito. Es importante señalar que esta asociación se había detectado en colectados en 1994-6, más de seis años antes de la epidemia Macouria. Esa estabilidad en el tiempo en una especie con una alta tasa de recombinación [8] es coherente con los datos anteriores que apuntan a una alta tasa de autofertilización en este ámbito [3]. El paludismo grave casos estudiados aquí su origen en un área geográfica muy distinta de los anteriores casos reportados donde el varD / B-K1 se observó asociación, como se ilustra en la Figura 1. Como se observó anteriormente [3], la varD / B-K1 msp1 asociación no era estrictamente específico de la malaria grave, ya que el mismo genotipo se observó también en los no graves Macouria casos. Ya sea que los pacientes con asma leve de malaria recibido un tratamiento precoz en comparación con aquellos con malaria grave o son menos susceptibles debido a su genética o inmunológica conforman no está claro. La aparición de dos casos graves en un intervalo de días en los pacientes infectados con esta cepa sugiere una particular virulencia inherente. Si esto se debe a la particular msp1 y / o varD alelo actual es desconocido. Puede reflejar física asociación con otro locus implicados en la virulencia. Cabe señalar que aislar F52, que alberga varD junto a la A-K1 msp1 alelo, fue obtenida de un paciente con muy alta parasitemia periférica (20%), también se considera un signo de gravedad [11]. VarD es una de aproximadamente 60 miembros de la p. Falciparum var genómica repertorio [12]. La presencia de un gen var no es sinónimo de su expresión. Expresión de varD se demostró en un paciente con mortales p. La malaria por Plasmodium falciparum en un estudio previo [3], pero no se podía estudiar aquí. Los datos indican que en el futuro las investigaciones sobre varD expresión en graves y no graves de malaria están garantizados. Se está trabajando para caracterizar la secuencia genética completa varD.

Los diferentes perfiles genéticos de las cepas involucradas en los dos brotes revelan distintos escenarios de inicio y la dinámica. Genotipificación firmemente Macouria sugiere que el brote se debió a una única cepa de parásito, pero el origen de esta cepa es incierto. Transmisión de E57, el primer caso registrado, a los demás casos es poco probable, debido al corto tiempo entre la clínica ataque y el ataque sufrido por E61, E62 y E64 (12, 13 y 20 días después, respectivamente). E67 posiblemente han sido transmitidas a la cepa E72, que sufrió un ataque de paludismo 37 días más tarde. La diversidad de los aislamientos Matoury indica que el brote fue causado por varias cepas. Matoury acomoda el aeropuerto más grande en el país y, en consecuencia, puede servir como foco para la transmisión de ocasionales parásitos originarios de zonas endémicas de malaria vecinos. La posible causa y el modo de transmisión en esta ciudad en ese momento no se han identificado.

Conclusión

Los resultados apuntan a dos tipos distintos de brote en una región en la que las medidas de control de la malaria son sistemáticamente desplegada y sostenida. Reforzado la vigilancia y la rápida notificación de casos son necesarios para garantizar el rápido despliegue de personal de control de vectores y medidas de protección para prevenir ese tipo de epidemias esporádicas. Macouria El estallido provocó dos casos graves, uno de ellos la muerte, un evento raro en esta zona, donde los centros de salud están bien equipados y tratamiento de la política que se actualiza regularmente. Genotipo del parásito confirmado a la asociación de los B-K1 msp1/varD genotipo con paludismo grave, lo que refuerza la idea de que algunos p. Falciparum cepas pueden provocar más infecciones graves que otros.

Contribuciones de los autores

A. Lavergne y E. Legrand hizo el análisis de secuencias. Volney B., C. Tournegros, D. y L. Accombressi Florent hizo el experimentos de laboratorio. Guillotte M. y O. Mercereau-Puijalon adaptado a la tipificación de microsatélites campo aislamientos. O. Mercereau-Puijalon hizo la base de datos de búsqueda. Todos los autores participaron en el análisis y la interpretación de los datos. E. Legrand y O. Mercereau-Puijalon escribió el manuscrito.

Agradecimientos

Este proyecto fue apoyado por el Ministerio francés de Salud (InVS organismo, París) y la Academia Francesa de Ciencias (Premio Louis D., 2000). Los autores gracias Prof B. Carme y colegas de la Unidad de Parasitología del Hospital Central, Cayenne y los Dres. Duval P. y B. Maubert, de la Unidad Biomédica del Instituto Pasteur de Guayana, de la prestación de los Cayenne muestras de sangre.