Journal of Translational Medicine, 2005; 3: 24-24 (más artículos en esta revista)

Tardía polarización mononuclear fagocítico transcripcional del programa por el interferón tipo I isoformas

BioMed Central
David F Stroncek (dstroncek@cc.nih.gov) [1], Christopher Basilio (chris.basil @ gmail.com) [1], Dirk Nagorsen (dirk.nagorsen @ charite.de) [2], Sara Deola (sdeola @ Cc.nih.gov) [1], Eleonora Aricó (earico@cc.nih.gov) [1], Kina Smith (KSmith2@cc.nih.gov) [1], Ena Wang (EWang@cc.nih. Gov) [1], Francesco M Marincola (FMarincola@cc.nih.gov) [1], Monica C Panelli (MPanelli@cc.nih.gov) [1]
[1] Departamento de Medicina de Transfusión, Warren G. Magnuson Clinical Center, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EE.UU.
[2] Charite - Universitatsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin, Medizinische Klinik III, Hamatologie, Transfusionmedizin und Onkologie, Hindenburgdamm 30, Berlin, Alemania

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Resumen
Antecedentes

El interferón (IFN) - α se considera un elemento clave inmunopatológicas modulador de los procesos a través de una firma específica de la activación de los fagocitos mononucleares (MPs). En este estudio se utilizó el análisis de la transcripción a nivel mundial para caracterizar los efectos de todo tipo I IFN familia, en comparación con un amplio panel de otras citocinas sobre MP previamente expuestos a Lipopolysaccharide (LPS), la estimulación in vitro.

Resultados

Inmaduras CD14 + en sangre periférica MS fueron estimuladas con LPS y 1 hora más tarde con 42 factores, entre ellos por separado soluble citocinas, quimiocinas, interleucinas, factores de crecimiento y IFNs. De perfiles de expresión génica de los parlamentarios se analizó 4 y 9 horas después de la estimulación de citoquinas. Cuatro horas después de la estimulación, el análisis transcripcional de los parlamentarios revelaron dos clases principales de citocinas: uno asociado a la alternativa y el otro con la vía clásica de activación MP sin una clara polarización de tipo I IFNs efectos. En cambio, después de las 9 horas de estimulación más isoformas IFN tipo I inducida por una característica única y transcripcional patrón separado de otras citoquinas. Estos "firma" IFNs incluido; IFN-β, IFN-α2 b / α2, IFN-α I, IFN-α2, C IFN-α, IFN-α J1, IFN-α H2, y INF-α4 B inducida y la sobre-expresión de los 44 Genes, todos los cuales había conocido en las relaciones funcionales con IFN como la resistencia myxovirus (Mx) -1, Mx-2, inducida por interferón y la hepatitis C asociada a la agregación de proteína microtubular. Un segundo grupo de tipo I IFNs segregados por separado y en una asociación más estrecha con el tipo II IFN-γ. La relación filogenética de las secuencias de aminoácidos entre IFNs tipo I no explicó sus sub-clasificación, si bien las diferencias en las posiciones 94 a 109 y 175 al 189 se presente entre la firma y otros IFNs.

Conclusión

Siete isoformas IFN-α y IFN-β participar en la última fase de polarización de los parlamentarios condicionada por LPS. Esta información amplía la anterior vista del papel central desempeñado por el IFN-α en la autoinmunidad y el rechazo del tumor mediante la inclusión y / o exclusión de una serie de factores relacionados con la probabilidad de ser heterogénea expresadas por distintos grupos de población de los individuos en la enfermedad o en respuesta a la biológica Terapia.

Antecedentes

Se ha propuesto recientemente que la autoinmunidad o, de manera más general, la inmunidad es impulsado por un sistema dinámico de equilibrio frente a los vectores representados por un tipo de interferones (IFNs) en una dirección y el factor de necrosis tumoral (TNF) en el otro [1]. Esta dicotomía está mediada por la activación de divergentes fagocitos mononucleares (MS) de las dos familias de citoquinas específicas derivadas de la firma de la expresión de genes que son característicos de diferentes patologías autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (LES, IFN-α y β) o la artritis reumatoide ( TNF) [1 - 3].

Curiosamente, a pesar de IFN tipo I firmas son constantemente observados en los pacientes con LES, sólo una fracción de ellos demuestran elevados niveles de proteína de suero IFN [2]. Por lo tanto, es posible que los métodos de prueba pueden no detectar todas las especies que podrían IFN circulan en la sangre y que puede producir efectos biológicos similares. Por esta razón, evaluó el efecto de un grupo de los relacionados con las moléculas de IFN tipo I en la modulación de la transcripción perfil de los parlamentarios expuestos a lipopolysacaride (LPS) según un modelo experimental descrito anteriormente [4]. Las firmas moleculares de tipo I IFNs fueron comparados con los de IFN-γ, TNF-α y TNF-β, así como un amplio grupo de otras citocinas para caracterizar la especificidad de IFN polarización de los parlamentarios en el contexto de una extensa red de citoquinas.

De hecho, los parlamentarios desempeñan un papel fundamental en la inflamación aguda y crónica de la realización de diversas funciones en las diferentes fases de la activación. Parlamentarios reclutar y activar células efectoras inmunes o pueden bajar de regular el proceso inflamatorio de contener los daños [5]. Pro-inflamatorios parlamentarios, conocidos como tipo 1 o M1 diputados, funcionan como células presentadoras de antígenos cierto que reclutar y activar células inmunes efectoras [6, 7]. MP que mejoren la reparación de los tejidos, estimular la angiogénesis, y contener los daños colaterales a través de la reducción de la inflamación que se conoce como de tipo 2, o M2 parlamentarios [8, 9]. Fagocitos mononucleares de tipo 2 puede ser aún más la categoría de M2 a, b, c [10] sugiere un espectro continuo de la activación MP.

Hay muchos factores que pueden influir en la diferenciación de inmaduros diputados polarizado hacia un M1 o M2 fenotipo a lo largo de la clásica o la vía alterna de activación transcripcional [9]. Teóricamente, el fenotipo funcional in vivo de los parlamentarios a lo largo de cada una de estas vías depende del medio ambiente, ya que los productos extranjeros (productos microbianos) y citoquinas endógenas modulan su activación y maduración [11]. Parlamentarios son capaces de adaptar su respuesta a determinados microbios y productos microbianos, como lo demuestra la exhibición de un perfil de expresión de genes a la estimulación con diferentes productos patógenos [11]. Los efectos de diferentes citoquinas y otros factores bioactivos soluble en diputados también son variables. Estimulación de los parlamentarios con interferón-γ (IFN-γ), sola o con lipopolysacaride (LPS), además de IFN-γ, CD40L, y ligando Flt-3 (FLT3-L) produce M1 diputados. Tratamiento de los parlamentarios con la IL-4 e IL-13 induce un M2 MP phentotype.

Cambios en los siguientes diputados estimulación microbiana no se producen como un solo evento durante un breve período de tiempo, pero las olas en varias horas de duración cada una. Una comparación de los parlamentarios estimuló con 3 tipos de microbios, E. Coli, C. Albicans y encontró que la gripe fue la expresión de los genes más rápidamente inducida por E. Coli y más lentamente por la gripe. Los perfiles de expresión génica inducida por estos tres microbios cambio siguió durante más de 24 horas [11].

Hemos encontrado que las citoquinas tienen un marcado efecto en LPS-estimulado diputados [7]. Inmaduras CD14 + en sangre periférica MS fueron estimuladas con LPS y una hora más tarde que fueron tratados por separado con 42 diferentes citocinas. Después de 4 horas, los diputados se analizaron los perfiles de expresión génica mediante un chip de 17 K cDNA. LPS-estimulación por sí solo indujo un típico perfil de la expresión de genes de la vía clásica de activación MP, pero que fue notablemente alterado por el aumento de la estimulación de citoquinas. Jerárquica agrupación de los perfiles de expresión génica de LPS-estimulado tratados con 42 diputados factores durante cuatro horas reveló dos grupos principales de las citoquinas. Un grupo de IL-4, IL-13, TGF-α, TGF-β, y VEGF y representa la vía alterna de activación MP. Un segundo grupo de IFN-β, IFN-γ, CD40L, y FLT-3L generalmente asociados con la vía clásica. Algunas citoquinas como la IL-10, IL-1 β, IL-15, IFN-α y IFN-A α2 b no por separado en cualquiera de las dos clases [4].

Curiosamente, después de 4 horas, la exposición de citoquinas, IFNs tipo I no mostrar similitudes en el MP activación transcripcional entre ellos. En lugar de ello, los distintos miembros de la familia fueron IFN dispersos entre los diferentes sub clasificaciones de citoquinas. Este hallazgo sugiere que la polarización de IFN MP activación LPS siguiente exposición es un evento retrasado. En este estudio, por lo tanto, se presentan los perfiles de genes de LPS acondicionado parlamentarios 9 horas después de la exposición a 42 diferentes citocinas como en el informe anterior de las 4 horas de punto [4]. La exposición prolongada (9 horas) a estos factores bioactivos reveló una singular MP maduración de la polarización inducida por la mayoría (pero no todos) los miembros de la familia de IFN tipo I, y destacó los factores de este grupo por su capacidad de inducir un distintivo MP perfil de la expresión génica .

Materiales y métodos
MP separación y tinción FACS

Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de una HLA-A * 0201 positivo de donantes varones sanos de raza caucásica de 35 años fueron recolectados por aféresis linfáticos en el Departamento de Medicina de Transfusión, NIH. PBMC se aislaron por gradiente de Ficoll separación y congelados hasta su análisis. Después de la descongelación, PBMC noche a la mañana se mantuvo en 175 cm 2 frascos de cultivo de tejidos (Costar, Cambridge, MA) en medio completo (CM), que consta de medio Iscove (Biofluids, Rockville, MD), complementado con el 10% del calor humano inactivado-AB-suero ( Gemini Bioproducts, Inc, Calabasas, CA), 10 mM hepes de amortiguación (Cellgro, Mediatech, Inc Herndon, VA), el 0,03% L-glutamina (Biofluids), 100 U / ml penicilina / estreptomicina (Biofluids), 10 μ g / ml Ciprofloxacina (Bayer, West Haven, CT), y 0,5 mg / ml de anfotericina B (Biofluids). Adherentes y no adherentes células fueron suavemente eliminado del matraz y centrifugated. MP fueron separados por negativa de selección utilizando el MP Kit de aislamiento y un sistema de autoMACS (ambos Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania). Antes y después de la separación células fueron teñidas con anti-CD14-FITC (Becton Dickinson, San Diego, CA), y utilizó un FACScalibur flujo cytometer y CellQuest software (Becton Dickinson).

Estimulación del MP, el aislamiento de ARN

Negativamente seleccionado CD14 + células fueron lavadas dos veces con suero libre OPTI-MEM (MO), medio (GIBCO BRL), preparado de manera similar a CM. La última población de células que contiene> 90% de células CD14 + fue sembrado en la concentración de 1 × 10 6 / ml en 10 ml de MO en 25 cm 2 frascos (Falcón, Franklin Lakes, NJ) y estimulado con 5 μ g / ml LPS (SIGMA St Louis, MO) durante una hora. No LPS fue añadido a la falta de estimulación de control matraz. Después de una hora, 42 citocinas, quimiocinas y factores solubles se añadieron individualmente a las suspensiones MP (IL-1 α, IFN-α C, J1 IFN-α, IL-13, IFN-α4 B, MIP-1 β, IFN-α G, IL-12 , IL-5, IL-4, VEGF, TGF β, IL-8, IFN-α1, MIP-4 (Parc), Rantes, WA IFN-α, TGF α, IFN-γ, IFN-α2, BCA-1, IFN - F2 α, IL-2, ligando Flt-3, MIP 1 α, IFN-α K, IL-6, IFN-β, IFN-α H2, IFN-αβ2, CD40L, IL-3, Tarc, TNF-α, IFN α2-b, IL-10, Aldara, la IL-1 IL-15, IFN - A, TNF - GM-CSF) [4]. Nueve horas después de la estimulación LPS, MP fueron cosechadas, lavadas dos veces en PBS y lisadas para el aislamiento de ARN usando 700 μ l RNeasy lisis de amortiguación por cada 25 cm 2 frasco, de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Sonda de preparación, de amplificación, y la hibridación de microarrays

Total RNA fue aislado utilizando RNeasy minikits (Qiagen). Amplificación de RNA antisentido (aRNA) fue preparado a partir de ARN total (0.5-3 μ g), según el protocolo descrito previamente por nosotros [12, 13]. Prueba de muestras fueron etiquetadas con Cy5-dUTP (Amersham, Piscataway, NJ), mientras que la muestra de referencia (PBMC de donantes agrupados normal) fue marcado con Cy3-dUTP. Test-muestra de referencia pares se mezclaban y co-hibridizada a 17 K-cDNA microarrays.

Microarrays y análisis estadísticos

Hibridizada arrays escaneadas con 10 - μ m de resolución sobre un escáner GenePix 4000 (Axon Instruments, Union City, CA) en la variable de voltaje PMT para obtener la máxima intensidad de señal con <1% de saturación de la sonda. Tiff imágenes resultantes fueron analizadas a través de ArraySuite software (National Human Genome Research Institute, Bethesda, MD). Los datos fueron analizados mediante el Cluster más vista en árbol y de software [14] y Partek Pro software (Partek Inc, St Charles, MO). El perfil de expresión génica global de 9 horas tratados y no tratados MP experimental consistió en 49 muestras. Con posterioridad bajo el rigor de filtrado (80% de genes presencia en todos los experimentos y la eliminación de genes que no tienen por lo menos en 1 de las muestras del registro 2 = 2 4; ratio) 2063 genes seleccionados para el análisis. La agrupación de las muestras experimentales de acuerdo a Eisen et al. Se basó en estos genes. Gene relaciones son de media corregida a través de muestras experimentales y se muestran de acuerdo con el método de visualización central utilizando un factor de normalización a lo recomendado por Ross [15].

Resultados
Los genes expresados diferencialmente 9 horas después de LPS y Estimulación de citocinas

Hemos demostrado previamente que el perfil transcripcional de parlamentarios estimulada por LPS y sometidos durante 4 horas a la estimulación de citoquinas distinta puede ser polarizada en dos grandes subgrupos y un tercero intermedio de subgrupos según el tipo de citoquinas utilizadas en la cultura [4]. IFN-γ inducida por la estimulación transcripcional cambios que sean compatibles con su actividad pro-inflamatoria y de tipo I con la vía de activación de MP [10]. Después de 4 horas de tipo I IFNs demostrado una variedad de los distintos perfiles de transcripción y no de tipo I-IFN específicas firmas podrían ser identificadas. Por el contrario, en el presente análisis, se observó que 9 horas después de la estimulación de una serie IFNs tipo I se congregaron en un solo grupo que se caracterizó por la firma molecular única de estas citocinas y fue responsable de una única respuesta MP polarización. Este patrón de polarización inducida por IFN-fue identificado de la siguiente manera: el análisis de agrupación jerárquica sin supervisión se aplicó a los datos mundiales conjunto de los parlamentarios tratan por separado con 42 citoquinas por 9 horas después de la estimulación LPS. El conjunto de datos fue filtrada para ordenar los genes que se expresan en por lo menos el 80% de las muestras y cuya expresión es el aumento de 3 o más veces en al menos una muestra. Filtrado de 2063 dado que los genes sería más informativa entre los 17 K de genes.

Citoquinas tratamientos separados en cinco grupos (Figura 1]. Un grupo de las citoquinas mejor clasificados como los que actúan a través de la vía clásica de activación MP como IFN-γ, TNF-α, IL-3, IL-6, GM-CSF, y CD40L (Red bar, Figura 1]. Estas citoquinas son una clasificación similar en nuestro anterior análisis en el punto 4 horas [4]. Dado que la mayoría, aunque no todas las citocinas en este grupo son reconocidos a actuar a través de la vía clásica de activación MP, este grupo fue denominado el "clásico-como" grupo. Curiosamente, en este grupo se incluyen no sólo los de tipo II IFN-γ, pero otros IFNs tipo I como el IFN-α y IFN-K α WA. Esta observación sugiere que estos IFNs tipo I tienen similitudes en la activación transcripcional de los diputados con IFNs tipo II. Otro grupo incluyó citoquinas que se caracterizan por incluirse en la vía alterna de activación MP como la IL-13, el VEGF y el TGF-α, y se llamaría "como alternativa de" grupo 1 (Negro bar, Figura 1]. En la inspección visual de este grupo muestra un perfil transcripcional opuesta a la clásica del grupo. Este grupo incluía también IFNs tipo I como el IFN-α B 2 y IFN-α o IFN-F α21). Un tercer grupo contiene varias citocinas que también activar los parlamentarios a través de la vía alterna incluyendo IL-4, MIP-1 α y β MIP-1 y fue denominado como el grupo de alternativas-2 (Verde bar, Figura 1]. Este grupo fue más distante transcripcional en el perfil de todos los demás grupos y se separó de ellos por el perfil transcripcional de parlamentarios estimuló con oligonucleótidos que contiene una unmethylated deoxycytosine-deoxyguanosine (CpG) motivos mezcla (CpG mezcla tipo K) (Grey bar, Figura 1] O no se habían expuesto a cualquier factores solubles y, por lo tanto, fue representante del perfil transcripcional de los parlamentarios en la cultura. Por lo tanto, más probable es que este grupo representa el ejemplo más divergentes de activación alternativo MP 9 horas después de la estimulación. Sin embargo, incluso en la inspección visual, la alternativa-al igual que el grupo 2 muestra un patrón transcripcional similar a la alternativa 1-como grupo con la mayoría de los genes expresados co-coordinada entre ellos (Figura 1].

Una cuarta categoría comprende una gran variedad de citocinas cuyo efecto en los parlamentarios no pueden ser clasificados con precisión. Sin embargo, en la inspección visual de este grupo proceder a la aproximación de la clásica-como grupo. Este grupo de IL-5, IL-10, IL-12 y TGF-β y que se llamó "clásica-como el grupo 2" El quinto y más relevantes para este estudio fue un grupo que denomina "firma IFNs", que incluía Sólo IFNs tipo I como: IFN-β, IFN-α2 / Α2, IFN-α I, IFN-α2, C IFN-α, IFN-α J1, IFN-α H2, y de IFN-α4 B. Esta agrupación de tipo I IFN fuertemente sugerido un itinerario específico IFN-MP de polarización en la fase tardía de su transcripcional respuesta a LPS.

En general, el 15 de IFNs fueron probados, el 13 de IFN-α 's, IFN-β e IFN-γ. El IFNs no está incluido entre los ocho presentes en la quinta categoría comprende IFN-γ e IFN-α A, G, IFN-α, IFN-α K, WA IFN-α, IFN-α M, IFN-α B2. F IFN-α y IFN-α B2 agrupado con la Variante-al igual que el grupo 1, a la vez que un IFN-α e IFN-α con la Variante G-como el grupo 2. IFN-α K, WA IFN-α y IFN-γ agrupado con el clásico citoquinas. Curiosamente, el perfil mundial de transcripción de los 8 firma IFNs tipo I se enfrente a un gran número de genes a la de los clásicos-que incluyen citoquinas como TNF-α lo que sugiere que, de hecho, IFNs tipo I representa un vector biológico de maduración MP.

Dos firmas funcional parece ser especialmente limitada a la firma IFNs. Estas dos firmas incluidas 52 clones de cDNA en representación de 51 genes. En un 19 clones de la firma de 18 genes y en el otro y 33 clones representaba el 33 genes. Cuarenta cuatro de los 51 genes se firma única. Copias duplicadas de 7 genes se encontraban entre 51 genes. Esos 44 genes que caracterizan la singular perfil transcripcional de tipo I IFN polarizado parlamentarios (Figura 2]. Todos los 44 se firma genes previamente conocidos por estar asociados con IFN función [16 - 49] (Tabla 1]. Entre ellos se incluyeron myxovirus resistencia (Mx) -1, Mx-2, interferón-inducida asociada a la hepatitis C microtubular agregación de proteínas, 2 ', 5'-oligoadenylate sintetasa 1 (OAS1), OAS2, y OAS3, vipirin (CIG5), IFN regulador factor 7 (IRF-7), y 6 complejos antígeno linfocitario (LY6E), estimulado gen de interferón (ISG20), la proteína de respuesta de interferón (IFRG28), inducida por interferón proteína transmembrana 3 (I-8D) (IFITM3), la proteína inducida por interferón Con tetratricopeptide 1 (IFIT1), inducida por la proteína interferón con tetratricopeptide 2 (IFIT2), interferón-alfa proteína inducible (GIP2), interferón-alfa proteína inducible (GIP3), Proteína quinasa, el interferón-stranded RNA inducible doble proteína quinasa activada (PRKR) , Y transductor de señales y activador de la transcripción 1 (STAT1). Siete de estos genes se duplicaron en la matriz, cuerpo de proteínas nucleares (SP110), OAS1, OAS3, ISG20, ubiquitin conjugado enzima E2L6 (UBE2LB), PA28 proteosoma subunidad (PSME2), y IFIT2, y ambas copias de los siete se encontraban entre los genes Los 52 clones de cDNA. Es importante señalar que la no firma IFNs demostrado casi idéntica expresión de estos genes mientras que ninguna de las otras citoquinas estudiadas expresó; subrayando la selectividad de este patrón de expresión de tipo I IFNs con cierta superposición con IFN-γ.

La especificidad de tipo I IFN firmas

Para determinar si el MP genes incluidos en el IFN-específicas firmas fueron específicamente diferencialmente expresadas por todos los IFNs en comparación con otras citoquinas, que se reagruparon las diversas citoquinas tratamientos de acuerdo a la agrupación jerárquica basado en el análisis sólo los 44 genes de la firma (Figura 3]. De hecho, la expresión de todos los genes de la firma es compartida por todos los IFNs tipo I, y fue parcialmente compartida por IFN-γ, que entre los clusters de tipo I IFNs y las otras citoquinas. La firma IFNs se mantuvo en un solo grupo, pero este grupo también incluye un IFN-α y IFN-α K. Así pues, las diferencias en el perfil transcripcional de parlamentarios tratados por distintos tipos de IFNs tipo I no se deben a la activación de diferentes IFN-genes específicos, sino más bien por el aumento de los efectos que tienen sobre distintos IFNs MP activación

Para determinar los genes responsables de la diferenciación entre la firma y la no firma IFNs, identificamos los genes expresados estadísticamente diferente entre los dos grupos. La expresión de 83 genes diferentes entre la firma y la no firma IFNs (unpaired t test, p 2-valor <0,05) (Figura 4]. La firma IFNs se mantuvo en un solo grupo, pero este grupo también incluyó WA IFN-α y IFN-α K. La expresión de un conjunto específico de genes en el nodo desde el antígeno CD164 a la proteína-quinasa, el interferón-inducible represor (PRKRIR) dio lugar a la agrupación de WA IFN-α y IFN-α K con la firma IFNs.

Mediante el uso de una base de datos para la visualización y anotación integrada http://david.niaid.nih.gov/david/upload.asp descubrimiento, los genes expresados diferencialmente entre la firma-y la no firma-IFNs se clasificaron de acuerdo a las funciones celulares y moleculares . Dieciséis grupos funcionales conteniendo cada uno un mínimo de 3 representante genes pertenecientes a un determinado proceso biológico fueron seleccionadas: 1) Metabolismo / metabolismo de las proteínas, 2) la actividad catalítica / hidrolasa actividad, 3) la proliferación de células, 4) el crecimiento de células y maintanance; 5) del ciclo celular ; 6) El Reglamento de la transcripción; 7) Nuclear vinculante; 8) Nucleobase / nucleósidos y el metabolismo de los ácidos nucleicos; 9) transductor de señales de actividad; 10) La respuesta inmune o de defensa; 11) Adhesión celular, 12) Desarrollo, 13), la biosíntesis y regulación de la Traducción, 14) Cytoskeleton 15) Transporte 16) de células de la muerte (Tabla 2, se refieren también a esta tabla para más detalles sobre el nombre de genes abreviaturas y solo gen función).

Firma IFNs upregulated todos los genes clasificados en 7 de 16 categorías: 5) del ciclo celular, 6) El Reglamento de la transcripción, 7) Nuclear vinculante, 8) Nucleobase / nucleósidos y el metabolismo de los ácidos nucleicos, el 9 de transductor de señales de actividad (a excepción de un gen) , 14) Cytoskeleton, y 15) Transportes. Estos resultados indican que no sólo la firma IFNs son capaces de afectar simultáneamente una gran variedad de funciones celulares vitales diputados, pero en estos IFNs son poderosos inductor de la transcripción de genes y de los principales reguladores de las respuestas celulares a distintos tipos de estímulos.

Tanto la firma y la no firma IFNs upregulated MP genes en 7 categorías 1) Metabolismo / metabolismo de las proteínas, 2) la actividad catalítica / hidrolasa actividad 3) Proliferación celular, 4) el crecimiento y el mantenimiento de células de 10) La respuesta inmune o de defensa, 11) Adhesión celular , Y 13) Biosíntesis y regulación de la traducción. Veinticuatro genes se clasificaron en la 1) Metabolismo / metabolismo de las proteínas, la categoría funcional que figura el mayor número de genes. La gran mayoría de los genes metabólicos vitales pertenecían a las vías de supervivencia celular. La activación de genes metabólicos de la firma y la no firma IFNs afectados distintas y, sin embargo, igualmente importantes grupos de genes. Diecisiete fueron upregulated genes metabólicos de la firma-IFNs y estos 17 genes afectados principales vías metabólicas tales como MAP / ERK / MAPKK vía (ZAK), la glicolisis y metabolismo de la glucosa (GAPD), NADPH deshidrogenasa / oxidoreductase actividad (NQO1), ubiquitin dependiente catabolismo proteico / Proteasoma endopeptidase actividad (PSMA7, PSMA3), el metabolismo de los lípidos (FABP5), la maquinaria endocítica de la trata de células (CD63) y de ADN nuclear vinculantes relacionados con la proliferación y diferenciación celular (TAL1, DIS155E). Siete de los 24 genes metabólicos fueron upregulated por la no firma de IFNs y fueron principalmente relacionadas con la actividad enzimática en la biosíntesis de proteínas (LAMR1), proteólisis y peptidolysis (MALT1), el catabolismo de lípidos (LIPA) y cytolysis (LYZ).

Las categorías funcionales 10) Inmune genes y 11) Adhesión celular son de particular importancia debido a que pueden ser la base de la inmunodeficiencia selectiva de la polarización inducida por diputados de los diferentes IFNs. En particular, inmune tales genes, IL-6, receptor de quimioquinas 1 (CCR1), de quimioquinas ligando 1 (CCL1) [50], y de quimioquinas CD2BP2 ligando 3-como 1 (CCL3L1), se expresa específicamente por la firma IFNs. CCR1 codifica un miembro de la familia de receptores de quimioquinas beta, que une a la proteína inflamatoria de macrófagos 1 alfa (MIP-1 alfa), reguladas en la activación T normales expresadas y secretadas proteína (RANTES), monocitos chemoattractant proteínas 3 (MCP-3), y mieloide Progenitoras factor inhibidor-1 (MPIF-1). CCRI es un receptor crucial para el reclutamiento de células efectoras inmunes al sitio de la inflamación [10, 51, 52 Cell Migraciones Consorcio http://wrpx00.bioch.virginia.edu/cellmig_test/cmcweb/resource/cmckb/sci_molecules_list.html] CCL3L1 se une a varios receptores de quimioquinas incluyendo la proteína de unión de quimioquinas 2 y quimioquinas (CC motivo) del receptor 5 (CCR5). CCR5 es un co-receptor para el VIH, y la encuadernación de CCL3L1 a CCR5 inhibe la entrada del VIH [52, 53]. Así, la regulación de CCL3L1 por la firma de IFNs selectiva puede representar un mecanismo de la inmunidad viral.

La activación de la transcripción de CCL1 y CD2BP2 diputados en la firma por IFNs es un resultado interesante teniendo en cuenta que estos dos genes son normalmente en las células T activadas. CCL1 / citoquinas inflamatorias I-309 normalmente es liberado por las células T activadas durante la inflamación [52], y el adaptador CD2BP2 une la cola citoplásmica CD2 y regula la producción de interleucina-2 [54]. La modulación de CCL3L1, CCR1, CCL1, CD2BP2 por la firma de IFNs confirma el papel dominante de estos factores en la primera fase de la respuesta inmune innata, la inflamación viral defensa, y la regulación de citoquinas inflamatorias, como la IL-2.

Macrófagos expresó gen 1 (MPEG1) [55, 56] (NKG7) [57], NKTR [58], MALT-1, LYZ Y CD164 fueron upregulated por la no firma del grupo que sugiere que estos genes con potencial citotóxico inflamatoria y funciones Aumentar el efector función de los parlamentarios. Es importante señalar que WA IFN-α y IFN-α K comportado como la no firma IFNs inmune con respecto a la activación de genes (NKTR, CD164 y MPEG) y, por tanto, no el grupo, con la firma IFNs (Figura 4]. Estos dos IFN alfa puede contribuir a un tipo especial de MP de polarización que puede ser que se llegue a una fase intermedia de activación de entre las vías clásica y alternativa. La no firma IFNs también induce la expresión de genes implicados en la adhesión celular y complementar la regulación: LAMR1 [59], ICAM3 [60], CD164 [61] y complementar el componente 1 del receptor de subcomponente (C1R) [62] dar más pruebas de que IFNs Pertenecientes a la falta de la firma-como grupo puede polarizar parlamentarios hacia la vía clásica de activación de los monocitos.

Firma IFNs específicamente afectados un grupo de genes implicados en la traducción y eucariotas enumerados en la categoría 13) biosíntesis / regulación de la traducción: traducción eucariota inicio factor 5A (EIF5A) [63], la traducción eucariota elongación factor 1 delta (EEF1D) [64], y Eucarióticas traducción elongación factor 2 (EEF2) [65]. Esto apoya la idea de que el poderoso estímulo de la activación inducida por la firma IFNs sobre células inmunes a nivel mundial es un tipo de regulación que afectan directamente a las moléculas objetivo en los niveles de ambos transcripción y traducción.

Genes upregulated por la firma IFNs y pertenecientes a más de un grupo funcional son especialmente interesantes porque podrían representar central y compartida interruptores moleculares y celulares en las vías que no se informó previamente a ser influenciado por la firma de IFNs actividad. El ZAK (alfa motivo estéril y contiene leucina cremallera quinasa AZK) gen que parece ser un muy IFNs gen dominante firma desde que fue compartida por 9 de cada 16 grupos funcionales analizadas. ZAK codifica una kinasa linaje mezclado con una leucina cremallera y un estéril alfa motivo. La expresión de ZAK en células de mamíferos puede conducir a la activación de la JNK / SAPK (MAP quinasa familia), así como vía de la activación del factor de transcripción, el NF-kappaB. Además la sobre expresión de ZAK conduce a la apoptosis en líneas celulares de tumores [66].

Phylogenic análisis

Para determinar si existía una correlación entre la proximidad de la principal secuencia de aminoácidos de tipo I IFNs similitudes funcionales y se comparó la relación de secuencia entre los 13 y IFNs IFN α-β. El análisis no phylogenic predecir la diferenciación entre la firma y la no firma IFNs y, de hecho, la firma IFNs incluyen las proteínas, aunque no guarde relación phylogenically (IFN-α WA, F IFN-α y IFN-α B2 Figura 5]. Por lo tanto, más limitados dominios de la estructura de cada IFN pueden ser responsables de sus diferentes propiedades funcionales. Comparación de las principales secuencias de aminoácidos de IFN-β y los 13 α IFNs identificado varias similitudes (Figura 6]. Aunque no existe una exclusiva secuencia de la variación que podrían distinguir de la firma no firma IFNs, algunos aminoácidos son más probables en la actualidad uno u otro grupo. Tres regiones parecen ser más importantes para distinguir los subgrupos de la proteína y se incluyeron: los residuos de 93 a 109, 174 a través de los residuos 188-9, y en el residuo 123. Las diferencias fueron mayores en los residuos 123 y 179, donde la firma IFNs (excepto IFN-β) tienen los mismos aminoácidos (I, en 124 y T en 179, flechas rojas, la figura 6], pero estos aminoácidos se presente sólo en 2 de 6 No firma α IFNs.

Discusión

Los interferones son importantes citoquinas con antivirales, anti-proliferativa, y el modulador inmune funciones [67]. Los IFNs se dividen en dos clases, de tipo I y tipo II. El tipo I IFNs incluir la α, β, y τ ω IFNs, mientras que el IFN-γ es el único tipo II IFN. Ha sido, en general, considera que los diversos tipo I IFNs han marcadamente diferentes funciones biológicas y el modulador inmune efectos de los IFNs tipo I varían mucho entre los distintos IFNs. IFNs ejercer muchos de sus efectos a través de la modulación MP funciones [1, 68]. La estimulación de citoquinas por los parlamentarios, incluidos los IFNs, resulta en la activación de diversas vías, algunas de las cuales son comunes a diferentes estímulos, y algunos que son únicos para cada estímulos. Este estudio muestra que la mayoría de tipo I IFNs compartir algunas MP activación de las vías y las diferencias funcionales entre IFNs son adicionales debido a la diversificación de sus funciones a través de otras vías de activación. En particular, los efectos de siete IFN-α y IFN-β sobre LPS-estimulado MS fueron notablemente similares. Estas similitudes no eran evidentes después de 4 horas de la estimulación y requiere un proceso más largo de los más altos de activación que puedan ser identificados en nuestro estudio a las 9 horas.

Debido a que sólo estudió un tema, el perfil transcripcional presentados en este estudio, pueden no representar la multitud de efectos biológicos que pueden inducir IFN bajo in vitro o in vivo, porque las condiciones de secundaria autocrina (en diferentes donantes) y paracrina modulación de citoquinas a través de la red después de un Estimulación primaria pueden introducir diversas y fuera de los conmutadores que podrían no tener la señal original. Nevertheless, this is an informative analysis on the effects of IFN subtypes on the late stages of LPS stimulation and, therefore, maybe most informative on the way mononuclear phagocytes are polarized by IFNs during their activation and or maturation.

A group of 42 signature genes was upregulated by all the tested IFNs. Furthermore, all 42 signature genes have previously been found to be associated with IFNs (Table 1 ). The analysis of a group of 83 genes that were differentially expressed among the signature and non-signature IFNs found that the signature IFNs affected a variety of cell functions not only by being potent inducers of gene transcription and translation but by directly and indirectly affecting crucial regulatory cell cycle and metabolic pathways. In addition, signature IFNs were found to be particularly involved in the first phase of the innate immune response, inflammation, and viral defense. In contrast, the non-signature IFNs gene profiling suggested that these immune-modulators can trigger cytotoxic responses and likely increase the effector functions of MPs or classical pathways of monocyte activation.

Type I IFNs play an important role in autoimmune disorders. Serum levels of IFN-α are increased in some patients with the autoimmune SLE. The gene expression profiles of peripheral blood MPs is also abnormal in patients with SLE. Analysis of peripheral blood MPs from patients with SLE has found that IFN-inducible genes are upregulated in almost all patients with SLE [ 2 , 3 , 67 ] and the genes upregulated in SLE patients were similar to those upregulated in peripheral blood MPs stimulated in vitro with IFN-α [ 1 - 3 , 67 ]. As a result the IFN-inducible genes that are upregulated in SLE have been called IFN signature genes. Many of the IFN-inducible genes up regulated in SLE patients are the same genes we found were upregulated by the treatment of LPS-stimulated MPs with the eight signature IFNs. The genes upregulated both in MPs from patients with SLE and by LPS-stimulated genes treated with the signature IFNs included OAS1, OAS2, LY6E, MX1, CIG5, and hepatitis C-associated microtubular aggregation protein (44 kD) [ 2 , 3 , 67 ].

Hilkens et al studied the effects of three IFNs, the signature IFNs, IFN-α1, IFN-α2, and the non-signature IFN, IFN-αF on the expression of 150 IFN stimulated genes by dendritic cells derived from peripheral blood mononuclear cells and found that the qualitative effects of the three IFNs were similar but there were quantitative differences [ 69 ]. The IFN stimulated genes were more highly induced by IFN-α2 and IFN-αF than IFN-α1, but these differences were overcome by increasing the concentration of IFN-αI. There was, however, one exception. The expression of IP-10 was induced by IFN-α2 and IFN-αF, but not by IFN-αI. This supports our finding that the differences in transcriptional profiles of MPs treated by different type I IFNs are due to distinct effects of each of the IFNs rather than differences in the activation of IFN-specific genes.

Although increased serum levels of IFN-α and IFN-ω have been found in some patients with SLE [ 67 ], the proportion of patients with detectable IFN in serum is much smaller than the proportion of SLE patients with peripheral blood MPs that display evidence of IFN-stimulation by gene expression profiling [ 1 ]. However, since the IFN genes upregulated in MPs from SLE patients were similar to those upregulated by MPs stimulated with IFN-α, most studies have measured IFN-α serum levels in patients with SLE. Our study suggests other type I IFNs in addition to IFN-α could be responsible of the abnormal MP gene expression profiles in patients with SLE. It may be that IFNs other than IFN-α are increased in SLE patients but the ELISA assays used to measure IFN-α may not detect other type I IFNs that could result in a similar MP gene expression profile. One commonly used IFN-α ELISA kit recognizes IFN-αA, IFN-α2, IFN-αA/D, IFN-αD, IFN-αK, and IFN-α4b, but not IFN-β or IFN-γ (BioSource International USA, Inc., Camarillo, CA) another kit recognizes IFN-αA, α2, αA/D, αB2, αC, αD, αG, αH, αI, αJ, αK, αWA, and α4b (PBL laboratories multi species IFN α elisa kit) .

Type I IFNs belong to a family of homologous helical cytokines. The various αIFNs have approximately 80% amino acid sequence homology and the α and βIFNs have approximately 30% sequence homology [ 70 ]. The α and βIFNs, however, all have a similar three-dimensional structure. They are made up of nearly parallel bundles of five α helices. In addition to the shared tertiary structure, the α and βIFNs signal cells through the same receptor complex, the common IFN-α/β receptor (IFNAR). This receptor is made up of two subunits IFNAR1 and IFNAR2. IFNAR2 plays a greater role in binding type I IFNs than IFNAR1. Although IFNAR2 is the major IFN binding component of the receptor, the formation of the tertiary complex of IFNAR2 and IFN with IFNAR1 increases the affinity of IFN to IFNAR2 up to 20-fold.

The binding of IFN-α2 to IFNAR1 and IFNAR2 has been extensively investigated [ 64 - 68 ]. IFNAR2 binds to the A helix of IFN-α2 (residues 12–15), the AB loop (residues 26–35), and the E helix (residues 144–153) [ 71 ]. The opposite face of IFN-α2, the B and C helices, is involved with interactions with IFNAR1 [ 70 ]. Modeling of the interactions of IFNAR2 and IFN-α2 based on multidimensional NMR analysis of these molecules found that IFN-α2 residues R33, D35 and R149 interact with a hydrophilic strip of matching charges in IFNAR2. Other important IFN-α2 residues involved with the binding to IFNAR2 are M16 and A19 of the A helix, L26 and L30 of the AB loop, and A145 and M148 of the E helix. Mutagenesis analysis of IFN-α2 found six residues important in IFNAR2 binding: L30, R33, R144, A145, and M148. The residues we found that differ between the signature and non-signature IFNs are in areas that are not critical to the binding of IFN-α2 to IFNAR2. Our findings suggest that changes in IFN-α2 residues in the carboxy end (residues 174, 177, 178-9, 183 and 189), the D helix (residue 124) and the C helix (residues 94, 101, 102, 103, 106, and 109) may affect the function of α and βIFNs and are be responsible for the functional similarities among the signature IFNs. We speculate that these changes may affect the tertiary structure of type I IFNs and there binding by IFNAR1.

Conclusion

MPs demonstrate a biphasic response to cytokine stimulation and 9 hours after IFN treatment LPS-stimulated MPs had a striking gene expression profile. When treated with eight type I IFNs the same group of genes were strongly upregulated. IFNs play a critical role in host defense and the redundant function of these signature IFNs may help insure that there are multiple pathways of activation of potent host antiviral and antitumor responses. Since several different IFNs have similar effects, when clinical or molecular evidence suggest that serum IFN levels are increased, assays that detect a wide range of type I IFNs should be used to measure soluble IFN levels.

List of Abbreviations

Mp = mononuclear macrophage

PBMC = peripheral blood mononuclear cells

IFN = interferon

CM = Complete medium

OM = OPTI-MEM

LPS = lipopolysaccharide

TNF = tumor necrosis factor