Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 17-17 (más artículos en esta revista)

CX 3 CL1 (fractalkine) y CX 3 CR1 expresión en la mielina oligodendrocyte glicoproteína inducida por la encefalomielitis experimental autoinmune: la cinética celular y origen

BioMed Central
Dan Sunnemark (Dan.Sunnemark @ astrazeneca.com) [1], Sana Eltayeb (Sana.ElTayeb @ cmm.ki.se) [2], Maria Nilsson (Maria.Nilsson @ astrazeneca.com) [1], Erik Wallström ( Erik.Wallstrom @ cmm.ki.se) [2], Hans Lassmann (hans.lassmann @ univie.ac.at) [3], Tomas Olsson (Tomas.Olsson @ cmm.ki.se) [2], Anna - Lena Berg (Anna-Lena.Berg @ astrazeneca.com) [4], Anders Ericsson-Dahlstrand (Anders.Ericsson-Dahlstranc @ astrazeneca.com) [1]
[1] Departamento de Ciencias Moleculares, AstraZeneca R & D Södertälje, S-151 85 Södertälje, Suecia
[2] Unidad de Neuroinmunología, Departamento de Neurociencia Clínica, Karolinska Institutet, S-171 76 Estocolmo, Suecia
[3] Instituto de Neurología de la Universidad de Viena, Austria
[4] Evaluación de la Seguridad, AstraZeneca R & D Södertälje, S-151 85, Södertälje, Suecia

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Resumen
Antecedentes

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central (SNC). Se asocia con la activación local de microglia y astroglia, la infiltración de macrófagos activados y las células T, activa la degradación de la mielina y daños a los axones y neuronas. El papel propuesto para CX 3 CL1 (fractalkine) en el control de la activación de microglia y coloca a esta infiltración de leucocitos de quimioquinas y sus receptores CX 3 CR1 potencialmente en una posición estratégica para el control de los aspectos clave en los acontecimientos patológicos que se asocian con el desarrollo de lesiones en el cerebro MS. En este estudio, analizamos esta hipótesis a través del análisis de la distribución, cinética, la regulación y celulares de origen CX 3 CL1 y CX 3 CR1 mRNA expresión en el SNC de ratas inducidas experimentalmente con una MS-al igual que las enfermedades, la mielina oligodendrocyte glicoproteína (MOG) -- Inducida por la encefalomielitis autoinmune (EAE).

Métodos

La expresión de CX 3 CL1 y de su receptor CX 3 CR1 se estudió con hibridación in situ histoquímicas de detección de mRNA con su radio etiquetada cRNA sondas en combinación con tinción inmunohistoquímica de los marcadores fenotípicos de células. Los dos cerebros de ratas sanas y cerebros de las ratas con MOG EAE se analizaron. En definido lesional MOG etapas de la EAE, el número de 3 CX-CR1 mRNA y de las células que expresan la intensidad de la señal de hibridación in situ se determinó a través de análisis de imagen. Los datos fueron evaluados estadísticamente por ANOVA, seguido de Tukey \ primos prueba de comparación múltiple.

Resultados

La expresión de mRNA CX 3 CL1 se presente dentro de las células neuronales-como situados a lo largo del neuraxis saludable de la rata. Expresión de CX 3 CL1 se mantuvo sin cambios en el SNC de las ratas con EAE inducida por MOG, con la excepción de una expresión inducida en astrocitos en lesiones inflamatorias. En particular, el cerebro de la vasculatura encephalitic animales sanos y no muestran señales de CX 3 CL1 expresión mRNA. El receptor, CX 3 CR1, fue expresada por las células microglial en todas las regiones del cerebro sano. MOG inducción de la EAE inducida se asocia con una acumulación de CX 3 CR1 mRNA dentro de la expresión de las células inflamatorias, lesiones cerebrales, la gran mayoría de los cuales manchadas de marcadores positivos de la microglia-macrófagos linaje. Análisis en el tiempo etapas lesiones cerebrales reveló elevados niveles de mRNA CX 3 CR1 en periplaque microglia en la zona, así como un dramáticamente la acumulación de CX 3 CR1 dentro de las células que expresan el principio de su actividad, a finales de activos e inactivos, lesiones desmielinizadas.

Conclusión

Nuestros datos demuestran constitutiva y expresión regulada de la CX 3 CL1 de quimioquinas y sus receptores CR1 CX 3 por neuronas y astrocitos y microglia, respectivamente, dentro de la normal e inflamación del cerebro de rata. Nuestros resultados proponer un mecanismo por el cual las neuronas y astrocitos reactivos puede controlar la migración y la función de la microglia circundantes. Además, la acumulación de 3 CX CR1 expresando células que no sean dentro de la microglia lesiones inflamatorias cerebrales indican un posible papel de CL1 CX 3 en el control de la invasión de leucocitos periféricos al cerebro.

Antecedentes

Quimiocinas son mediadores clave el control de la infiltración de leucocitos a las zonas inflamadas. Se componen de una clase de proteínas relacionadas que ejercen sobre las propiedades quimiotaxis de leucocitos a través de las interacciones con seleccionar miembros de la proteína G unida, la membrana de la célula que abarca los receptores (GPCRs). El hasta ahora identificados 50 quimiocinas se dividen en 4 subgrupos, el XC, CC, CEC y CX 3 C quimiocinas, y la correspondiente consecuencia GPCRs son denominados XCR (en la actualidad uno de los miembros), CCR (11 deorphanized miembros), CXCR (6 miembros) 3 CX y CR (un solo miembro). Síntesis de las quimiocinas es rápidamente inducido en los tejidos dañados o infectados y la célula específica de la expresión de receptores de quimioquinas combinada con la situación específica de la producción de sus ligandos de quimioquinas dar un motivo para atraer a las poblaciones de células apropiadas para luchar contra los organismos invasores y células neoplásicas, para la limpieza y reparación Tejidos dañados. Quimiocinas son también pensó para conducir los procesos inflamatorios crónicos y este, han alimentado la esperanza de que la intervención farmacológica de ligando-provocó la activación de receptores de quimioquinas puede servir para reducir las manifestaciones clínicas de los trastornos inflamatorios de los componentes [1].

CX 3 CL1 (nombres alternativos: fractalkine o neurotactin) fue identificado en 1997 como una de quimioquinas de 373 aminoácidos con, de la familia de quimioquinas, una estructura atípica, un dominio de quimioquinas amarrado en la cima de una mucina-como de dominio que es seguido por un Solo abarcan dominio transmembrana y una cola corta citoplásmica [2 - 4]. CX 3 CL1 se expresa en el cerebro, corazón, pulmón, riñón, músculo y testículo [4 - 8] donde se interactúa con un solo GPCR, CX 3 CR1 [9, 10] para activar la quimiotaxis y adhesión [10 - 13] de CX 3 CR1 expresando células, incluyendo neutrófilos, monocitos, células NK y Th-1 polarizado las células T [10, 14]. Estudios de perfiles de expresión, el papel funcional en los estudios in vitro e in vivo de los sistemas genéticos y de las asociaciones a las enfermedades han proporcionado prometedoras pistas a un posible papel de CX 3 CL1 y de su receptor en, entre otras, la artritis reumatoide [15 - 17], allograft rechazos [ 18] y de la aterosclerosis [19 - 21].

El papel fisiológico de CX 3 CL1 y de su receptor en el cerebro, sin embargo, es menos claro. Expresión de CX 3 CL1 en el cerebro está localizado en las neuronas [22 - 25], mientras que 3 CX CR1 se expresa por microglia cerebral [6, 24 - 26]. Axotomía del nervio facial desencadenar incremento en la expresión de CX 3 CL1 entre las neuronas motoras rompió en el núcleo facial [6] y una respuesta similar se observó recientemente intraparenchymal después de la inyección de proteínas de prión [22]. Inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE; un modelo animal para la esclerosis múltiple) en el ratón también se ha asociado a CX-3 CL1 como inmunoreactividad en los vasos sanguíneos en el cerebro lesiones inflamatorias [3]. Este hallazgo se complementa con el aumento de los niveles de mRNA CX 3 CR1 en la médula espinal de ratas con EAE, como lo demuestra RNAse protección de ensayo [27]. CX 3 CL1 además, ha sido demostrado que la microglia regular funciones, en particular CX 3 CL1 inducida movilización intracelular de Ca 2 +, quimiotaxis y la inhibición de la apoptosis mediada por Fas in vitro [6, 23, 28]. Esto se refleja en la activación de la microglia después de la inyección de 3 CX CL1 in vivo a la rata parénquima cerebral [22], lo que indica una posible función para CX 3 CL1 y CX 3 CR1 en la mediación neuronal-microglial cruz hablar bajo condiciones normales y patológicas. Además, las reclamaciones de los anteriores CX 3 CL1 expresión en las células endoteliales [3, 15, 16, 29 - 32], junto con CX 3 CR1 en monocitos y células Th-1 [5, 14 - 16, 33, 34] puede indicar Un papel en la atracción de las células patógenas a los sitios de neuroinflammation, también.

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica del SNC. Se asocia con la activación local de microglia y astroglia, la infiltración de macrófagos activados y las células T, activa la degradación de la mielina y daños a los axones y neuronas. La enfermedad a menudo se desarrolla a partir de la limitación de la libre aislados episodios con diversas manifestaciones neurológicas, incluyendo la parálisis, a la persistencia, acentúa la pérdida de funciones neurológicas. El neuroinflammatory componente de la enfermedad es, al menos en las fases iniciales, de pensamiento para mediar en aspectos importantes de las manifestaciones clínicas. El papel propuesto para CL1 CX 3 en el control de la activación de microglia y la infiltración de leucocitos lugares este quimioquinas / receptor en un par potencialmente posición estratégica para el control de los aspectos clave en los acontecimientos patológicos que se asocian con el desarrollo de lesiones cerebrales en la EM. En este estudio, analizamos esta hipótesis aún más por el análisis de la distribución, cinética, la regulación y celulares de origen CX 3 CL1 y CX 3 CR1 mRNA expresión en el SNC de las ratas con EAE inducida por MOG. La expresión de CX 3 CL1 y su receptor se estudió con hibridación in situ histoquímicas de detección de mRNA con su radio etiquetada cRNA sondas en combinación con tinción inmunohistoquímica de los marcadores fenotípicos de células. Los resultados indican que, CX 3 CL1 y de su receptor puede controlar aspectos de los procesos de neuroinflammatory en MOG inducida por EAE, y posiblemente también la EM.

Métodos
Animales

Puras mujeres DA.RT1 av1 ratas se obtuvieron de B & K Sollentuna, Estocolmo, Suecia. Todas las ratas fueron alojadas en determinadas condiciones libre de agentes patógenos para mantener la influencia de otros factores ambientales, junto a la inmunización, lo más bajo posible. Mujeres ratas DA 10-14 semanas de edad (150-200 g) fueron utilizados. Todos los experimentos con animales fueron aprobados y realizados de conformidad con las directrices nacionales de Suecia.

Preparación de MOG

La secuencia N-terminal de la rata MOG (aminoácidos 1-125) se expresó en Escherichia coli y purificada a homogeneidad por cromatografía de quelato [35]. Las proteínas purificadas en 6 M urea fueron dializados contra PBS para obtener una preparación que se almacenó a -20 ° C.

Inducción y evaluación de la EAE

Anaesthetized Las ratas fueron inyectadas con metoxifluran y intradérmica en la base de la cola con 0,2 ml de inóculo, que contiene 20 μ g recombinante de rata en solución salina MOG, emulsionar (1:1) con adyuvante incompleto de Freund (IFA; Difco, Detroit, MI). Las ratas fueron clínicamente anotó y ponderado todos los días de 7 días posteriores a la vacunación (pi) hasta el día 30 pi alterna por dos investigadores. La clínica de puntuación fue el siguiente: 0 = no enfermedad, 1 = cola debilidad o parálisis de cola, 2 = patas paraparesia, 3 = patas parálisis, 4 = completa parálisis, estado moribundo, o la muerte. Una enfermedad de la remisión fue definida como una mejora en la puntuación de la enfermedad, ya sea de 3 o 4 a 1, o del 2, 3 o 4 a 0 que se mantuvo durante al menos 2 días consecutivos. Una recaída se definió como un aumento en la clínica de déficit de por lo menos dos puntos que se prolongó durante al menos 2 días.

Histopatología

Los tejidos obtenidos de saludable, no inmunizados ratas o ratones muestra en el día 8, 13, 18, 21, 24, 29 y 40 pi ratas fueron profundamente anaesthetized metoxifluran y con objeto de la perfusión a través de la aorta con paraformaldehído 4%. Los órganos fueron disecados, habitualmente incluidos en parafina y cera seccionaron a 5 μ m. Histopatológico de evaluación se realizó en las secciones transversales de la anterior, mesencéfalo, tronco cerebral y 17 diferentes niveles rostro-caudal de la médula espinal, con hematoxilina y eosina (HE), Luxol rápido azul /-ácido periódico de Schiff (PAS) y la tinción de Bielschowsky impregnación de plata , Para evaluar la inflamación, desmielinización, y patología axonal, respectivamente [36, 37].

Preparación de sondas cRNA marcado radiactivamente

Preparación de sondas cRNA marcado radiactivamente codificación rata CX 3 CL1 y CX 3 CR1 se llevó a cabo a lo descrito previamente [38]. En pocas palabras, el sentido y antisentido cRNA sondas fueron transcritos in vitro con T3 o T7 RNA polimerasa en presencia de 35-S uridine trifosfato (35 S-UTP; NEN - DuMedical, Sollentuna, Suecia). Después de la eliminación de los nucleótidos no incorporado por columnas Quick Spin (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), las actividades específicas de todas las sondas fueron 1-3 × 10 9 dpm / ug. El CX 3 CL1 y CX 3 CR1 cRNA sondas se transcriben fragmentos de cDNA clonado en CU pDP18 menos plásmido vector (Ambion, Austin, Texas). Estos fragmentos de cDNA 450 corresponden a un par de fragmentos de cDNA de rata CX 3 CL1 (de 20-469 pb, GeneBank número AF030358) y una base de 882 par fragmento de cDNA de rata CX 3 CR1 (GenBank número RN04808), respectivamente, y Fueron generados por RT-PCR utilizando la secuencia de oligonucleótidos específicos. La identidad de los fragmentos clonados del cDNA fueron finalmente confirmadas por la secuencia de bases de datos y de comparaciones. Enzimas de restricción y RNA polimerasas se obtuvieron de Promega (Madison, WI).

Hibridación in situ y immunohistohistochemistry

Para detectar la expresión de CX 3 CL1 y CX 3 CR1 ARNm, hibridación in situ se realizaron experimentos sobre las secciones de rata CNS. Hibridación y autorradiografía se llevaron a cabo a lo descrito previamente [39]. En resumen, las secciones de tejidos fueron montadas en láminas más Superfrost (Super Plus Frost, Pittsburgh, EE.UU.) y se seca al vacío en la noche a la mañana después de deparaffination xileno, previamente tratados en un horno de microondas durante 10 minutos a 97 ° C en 10 mM SSC (pH 6,0 ) Y deshidratados en etanol. Como controles, la radio etiquetada sentido sondas fueron transcritas, en el sentido de la orientación y hibridizada a diapositivas, ya procesado en paralelo. Después de la aplicación de 100 ul de hibridación solución que contenga 10 6 cpm de la cRNA sondas, las diapositivas se deslizó la cubierta y se incuba a 60 ° C durante 16 a 20 horas. Las láminas fueron posteriormente lavada con solución salina estándar de 4 × citrato (CDC, pH 7,0), υ digerida en 20 g / ml ribonucleasas una solución a 37 ° C durante 30 minutos, se lava en la disminución de las concentraciones de la cooperación Sur-Sur, que terminó con 0,1 × SSC durante 30 minutos a 70 ° C.

Para identificar los fenotipos celulares de la CX 3 CL1 o CX 3 CR1 células que expresan, una tinción inmunohistoquímica protocolo fue aplicado directamente después de la hibridación in situ paso, como ha sido descrito previamente [39]. Los siguientes anticuerpos monoclonales primarios fueron utilizados: un anticuerpo específico para la rata monocitos y macrófagos (ED-1, Serotec, diluido 1 / 500) o un anticuerpo reacciona con la proteína ácida glial fibrilar (GFAP; GA-5 diluido 1 / 20; Boehringer -- Mannheim). Análisis de manifestaciones de CX 3 CL1 o CX 3 CR1 en las neuronas se realizó utilizando un anticuerpo de reacción neuronal a una proteína específica (NeuN [40]] diluido 1 / 100, Chemicon). En particular, como el antígeno NeuN demostrado ser sensible a las condiciones actuales para el combinado de etiquetado de ARNm y proteínas, se seleccionaron para comparar la distribución de proteínas y NeuN CX 3 CL1 o CX 3 CR1 ARNm independientemente de las secciones de tejido consecutivos. Una oveja con biotina anti-ratón de anticuerpos IgG (Ciencias de la Vida) actuó como reactivo de la secundaria, con la avidina biotina-peroxidasa (ABC) sistema de detección (ABC Elite, Vector Laboratories). Por último, una lectina con biotina (GSI-B4, Vector Laboratories), en combinación con el sistema de detección de ABC se utilizó para la detección de células endoteliales vasculares y macrófagos y microglia en diversas etapas de activación. Paralelamente secciones de tejido se incubaron sin primaria de anticuerpos como el control de la especificidad de la tinción.

La cuantificación del CX-3 CR1 ARNm en las células que expresan las etapas definidas lesional

En un total de 5 secciones cerebrales en ratas a partir del 4 de la fase de recaída (días 21-45), 10 de lesiones inflamatorias fueron seleccionados y definidos de acuerdo a la etapa de la actividad desmielinizante como ha sido descrito previamente [41]. En resumen, a principios activos (EA) se caracteriza por lesiones denso infiltrado de macrófagos, linfocitos y microglia. Vainas de mielina están en el proceso de desintegración y macrófagos figura azul luxol rápido (LFB)-manchado mielina productos de degradación. De otro activo (LA) lesiones todavía densamente pobladas por los macrófagos. Dañado la mielina ha sido eliminada de los axones y macrófagos PAS-positivo que figuran la degradación de la mielina. Inactivo completamente desmielinizadas (DM) lesiones no mostró evidencia de que la destrucción del tejido. Células inflamatorias presentes, pero los macrófagos no se ha mostrado LFB o la tinción de PAS. Una sola placa normalmente contiene dos o más diferentes etapas de la actividad lesional (por ejemplo, un núcleo central rodeado de DM LA zonas y EA). La región en la vecindad inmediata de las placas, que no muestren signos de desmielinización microscópico, se definió como periplaque blanca (PPWM). Representante regiones fuera de lesiones y PPWM áreas se definieron como normal la materia blanca (NWM), y sirvieron como controles internos. Después de hibridación in situ y GSI-B4 isolectin inmunohistoquímica, el cerebro secciones (3 de cerebelo y el puente, 1 de la corteza frontal, 1 desde el tálamo) fueron capturados con un Kappa DX-20 cámara digital montada sobre un microscopio Nikon E600. En cada uno de los definidos lesiones, el número total de GSI-B4 + células, así como el número de GSI-B4 + y GSI-B4-células con las señales positivas de hibridación para CX 3 CR1 fueron contados en un campo de la normalización de 1,9 × 10 4 μ m 2. La intensidad de la señal de hibridación in situ fue determinado por el recuento de las áreas de granos de plata superior a la media del nivel de fondo (según la medición de más de 30 áreas de tamaño similar fuera de las fronteras de celular) + 11 SD (Análisis de sistema de acceso, redes Euromed). En total, el 8 de EA lesiones, 8 LA lesiones, lesiones DM 7, 8 PPWM áreas y 9 NWM zonas se incluyeron en el análisis. Los datos fueron estadísticamente con ANOVA, seguido de Tukey \ primos prueba de comparación múltiple. Un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativa.

Imaging

Bright-campo imágenes fueron capturadas con un Kappa DX-30 cámara digital montada sobre un microscopio Leica. Las imágenes digitales fueron importados en Adobe Photoshop (v. 6.0), en los que se ajustaron para optimizar el equilibrio y brillo, el contraste y la nitidez. Archivos individuales se exportaron a Canvas (v. 8.0) para el montaje en placas, que se dictaron en la resolución inicial de 300 dpi.

Resultados
La expresión de mRNA de codificación CX 3 CL1 y de su receptor en el cerebro de ratas normales y de la médula espinal

Radio etiquetados transcrito antisentido cRNA sondas de cDNA de codificación rata CX 3 CL1 (Fig. 1] y de su receptor, CX 3 CR1 (datos no presentados), se hibridó inicialmente in situ a 5 μ m de la sección de tejidos obtenidos a lo largo de todo rata cerebro y la médula espinal . En la anterior, células que expresan altos niveles de mRNA CX 3 CL1 se detectaron en todo el bulbo olfatorio, corteza cerebral, amígdala, globus-pallidus y tálamo (Fig. 1]. Estas células se manifiesta, con pocas excepciones, un fenotipo neuronal y co-distribuido células con tinción positiva para el pan-neuronal marcador NeuN (ejemplificada en la Fig. 5a, b en el nivel de la médula espinal). Los altos niveles de mRNA CX 3 CL1 expresión también se detectó en todas las células piramidales dentro de la formación hipocámpica (Fig. 1]. Significativamente menor, pero todavía claramente detectable, los niveles de mRNA CX 3 CL1 se observaron en todos los aspectos del hipotálamo (Fig 1], con las neuronas en el núcleo ventromedial que muestra el más fuerte de etiquetado. En el mesencéfalo, pons, y médula oblongata de la médula espinal baja, media y niveles de expresión de manera uniforme se detectó en las células neuronales similares. Una excepción notable fue el cerebelo, en donde los niveles muy bajos de expresión se detectaron dentro de las células granulares y piramidal mientras que las células neuronales como en la profunda cerebelosa núcleos expresó CX 3 CL1 mRNA en los niveles medio (Fig. 1]. Muestras de tejido hibridizada en paralelo con un radio de la etiqueta cRNA sonda transcrito en el sentido de la orientación no reveló ninguna señal de hibridación de fondo por encima de los niveles (datos no presentados).

Además de la expresión de mRNA CX 3 CL1-como entre las células neuronales en el cerebro de rata y de la médula espinal, también detectó bajos a medios de expresión CX 3 CL1 en unos pocos, solitario células dispersas por toda la sustancia blanca. Estas células se manifiesta achatada, morfología alargada (datos no presentados) y no fueron manchadas positivamente en los experimentos de doble etiquetado para CX 3 CL1 ARNm con marcadores fenotípicos de los macrófagos y astrocitos o microglias. No expresión de mRNA CX 3 CL1 se detectó en las células asociadas a la vasculatura cerebral y las meninges, incluyendo las células endoteliales.

En las secciones de tejidos consecutivo, la hibridación in situ con una etiqueta de radio sonda antisentido cRNA codificación rata CX 3 CR1 reveló un bajo-medio de expresión dentro de las células repartidos de manera uniforme en toda la neuraxis (datos no presentados). La morfología de estas células, así como su etiquetado positivo con GSI-B4 (Griffornia simplifolica isolectin B4; manchas microglia, macrófagos y células endoteliales), las reconoció como inactivas microglia (datos no presentados). No detectable expresión se observó más de otras células, incluyendo las neuronas perivasculares y macrófagos y meníngea. Hibridación con una sonda de cRNA sentido de la misma transcrito cDNA no reveló una señal encima de los niveles de antecedentes (datos no presentados).

La expresión de mRNA de codificación CX 3 CL1 y sus receptores en el SNC de las ratas con EAE-MOG

Para explorar el papel de CX 3 CL1 y de su receptor en el control de la cascada inflamatoria en la EM, se examinaron su expresión y regulación en el SNC de las ratas con EAE inducida por MOG. En DA puras ratas, esta enfermedad se manifiesta mayoritariamente con recaídas y remisiones curso de la enfermedad con un primer episodio paralítico, que comenzará alrededor de 9-13 días seguida de una remisión completa o parcial, y luego una recaída de la paresia (Fig. 2]. En algunas ratas inicial (aguda) paresia progresado directamente en una parálisis prolongada sin ningún tipo de intervención de la remisión de los síntomas. En una minoría de las ratas espontáneamente el episodio agudo resolverse sin más signos clínicos de la enfermedad. La fase aguda de la paresia se caracteriza histopatológicamente por astroglial y la activación microglial y perivascular y submeningeal infiltración de linfocitos, macrófagos y granulocitos. Las lesiones inflamatorias se limitan principalmente a la médula espinal y, en algunas ratas, el nervio óptico y de la sustancia blanca cerebelosa. En ratas que mostraron una recaída clínica de la inflamación generalmente seguido la evolución observada durante la fase aguda con submeningeal perivascular y lesiones. Sin embargo, la reacción inflamatoria es a menudo más extensa con numerosas lesiones confluente que abarca importantes áreas de la materia blanca espinal (Fig. 4], a veces se extiende hasta la materia gris. Lesiones inflamatorias en esta etapa se asocia estrechamente con una marcada desmielinización y degeneración axonal y la pérdida de la densidad axonal. Hubo una clara transición en la composición celular observado en las lesiones inflamatorias, predominantemente de linfocitos y granulocitos en la fase aguda lesiones a una abrumadora presencia de macrófagos y microglia con sólo unos pocos en todo el granulocitos lesiones inflamatorias durante la recaída clínica. Estas células fagocíticas exhiben signos evidentes de la absorción y degradación de los componentes de la mielina. Este patrón de la paresia y de alteraciones histopatológicas en general, de conformidad con los estudios anteriores [37, 42], los lectores interesados a que se hace referencia para más detalles sobre la patología de la enfermedad.

Para los siguientes estudios se seleccionaron ratas que se ajustaba a los típicos de recaída-remisión fenotipo de la enfermedad (Fig. 2]. Experimentos de hibridación in situ reveló un neuronal sin expresión de mRNA CX 3 CL1 en toda la CNS en todos los puntos explorados, con excepción de un Tendencia a la reducción del nivel de expresión en materia gris regiones que se infiltraron en particular con células inflamatorias (datos no presentados). Además, el incremento en la expresión de mRNA CX 3 CL1 se puso de manifiesto en un pequeño número de células no neuronales dentro de las lesiones inflamatorias. Doble etiquetado de los experimentos mostraron que las células positivas para la tinción de astroglial marcador de la proteína ácida glial fibrilar, GFAP (Fig. 5]. No hibridación encima de los niveles de señal se detectó en las células de tinción positiva para GSI-B4 (por ejemplo, los macrófagos y microglia y las células endoteliales). Muestras de tejido hibridizada en paralelo con un sentido transcrito CX-3 CL1 cRNA sondas no generar señales de hibridación de fondo por encima de los niveles (datos no presentados).

Hibridación in situ con una sonda de cRNA antisentido CX 3 CR1 mostró una baja, constitutiva de la expresión de receptores en las células uniformemente distribuidas a lo largo de la médula espinal de los sanos, no vacunados de control de ratas (n = 3) y presymptomatic ratas (día 8 pi, N = 3) (Fig. 3]. La morfología y tinción positiva para GSI-B4 identificado estas células como células inactivas microglial. Ratas examinado en diversas etapas siguientes inicio de manifiesto clínicamente inducida por MOG EAE (día 13 pi, la fase aguda, n = 3; día 18 pi, la fase de remisión, n = 3; día 21 pi, la recaída temprana etapa, n = 3; días 24 pi, la recaída mediados fase, n = 3; día 29 pi, la recaída fase tardía, n = 3) demostró una clara visual aumento de la CX 3 CR1 niveles de mRNA por célula, así como un aumento de la densidad sobre todo de CX 3 mRNA expresando CR1 Células, en el marco de las áreas inflamatorias (Fig. 3 y 4]. Estos agregados de CX 3 CR1 mRNA expresando células estaban estrechamente con la superposición de lesiones inflamatorias, siendo destacado en el perivascular y submeningeal lesiones durante la fase aguda y con una pocas lesiones detectables durante la fase de remisión. En ratas examinó a varios tiempos de la fase de recaída la agregación de las células que expresan altos niveles de mRNA CX 3 CR1 seguido de cerca las áreas de expansión de las lesiones. La gran mayoría de los ARNm CX 3 CR1 se expresan las células en todas las fases de la enfermedad positivamente manchadas de GSI-B4 isolectin así como con el marcador de la fagocitosis activa, ED-1. Si bien todos los GSI-B4 positivo, CX 3 CR1 ARNm en las células que expresan PPWM regiones muestran abundantes ramificado procesos de identificación como residente microglia, la morfología del GSI-B4 positivo, CX 3 CR1 mRNA dentro de las células que expresan EA, LA DM lesiones y fue coherente Con macrófagos y microglia en una activado, el estado fagocíticas (Fig. 5]. GSI ocasionales-B4 negativo, CX 3 CR1 mRNA expresando detección de células inflamatorias en las lesiones. Estas células han redondeado o ligeramente núcleos alargados y son de tamaño similar a los linfocitos. Sin embargo, la gran mayoría de los linfocitos dentro de las lesiones no expresó CX 3 CR1mRNA (datos no presentados).

La cuantificación del CX-3 CR1 mRNA células que expresan en relación con la etapa de la actividad desmielinizante

Para caracterizar mejor la distribución de CX 3 CR1 ARNm en las células que expresan MOG inducida por EAE, se realiza un análisis cuantitativo en tiempo definido etapas lesiones. La expresión más fuerte de CX 3 CR1 ARNm se encontró en LA áreas, que contiene una significativamente mayor densidad de los granos de plata cuadrados por unidad en comparación con zonas de EA (p <0,05), DM zonas (p <0,05), PPWM regiones (p <0,001) y NWM (p <0,001) (Tabla 1, Figura 6a]. En EA y DM zonas, la expresión de mRNA CX 3 CR1 fue significativamente mayor en comparación con PPWM (p <0,001) y NWM (p <0,001). Aunque PPWM regiones tienden a mostrar una mayor densidad de granos de plata cuadrados por unidad en comparación con NWM, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Tabla 1, Figura 6a]. El número real de CX 3 CR1 células que expresan ARNm fue tres veces mayor en comparación con las zonas lesional PPWM y NWM pero no difirió significativamente entre EA, LA y DM. La inmensa mayoría de los CX 3 CR1 mRNA expresando células teñidas positivo para GSI-B4 isolectin, como la identificación de los macrófagos y microglia (Tabla 1, Figura 6b]. Aunque no todos los GSI-B4 + células expresó CX 3 CR1 ARNm, hubo una disminución significativa (p <0,0001) correlación entre el número total de GSI-B4 + células y la densidad de los granos de plata cuadrados por unidad (Tabla 1, Figura 6c].

Discusión

Este estudio fue diseñado para facilitar la comprensión de los mecanismos de la trata de células proinflamatorias en la CNS en la EM. Nuestros resultados muestran que las quimioquinas CX 3 CL1 se expresa, activa y regulada, en el marco de CNS lesiones inflamatorias en ratas con EAE inducida por MOG, un ratón modelo de la EM. Además, demuestran que las células que expresan el receptor CR1 CX 3, la mayoría de los cuales son potencialmente patógenos ataque de las células fagocíticas (macrófagos y / o microglia), están dentro de la gran densidad de la acumulación de lesiones inflamatorias. Esto es consistente con la hipótesis de un papel de 3 CL1 CX-CX 3 CR1 en el control local de la infiltración de leucocitos en las lesiones en el SNC MOG-EAE ratas, y, posiblemente, también de MS. El constitutiva CX 3 CL1 y CX 3 CR1 expresión de las neuronas y la microglia, respectivamente, incluso en el cerebro de ratas sanas, indica un posible mecanismo por el cual las neuronas control microglia funciones en el tejido cerebral intacta, también.

Nuestro presente resultados de la expresión constitutiva de CX 3 CL1 normal en el cerebro de rata están de acuerdo con los informes anteriores, donde CX 3 CL1 ARNm [24, 25, 43] y proteínas [25, 43] se demostró en la mayoría de las neuronas del SNC saludable ratas. Resultados similares han sido obtenidos en el ratón [4], el mono rhesus, [25] y humanos [44] cerebro. Es interesante observar que los niveles de mRNA CX 3 CL1 difiere mucho entre las distintas regiones CNS, lo cual indica un posible papel más pronunciado para neuronal CX 3 CL1 anterior en muchas estructuras, es decir, la corteza cerebral, el hipocampo y el cuerpo estriado. Nuestra demostración de que CX 3 CL1 mRNA expresión es inducida en astrocitos en EAE lesiones es nueva, aunque los datos son de acuerdo con el estudio de los seres humanos con el VIH de la demencia asociada donde CX 3 CL1 inmunoreactividad se detectó en astrocitos [45]. Inducida por la expresión de CX 3 CL1 en astrocitos también se observó siguientes intraparenchymal administración de la proteína priónica a cerebro de la rata [22]. Co-cultivo de astrocitos humanos y macrófagos infectados por el VIH también se produjo un aumento de 3 CX CL1 inmunoreactividad en astrocitos [45] y el fomento de la rata [23] y humanos [46] astrocitos con TNF-α e IL-1 β o INF-γ en Vitro se ha demostrado que hasta 3 CX CL1 regular los niveles de mRNA. Un reciente estudio inmunohistoquímico de MS-tejido cerebral normal y demuestra un constituyente CX 3 CL1 expresión en astrocitos y una mayor expresión en humanos adultos astrocyte culturas estimulados con citoquinas pro-inflamatorias, pero no para demostrar una upregulation de CX 3 CL1 en pacientes con EM [ 47]. Sin embargo, estos datos indican que los astrocitos colectivamente son capaces de upregulating CX 3 CL1 expresión inflamado o lesionado en los tejidos del cerebro.

En contraste con el observado expresión de CX 3 CL1 en neuronas y astrocitos, no hemos podido confirmar los resultados anteriores en ratones afectados EAE-[2], donde endotelial inmunoreactividad para CX 3 CL1 se demostró lesiones en el cerebro inflamado. Nuestros resultados han sido corroborados por un estudio reciente realizado por Schwaeble et al. [25] en la que no CX 3 CL1 expresión mRNA se detectó en el endotelio de EAE ratas y ratones. Las posibles explicaciones para los resultados contradictorios son las diferencias en la sensibilidad de la detección de los métodos utilizados o de un potencial no específicos, inmunohistoquímico de reactividad cruzada con otras proteínas en el endotelio en el estudio de Bazán et al. [2]. Una explicación alternativa sería que la forma de secretada CX 3 CL1, que se produce en el parénquima cerebral inflamado por neuronas y astrocitos, es transcytosed en un abluminal-luminal dirección para la presentación de leucocitos en sangre de una manera similar a lo que previamente han Sido descrito para IL-8 y RANTES [48]. Sin embargo, es importante señalar que las células endoteliales fuera de la CNS han sido demostrado convincentemente expresar CX 3 CL1 ARNm y proteínas [6, 8, 29 - 32]. CX 3 CL1 expresión por el endotelio cerebral, que puede estar por debajo del límite de detección de nuestro ensayo, por lo tanto, sigue siendo una posibilidad tentadora de leucocitos en sangre que puede llegar a ser atraídos a emigrar a través de la barrera hematoencefálica en las lesiones inflamatorias de la CNS MOG EAE ratas.

Nuestro actual de los estudios de CX 3 CR1 expresión en el cerebro de rata confirman conclusiones anteriores por Harrison et al [43], Nishiyori et al [24] y otros, demostrando que microglia expresar CX 3 CR1 constitutivamente ARNm en el cerebro de ratas normales. Estos resultados son también compatibles con las anteriores manifestaciones que CX 3 CL microglial aumenta la migración [43], [49] proliferación, la supervivencia [28], la contratación de calcio intracelular [43] y de la secreción de citocinas y metalloproteases [50]. Además, nos demuestran que CX 3 CR1 mRNA expresando células están acumulando rápidamente a altas densidades dentro de la CNS lesiones inflamatorias de las ratas con EAE inducida por MOG, lo que confirma observaciones anteriores [41]. Curiosamente, esas células acumulado en la mayor cinética de las fases de las lesiones, con las densidades más notable detectado en la tarde fases activas. Es tentador especular sobre una pobre función reguladora de CX 3 CR1 expresión tardía lesional en estas etapas, en base a la posible inducción de la nonsignaling CX 3 CR1 receptores [51]. La inmensa mayoría de los CX 3 CR1 mRNA dentro de las células que expresan el lesional zonas ataque de las células fagocíticas (macrófagos y / o microglias) como se demuestra en el doble etiquetado de los protocolos con el GSI-B4 isolectin o el anticuerpo ED-1. Sin embargo, algunas otras, la no-GSI B4 etiquetados, CX 3 CR1 mRNA células expresando también se detectaron lesiones en el SNC. Estas células pueden ser especuló que corresponden a la infiltración de leucocitos en sangre, como las células NK, células T γδ y / o terminales diferenciadas CD4 + y células T CD8 +, que se han descrito anteriormente para expresar CX 3 CL1 receptores y / o de responder funcionalmente A la estimulación CL1 CX 3 [14, 15, 33, 52, 53]. Sin embargo, la mayoría de los linfocitos-células como en el lesiones inflamatorias de la presente ratas no expresó CX 3 CR1 ARNm. En particular, no la expresión de mRNA CR1 CX 3 se detectó en la etiqueta-astrocitos GFAP (datos no presentados) o similares a las células neuronales. Esto contrasta con las conclusiones anteriores de 3 CX-CR1 como inmunoreactividad dentro de las neuronas de un modelo de rata para las enfermedades priónicas [22], en los seres humanos con el VIH encefalitis [44] y de cultivo in vitro de neuronas del hipocampo [54]. Hulshof et al. [47] encuentra débil a moderada neuronal CX 3-CR1 como inmunoreactividad en la materia gris cortical, en función de la muestra de tejido observada. Estos datos sugieren que algunas poblaciones de neuronas puede realmente tener la capacidad de expresar CX 3 CR1 bajo ciertas condiciones.

Nuestros datos actuales son, por lo tanto compatible con un papel para CX 3 CL1 CNS en la rata, tanto durante saludable y las enfermedades inflamatorias. La expresión constitutiva de CX 3 CL1 y de su receptor en neuronas y microglia, respectivamente, demuestra que este par de los receptores de quimioquinas normalmente no es la promoción de la inflamación. Su función puede, en estas condiciones, es posible que sea inerte, pero CL1 CX 3, que normalmente se encuentra físicamente vinculados a la membrana neuronal a través de un espaciador de dominio de transmembrana y un motivo que abarca [2], podrán optar por mediar en un contacto directo entre las neuronas y la microglia vecinos a través de su proadhesive Propiedades [2]. Microglia son muy reactivas a los insultos al tejido cerebral y puede causar daño permanente si no se mantiene bajo control. Una CX 3 CL1 mediada por la interacción entre las neuronas circundantes y microglias pueden, en condiciones saludables proporcionar un mecanismo por el cual las neuronas someter al proinflamatorias y neurotóxicos capacidad de microglia. Esta idea es apoyada por los últimos resultados de los estudios in vitro donde CX 3 CL1 inhibe la muerte neuronal tras la estimulación in vitro de microglia cocultured hipocampo y neuronas con lipopolisacárido, LPS [55]. En este estudio, CX 3 CL1 también fue demostrado para inhibir el LPS estimula la activación de microglia y las síntesis de TNF-α [55]. Por otra parte, endógena CX 3 CL1 también ha demostrado inhibir el aumento de los niveles de TNF-α y 8-isoprostane en el hipocampo y el líquido cefalorraquídeo después de las inyecciones intracerebroventricular de LPS [56]. En otro estudio, CX 3 CL1 protegidas neuronas in vitro de las propiedades neurotóxicas del factor activador de plaquetas o la envoltura de proteína del VIH, Tat [44]. Por el contrario, en condiciones en las que las neuronas y de sus proyecciones dendríticas axonal y se lesiona, como es frecuentemente el caso en EAE y MS, CX 3 CL1 es probable que se cleaved y liberado de la membrana neuronal por metalloproteases actuando a nivel local [57]. Esto crearía un gradiente quimiotaxis que, en combinación con otros activos localmente proinflamatorias mediadores, pueden subserve la extensa acumulación y activación de la microglia cerebral lesionado dentro de los sitios como se ha observado en el presente estudio. Además, la forma soluble de CX 3 CL1 también puede contribuir a la infiltración de 3 CX-CR1 expresando leucocitos, incluyendo los macrófagos y T efectoras y células NK. Estos tipos de células tienen funciones cruciales en la EAE como mediadores de la destrucción del tejido y / o enfermedad de la regulación [58]. La importancia funcional de la solubles CL1 CX 3 / 3 CX-CR1 itinerario ha sido propuesto por el actual demostración de CX 3 CR1 expresión en los macrófagos y células similares a una pequeña fracción de células como los linfocitos. Curiosamente, concurrente estudios han proporcionado evidencias de que funcional CX 3 CR1 y su ligando servir como importantes mediadores de la inflamación y la patología en los modelos animales modelos de la aterosclerosis, transplante rechazos, glomerulonefritis y los accidentes cerebrovasculares [12, 19, 29, 59]. Estudios en ratones con deleciones de los dirigidos CX 3 CL1 o CX 3 CR1 genes tienen, sin embargo, no presentó información relativa a una aportación para esta función de los receptores de quimioquinas par en EAE. CX 3 CL1 - / - ratones [60] o CX 3 CR1 - / - ratones [18] EAE desarrollado de un modo que no se desvíe significativamente de los ratones wildtype. Además, CX 3 CR1 - / - ratones no se manifiestan alteraciones en la microglia las respuestas en torno a heridos o mueren las neuronas motoras periféricas axotomía en un modelo [53]. Estos estudios sugieren un mecanismo de compensación por redundante quimiotaxis otros factores más sutiles o un papel de los receptores de quimioquinas este par de estos modelos de ratones para la EM. Los citados estudios, que propuso un papel neuroprotector de CX 3 CL1, también justifican una investigación más completa de los resultados a largo plazo en lo que respecta a la parálisis y en las lesiones neuronales EAE-desafió CX 3 CL1, o CX 3 CR1, ratones deficientes. Un definitiva, de la función de CX 3 CL1 y de su receptor en condiciones normales y inflamado o lesionado CNS condiciones esperará conceptual ensayos en modelos animales de enfermedades más informativo usando herramientas como selectiva immunoneutralizing antisueros, péptido antagonistas o no peptidergic CX 3 CR1 antagonistas entregados En las diversas etapas de la enfermedad.

Conclusión

• Hemos proporcionado datos para demostrar constitutiva y expresión regulada de la CX 3 CL1 de quimioquinas y sus receptores CR1 CX 3 por neuronas y astrocitos y microglia, respectivamente, dentro de la normal e inflamación del cerebro de rata.

• Nuestros resultados proponer un mecanismo por el cual las neuronas y astrocitos reactivos puede controlar la migración y la función de la microglia circundantes.

• Además, la acumulación de 3 CX CR1 expresando células que no sean dentro de la microglia lesiones inflamatorias cerebrales indican un posible papel de CL1 CX 3 en el control de la invasión de leucocitos periféricos al cerebro.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Diseño de los estudios (DS, SE, EW, A, HL, AE-D), la clonación de construir plásmido (AE-D), un modelo experimental de la EAE y preparación de los tejidos (SE, DS, MN), hibridación in situ y la inmunohistoquímica Coloraciones histoquímicas (DS, MN), el análisis de datos (DS, SE, HL, A-LB, AED), la redacción o revisión de manuscrito (todos los autores). Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

El estudio fue apoyado por el Consejo de Investigación Médica de Suecia, el sueco Fondos Estratégicos, la Sociedad Sueca para la Neurologically discapacitados y Montel Williams fundaciones.