Respiratory Research, 2005; 6(1): 68-68 (más artículos en esta revista)

Toll-like receptor 2 de expresión disminuye en los macrófagos alveolares en pacientes fumadores y pacientes con EPOC

BioMed Central
Daniel Droemann (ddroemann@fz-borstel.de) [1], Torsten Goldmann (tgoldmann@fz-borstel.de) [2], Thorsten Tiedje (ttiedje@fz-borstel.de) [1], Peter Zabel (pzabel @ Fz-borstel.de) [1], Klaus Dalhoff (klaus.dalhoff @ uni-luebeck.de) [3], Bernhard Schaaf (schaaf@uni-luebeck.de) [3]
[1] Medical Clinic, Research Center Borstel, 23845 Borstel, Germany
[2] Clinical and Experimental Pathology, Research Center Borstel, 23845 Borstel, Germany
[3] Medical Clinic III, University of Lübeck, 23538 Lübeck, Germany

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Resumen
Backround

El humo de los cigarrillos de exposición incluidos biológicamente activos lipopolisacárido (LPS) en la fase de partículas del humo del cigarrillo induce la activación de los macrófagos alveolares (AM) y las células epiteliales alveolares conducen a la producción de mediadores inflamatorios. Esto representa un mecanismo crucial en la patogénesis de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Patógenos respiratorios son una causa importante de exacerbaciones que conduzca a los ciclos recurrentes de la lesión y la reparación. La interacción entre el patógeno de patrones moleculares asociados y la acogida está mediado por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR). En el presente estudio se caracterizó la expresión de los receptores Toll-like (TLR) - 2, el CD14 y TLR4 humano AM en comparación con los monocitos autólogos obtenidos de los pacientes con EPOC, sanos fumadores y no fumadores.

Métodos

La población estudiada consistió en 14 pacientes con EPOC sin evidencia de exacerbación aguda, 10 sanos y 17 fumadores sanos no fumadores, estratificada por edad. La expresión de TLR2, CD14 y TLR4 moléculas de superficie en comparación con el humano AM autólogo monocitos se evaluó ex vivo mediante análisis FACS. Hibridación in situ se realizó en el lavado broncoalveolar (BAL) células por aplicación de las nuevas desarrollado HOPE-fijador.

Resultados

La expresión de TLR2, CD14 y TLR4 en AM de pacientes con EPOC, fumadores y no fumadores se redujo en comparación con los monocitos autólogos. Comparando AM que hemos detectado una menor expresión de TLR2 en los fumadores y pacientes con EPOC. Además TLR2 ARNm y la expresión de la proteína se incrementó después de la estimulación por LPS no fumadores AM, en contraste con los fumadores y pacientes con EPOC.

Conclusión

Nuestros datos sugieren un humo relacionados con el cambio en el fenotipo de la AM y de la respuesta celular a la estimulación microbiana, que puede estar asociado con el deterioro de las defensas del huésped en la infección de las vías respiratorias.

Backround

Pacientes con EPOC parecen haber alteraciones patológicas subyacentes que facilitan la colonización bacteriana y se traducen en un aumento de la tasa de infecciones respiratorias. Las bacterias se detectan en el 40-60% de las exacerbaciones [1], y la importancia de las exacerbaciones de curso clínico y la disminución de la función pulmonar es cada vez más reconocido [2]. Los mecanismos de aumento de la susceptibilidad a infecciones bacterianas, son poco conocidos. Además de la alteración de la limpieza mucociliar, deficientes funciones del sistema inmune innato parecen ser de importancia [3]. Incompleta eliminación de las bacterias patógenas contribuye a la continuación de la activación de los mecanismos inmunes efectoras [4], que podrían dar lugar a daño de la mucosa y de parénquima.

El tabaquismo es conocido para inducir los procesos inflamatorios. Los datos recientes demuestran altas concentraciones de lipopolisacárido (LPS) de los cigarrillos de tabaco, así como biológicamente activo LPS en la fase de partículas del humo del cigarrillo, lo que sugiere una relevancia clínica 5. AM desempeñar un papel en la orquestación de la respuesta inmune pulmonar. Los receptores de reconocimiento de patógenos (PRR), que se expresan en la superficie de los macrófagos mediar en la interacción entre las conservadas en los patrones de los microorganismos, los patrones moleculares asociados patógenos (PAMP's), y las células de acogida [6]. TLR-4 junto con el CD14 y MD2 adaptador molécula actúa como receptor de los componentes de las bacterias Gram-negativas, tales como LPS. TLR2 reconoce predominantemente componentes de las bacterias Gram-positivas, tales como el ácido lipoteichoic (LTA) y peptidoglycan (PGN) [6].

Un perturbado regulación de los monocitos y PRR en AM puedan afectar al reconocimiento de los patógenos bacterianos y de la señalización intracelular, así como los mecanismos resultantes efector. Un cambio en el PRR expresión en la mañana de la EPOC, por lo tanto, los pacientes pueden estar implicados en el proceso de continuación de la colonización bacteriana y la inflamación. En nuestro estudio hemos preguntado si el humo del cigarrillo la exposición crónica altera la expresión de la PRR en monocitos humanos / AM ex vivo. La superficie expresión de TLR 2, TLR 4 y CD14 fue caracterizada fenotípicamente en los monocitos circulantes y AM obtenidos por BAL en pacientes con EPOC, sanos fumadores y no fumadores. Además, la respuesta a la estimulación LPS se evaluó a nivel de ARNm y proteínas.

Métodos
Diseño del estudio

La población de estudio consistió en tres grupos: 14 pacientes con EPOC (11 varones, 3 mujeres, VEF1% predicho: media 58, 35-78), 10 fumadores sanos (5 varones, 5 mujeres, VEF1% predicho: el promedio de 103, serie 92 -120), 10 jóvenes (6 varones, 4 mujeres, VEF1% predicho: el promedio de 108, rango 98-118) y 7 ancianos sanos no fumadores (6 varones 1 mujer, VEF1% predicho: el promedio de 120, rango 113-142) . En el grupo no fumador dos grupos de edad fueron reclutados para excluir a una edad específica PRR efecto de la expresión ([A] jóvenes, personas de edad [B]).

Infección broncopulmonar fue excluida por el examen clínico, marcadores de inflamación sistémica y la radiografía de tórax. Los datos demográficos de la población del estudio se resumen en el cuadro 1. Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Lübeck.

La broncoscopia y el aislamiento de células BAL

Después de la sedación con midazolam (3-10 mg) y anestesia local con lidocaína al 2% guiada bronchoscopically lavado se realiza de acuerdo con las condiciones normales en el lóbulo medio con la instilación de 300 ml 0,9% de NaCl. Alícuotas de 20 ml y se inculca reaspirated inmediatamente, la recuperación fue 70-90% de los fumadores y los no fumadores y el 35-68% de pacientes con EPOC. El líquido de lavado se diluye a un volumen final de 50 ml y filtrada a través de cuatro capas de gasa para eliminar el resto de moco [7]. Las células se diferencian contar un mínimo de 600 células en un frotis cytocentrifuge (Cytospin II, Shandon, Frankfurt) manchadas de May-Grünwald/Giemsa solución. Gram-las manchas se realizaron en un cytocentrifuge frotis, y la cultura de las bacterias y levaduras fue realizada de forma rutinaria, que no mostró un importante crecimiento de los microorganismos patógenos. La viabilidad se determinó por tinte azul de tripan la exclusión y la muestra se diluye a una concentración de 10 6 células viables / ml.

Estudios de la mañana siempre se llevan a cabo en paralelo con los estudios de los monocitos de sangre periférica de la misma materia.

El aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

Las muestras de sangre venosa periférica se señalaron 20-40 min. Antes de FB y PBMC fueron aisladas de muestras de sangre total heparinized por Percoll gradiente de densidad de centrifugación.

Cultivo de células in vitro y la estimulación

BAL células PBMCs y se cultivaron en bien de 6 placas de tejido (Nunc, Wiesbaden, Alemania) a través de endotoxina libre de medio RPMI 1640 (Biochrome, Berlín, Alemania) suplementado con 2 mM L-glutamina (Gibco, Eggenstein, Alemania) y 100 mg / Ml estreptomicina (Gibco, Eggenstein, Alemania) a una densidad de 1 × 10 6 células / ml a 37 ° C en el 5% de CO 2 humidificado atmósfera para un período de 4 h. Nonadherent células fueron cuidadosamente removidos y el pellet fue nuevamente cultivadas en el medio que se complementó con 1 μ g / ml altamente purificada lipopolisacárido (LPS, de Salmonella friedenau, proporcionado amablemente por el Prof Brade, el Centro de Investigación Borstel) para experimentos de estimulación. Experimentos preliminares de los ensayos el aumento de las concentraciones de LPS demostrado un efecto dosis-dependiente (TLR expresión en la mañana en respuesta a 0,1 μ g / ml LPS: 16,1 vs 12,8 rMFI después rMFI LPS 1 μ g / ml, con una media de los experimentos n = 3).

Citometría de flujo

Para facilitar flowcytometric análisis de la AM, se utilizó una técnica descrita previamente refrescante que reduce fluorescencia intracelular y permite el análisis de anticuerpos fluorocromo-etiquetados por citometría de flujo [8]. Después de 4 h de cultivo in vitro de células fueron analizados para el antígeno de superficie de expresión. La expresión de TLR2, CD14 y TLR4 en AM y monocitos autólogos se determinó utilizando un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). De adquisición de datos y el análisis fueron realizados con el software CellQuest (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania). Cada medición que figuran ≥ 20000 celdas de la AM y de los monocitos población determinada por características adelante / ortogonal dispersión de luz en una parcela de densidad positiva y HLA-DR expresión. Para la compensación de la autofluorescence de AM, de células preparativos se realizaron con cristal violeta, como recomendó anteriormente [8]. Por permeabilización Intraprep reactivo fue usado (Beckman Coulter, Krefeld, Alemania). Los anticuerpos contra los siguientes epítopos se utilizaron. PE-etiquetados: TLR2, TLR4, isotipo controles (eBioscience, San Diego, EE.UU.), CD14, isotype control; PE-CY-5-etiquetados: HLA-DR, isotype control (en este último caso todos adquiridos de BD Pharmingen, Hamburgo, Alemania ). La expresión de marcadores de superficie se calculó como la intensidad de fluorescencia relativa media (rMFI = anticuerpo monoclonal / isotipo correspondiente control), ya que no se encontró distribución bimodal.

Hibridación in situ (ISH)

En un subgrupo de 13 de los no fumadores y seis pacientes con EPOC BAL células se adjunta en el microscopio en SuperFrost Plus (Menzel-Gläser, Braunschweig, Alemania) por centrifugación durante 5 minutos a 450 rpm en alto en una aceleración centrífuga Cytospin 2 (Shandon, Frankfurt , Alemania) y se seca durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación de la noche a la mañana a 4 ° C en ácido glutámico-Hepes buffer mediada Orgánica de Protección de disolvente Efecto solución (HOPE), las células fueron incubadas con acetona / glyoxal de 1 hr. A 4 ° C, 6 veces deshidratados con acetona durante 30 min. A 4 ° C, seguida de dos incubaciones en isopropanol (10 min a 60 ° C, 2 min. A 60 ° C) y el aire dryed. Rehidratación se logró por incubación en el 70% (vol / vol) acetona durante 10 min. A 4 ° C y DEPC agua tratada para 10 min. A 4 ° C [9 - 11]. Las láminas fueron secarse. Una sonda de TLR2 ISH se preparó como se describe anteriormente [12], y ISH se llevó a cabo la noche a la mañana en húmedo cámaras en los 46 ° C. Post lava la hibridación y la detección de los híbridos, se han descrito anteriormente [9, 12]. La generación de las señales se alcanzó en aproximadamente 10 minutos. Las láminas fueron montadas y fotografiadas digitalmente.

Estadísticas

Estadísticas no paramétricas se utilizaron a lo largo del estudio. Los datos se ofrecen como media ± desviación estándar, si no que se indique. Antígeno de superficie de expresión en AM y monocitos de pacientes con EPOC, fumadores y no fumadores fueron probados por el análisis de varianza seguido de la prueba de Kruskal Wallis y la prueba de los rangos con signos de Wilcoxon se utilizó para la comparación de muestras pareadas (pulmonar sistémica vs células de la misma Las personas y los experimentos de estimulación). Un valor de p <0,05 fue considerado significativo.

Resultados
Diferencial PRR patrón de superficie de los monocitos y AM

La expresión de CD14, TLR4 y TLR2 monocitos fue mayor en comparación con la mañana en los no fumadores (A y B), los fumadores y pacientes con EPOC (CD14: 42,92 ± 12,15 vs 5 ± 1,56; 36,1 ± 15,4 vs 4,7 ± 1,6 [ No fumador grupos], 32,4 ± 16,2 frente a 4,09 ± 0,69 y 40,8 ± 10,7 vs 4,3 ± 1,53 relativa intensidad media de fluorescencia (rMFI), p <0,01; TLR4: 10,81 ± 2,88 vs 5,19 ± 1,58, 8,7 ± 5,2 vs 5,3 ± 2,1; 12,3 ± 4,6 vs 4,28 ± 0,7 y 9,2 ± 3,9 vs 4,62 ± 1,38 rMFI, p <0,01; TLR2: 29,71 ± 9,01 vs 13,98 ± 2,54; 24,8 ± 10,6 frente a 12,07 ± 3,5; 32,3 ± 8,4 vs 6,59 ± 1,42 y 27,3 ± 10,8 vs 6,08 ± 1,5 rMFI, p <0,01). No hubo diferencias significativas en el PRR sobre monocitos expresión de los no fumadores (A y B), los fumadores, los pacientes con EPOC. Figura 1a muestra los datos de los no fumadores (A), un representante histograma demuestra la relación entre el control de isotipo a molécula de superficie de fluorescencia (figura 1b]. Además también existe una diferencia en el porcentaje de células positivas (monocitos vs AM, CD14: 96 vs 9,5; TLR4: 69 vs 11, TLR2: 87,5 vs 22,5% positiva).

PRR expresión de la mañana de los no fumadores, los fumadores, los pacientes con EPOC

AM La comparación de los que no fuman (A y B), los fumadores y la EPOC se detectó una tendencia marcadamente menor expresión de TLR2 en AM de los fumadores y pacientes con EPOC (13,98 ± 2,54 y 12,07 ± 3,5 [no fumador grupos] frente a 6,59 ± 1,42 y 6,08 ± 1,5 rMFI, respectivamente, p <0,01) (figura 2a]. No hubo diferencias en la expresión de CD14 y TLR4 entre los grupos (CD14: 5 ± 1,56 y 4,7 ± 1,6 vs 4,09 ± 0,69 y 4,3 ± 1,53 rMFI; TLR4: 5,19 ± 1,58 y 5,3 ± 2 1, frente a 4,28 ± 0,7 y 4,62 ± 1,38 rMFI, respectivamente). Porcentaje de células positivas mostraron datos análogos (los no fumadores (A y B) frente a los fumadores, los pacientes con EPOC, TLR2: 22,5 y 19,2 vs 12,9 y 12,2; CD14: 9,5 y 8,5 vs 8,1 y 8,7; TLR4: 11 y 12,5 vs 8,9 y 10,3% positiva). Un representante histograma demuestra la relación entre el control de isotipo a molécula de superficie de fluorescencia (figura 2b].

Reglamento de expresión en PRR AM

Para estudiar la regulación de la expresión PRR ligando después de la estimulación, las células fueron expuestas a LPS (1 μ g / ml), que condujo a un incremento en la expresión de TLR2 en la mañana de los no fumadores (18,35 ± 4,24 vs 13,98 ± 2,54 rMFI [A] p <0,04; 21,1 ± 6,23 vs 12,07 ± 3,5 [B] p <0,04). En contraste, las células de los fumadores y pacientes con EPOC no respondieron a la estimulación con LPS aumentó TLR2 expresión (7,09 ± 1,42 vs 6,59 ± 1,42 rMFI [fumadores], p = ns; 6,63 ± 2,40 vs 6,24 ± 1,71 rMFI, [pacientes con EPOC ], P = ns) (Figura 3a]. Porcentaje de células positivas mostraron datos análogos (los no fumadores: 28 vs 22,5 [A], el 30,1 vs 19,2 [B], los fumadores: 13,8 vs 12,9, pacientes con EPOC: 13,0 vs 12,2% positiva). No hubo efecto de la estimulación LPS en la superficie expresión de CD14 y TLR4 en todos los grupos. Representante resultados de la orientación ISH TLR2 humanos-ARNm antes y después de LPS-estimulación en los no fumadores (A y B) y pacientes con EPOC son fotográficamente está representada en la figura 3b-e. HOPE-fijos mostraron una buena preservación de la morfología después de la ISH procedimiento. La generación de las señales se alcanzó en aproximadamente 10 minutos. Fuertes señales se encontraron en la mañana de los no fumadores (A y B) LPS después de la estimulación. Inespecíficos no se detectaron señales en el control de los preparativos, en los que las sondas de ADN específicas fueron sustituidos por la hibridación de amortiguamiento o de una sola sonda irrelevante.

Discusión

En este estudio se evaluó comparativamente la influencia de la exposición crónica de humo sobre el plan de TLR2, CD14 y TLR4 expresión en humanos AM y monocitos en pacientes con EPOC, fumadores y no fumadores. Se ha observado una significativa disminución de la expresión de PRR AM en comparación con los monocitos. La conclusión principal fue que la AM de los fumadores y pacientes con EPOC muestran una disminución de la superficie igualmente expresión de TLR2 en comparación con los no fumadores de los dos grupos de edad. Además, un upregulation de TLR2 LPS después de la estimulación se observó solamente en los no fumadores AM.

Un aumento de la superficie TLR2 expresión en monocitos humanos, en respuesta a LPS-estimulación se ha descrito anteriormente [13], mientras que en el nivel transcripcional divergencias en los datos se ha informado de que muestre upregulation [14, 15], o downregulation [16, 17] de TLR2 - MRNA dependiendo de la dosis y el momento de estimulación. Además, la regulación diferencial de TLR2 por IL-1, IL-10 y GM-CSF (upregulation) y de IFN-gamma, TNF-α e IL-4 (downregulation) se ha observado [13]. Por lo tanto, el resultado neto de la estimulación in vivo dependerá del equilibrio local de los mediadores de la inflamación. ¿Cuáles son las posibles consecuencias de LPS-estimulado TLR2 expresión? Plenario bacterias gram-negativas son reconocidas no sólo a través de TLR4 (LPS), pero también TLR 2 (por lipopeptides bacteriana). En este entorno upregulation de TLR2 que se produce principalmente con altas dosis de LPS, puede proporcionar un mecanismo adicional para sensibilizar a las células microbianas contra grandes retos. Además, es el principal TLR2 PRR reconoce bacterias gram-positivas, y estudios recientes han demostrado que los animales con deficiencia de TLR2-están en alto riesgo de sucumbir a las infecciones neumocócicas invasoras [18]. Así, la expresión de TLR2 debilitados AM de los fumadores y pacientes con EPOC después de la estimulación LPS puede perjudicar las defensas de los antimicrobianos en las infecciones de las vías respiratorias. Recientemente una reducción de TLR expresión de envejecimiento en ratones se ha demostrado [19]. Sin embargo, este factor parece ser, sin influir en nuestros resultados, ya niveles comparables de PRR expresión en monocitos y AM de jóvenes sanos y ancianos no fumadores se observaron.

Los mecanismos de la fumar pulmonar inducida por la alteración de funciones inmunológicas, son poco conocidos. Por una parte se sabe que el tabaco induce la activación de los procesos inflamatorios de la mañana y las células epiteliales que conduzca a la producción de TNF-α, IL-8 y LTB4 y la posterior contratación de neutrófilos [20]. En consecuencia, en BALF y esputo de los pacientes con EPOC de activación de los neutrófilos y los niveles elevados de citoquinas proinflamatorias y quimiocinas se han encontrado [21]. Por otro lado, una depresión de la capacidad de LPS inducido por la liberación de citoquinas TNF-α y la IL-6 de AM de los fumadores se ha descrito [22]. Skold y colegas encontraron una mayor expresión de CD11a, CD54 y CD71 en la no-fumador AM en comparación con los fumadores [23]. CD11a (LFA-1) y su ligando juegan un papel importante en la interacción entre las células presentadoras de antígenos y linfocitos-T. Además, la respuesta metabólica después de la estimulación in vitro con myristate acetato de forbol (PMA) fue mayor en los no fumadores que en los fumadores AM. Dandrea et al. Observándose una disminución en la liberación de citoquinas inflamatorias cultivadas AM de los fumadores en respuesta a LPS por la exposición simultánea a NO2 en comparación con los no fumadores [24]. Cultivadas de humanos de las células epiteliales bronquiales de pacientes con EPOC más bajos niveles de liberación de mediadores inflamatorios como el TNF-α y la IL-8 que preparaciones similares de los no fumadores o fumadores sin EPOC, lo que sugiere que downregulation mediador inflamatorio de la liberación también puede ocurrir en las células epiteliales de los bronquios Las personas con EPOC [25].

Nuestros datos demuestran un cambio AM fenotipo con la reducción de la expresión de TLR2 en los fumadores y pacientes con EPOC sugieren que una continua exposición a los productos microbianos en esta enfermedad proporcionada por la colonización bacteriana y LPS presente en el humo del tabaco [5] podrá downmodulate la respuesta inmune pulmonar. Si esto se debe a la selección de un heterogéneo en la subpoblación de macrófagos pulmonares o en un compartimento general AM fenotipo cambio en las condiciones ambientales descritas no pueden ser firmemente diferenciarse de nuestros datos. Sin embargo, en relación con la continua distribución de TLR expresión intensidades encontrado por citometría de flujo última posibilidad parece la más probable. In vitro se demostró que la respuesta es TLR downregulated después de la estimulación repetitiva [26]. Curiosamente hyporesponsiveness una de las células de los TLR-4 ligando LPS se muestra así como después de la preincubación con ligandos de TLR2 y viceversa, lo cual indica la existencia de las rutas de señalización de los TLR sistema [27]. Es tentador especular que este fenómeno también desempeña un papel en condiciones de la estimulación crónica con componentes bacterianos en vivo a lo sugerido por la falta de efecto de estimulación sobre LPS-TLR2 expresión en las células de los fumadores y pacientes con EPOC. Este hallazgo fue confirmado mediante hibridación in situ de orientación TLR2, que fue demostrado recientemente por nuestro grupo en la mañana y las células epiteliales alveolares tipo II en el pulmón humano [12]. Aunque sólo hay una pequeña coincidencia entre los no fumadores, por una parte, y los fumadores y pacientes con EPOC, por el otro se observó una gran variabilidad en el grado de respuesta a la estimulación LPS en el grupo de no fumadores que es un fenómeno bien conocido con Lo que se refiere a la liberación de mediadores biológicos como citocinas proinflamatorias [28]. En cambio, ninguna diferencia en la expresión TLR4 entre los fumadores, los no fumadores, los pacientes con EPOC se observó en nuestro estudio, que puede ser debido a la expresión en general más débil de esta molécula en monocitos y AM.

Funcionalmente relevante de los polimorfismos del TLR se han encontrado en personas con endotoxina hyporesponsiveness (TLR-4) y toxina sepsis (TLR-2) [29, 30]. Los datos con respecto a su relevancia en la EPOC no están disponibles. La expresión suele ser menor de la PRR en el AM en comparación con los monocitos es comparable a los datos comunicados por las células dendríticas y podrá acompañar el proceso de diferenciación de los monocitos a las poblaciones de los macrófagos [15]. En relación con el efecto de la exposición crónica de humo sobre células de la sangre no encontramos ninguna diferencia en la expresión PRR sobre monocitos entre fumadores y no fumadores (datos no presentados), sugiriendo un compartimentado efecto del tabaquismo. En contraste Lauener et al. Demostrado un significativo incremento en la expresión de CD14 y TLR2 en células de la sangre de los agricultores en comparación con los niños no de los agricultores niños [31].

En conclusión, la alteración del fenotipo de los fumadores AM podría desempeñar un papel en la disminución de las respuestas celulares a la estimulación microbiana facilitar la infección persistente. La realización de estudios adicionales con respecto a la relevancia funcional de estos hallazgos y su contribución a la patogénesis de la EPOC puede conducir a más eficaz de los regímenes de tratamiento de esta enfermedad.

Abreviaturas

AM = macrófagos alveolares; BAL = lavado broncoalveolar; EPOC = enfermedad pulmonar obstructiva crónica; FACS = fluorescencia clasificador celular activado; GM-CSF = granulocitos y macrófagos, factor estimulante de colonias; HOPE = Hepes-ácido glutámico amortiguación mediada Orgánica de Protección de Efecto disolvente; IL = Interleucina; IFN-γ = interferón-γ; LTA = lipoteichoic ácido; lipopolisacárido LPS =; PBMC = células mononucleares de sangre periférica; PE = ficoeritrina; PGN = peptidoglycan; PMA = acetato de forbol myristate; PMN = polimorfonucleares neutrófilos; PRR = reconocimiento de patrones Receptor; rMFI = intensidad de fluorescencia relativa media; TLR = Toll-like receptor de TNF-α = factor de necrosis tumoral-α

Contribuciones de los autores

DD llevó a cabo la citometría de flujo y participó en el diseño del estudio y redacción del manuscrito. TG realizado la hibridación in situ y concibe el estudio. TT llevado a cabo experimentos con cultivos de células y participó en la redacción del manuscrito. PZ, KD y BS realizó la parte clínica del estudio y participaron en el diseño y la coordinación del estudio. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores gracias S. Ross, J. Hofmeister, H. Kühl y W. Martens excelente para la asistencia técnica.