Journal of Translational Medicine, 2005; 3: 29-29 (más artículos en esta revista)

Un genérico ARN-pulsada la vacuna de células dendríticas estrategia de carcinoma de células renales

BioMed Central
Christiane Geiger (christiane.geiger @ gsf.de) [1], Sybille Regn (Sybille_Regn@hotmail.com) [1], Andreas Weinzierl (andreas.weinzierl @ uni-tuebingen.de) [2], Elfriede Noessner (noessner @ Gsf.de) [1], Dolores J Schendel (schendel@gsf.de) [1]
[1] Instituto de Inmunología Molecular, GSF-Centro de Investigación Nacional para el Medio Ambiente y la Salud, Munich, Alemania
[2] Instituto de Biología Celular del Departamento de Inmunología de la Universidad de Tübingen, Tübingen, Alemania

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Resumen

Se presenta un genérico de células dendríticas (DC), la vacuna contra la estrategia para los pacientes con carcinoma de células renales (CCR) basado en el uso de RNA como fuente de múltiplex de los antígenos asociados a tumores (TAAs). En lugar de la preparación de RNA de muestras de tejido tumoral de cada paciente RCC, proponemos sustituir ARN de un pozo preparado caracteriza altamente inmunogénica RCC línea celular (RCC-26 tumor de las células), como fuente de TAAs genérico para la carga de países en desarrollo. Se demuestra aquí que la transferencia de ARN eficiente que se puede lograr utilizando lipofection inmaduros de países en desarrollo, que son posteriormente madurado con un cóctel de citoquinas a expresar altos niveles de las moléculas MHC y estimuladoras, así como el receptor de quimioquinas CCR7. Ni la propia ni la ARN componente lipídico repercutido en el fenotipo o la secreción de citoquinas madura países en desarrollo.

Después de la carga de ARN, países en desarrollo derivados de HLA-A2-positivo donantes fueron capaces de activar la memoria-efector linfocitos T citotóxicos (CTLs) específica para un TAA ligando expresado por el RCC-26 línea celular. CTL respuestas a los países en desarrollo cargados ARN-alcanzó niveles comparables a los estimulado directamente por el RCC-26 células tumorales. Por otra parte, países en desarrollo que expresan las células tumorales ARN cebados ingenuo células T, con un rendimiento de las líneas de células T con la citotoxicidad y la secreción de citoquinas después del contacto con RCC células tumorales. RCC-26 líneas de células están disponibles como las buenas prácticas de fabricación (GMP)-certificada reactivos que permitan esta fuente de ARN para ser fácilmente adaptada y normalizada para ensayos clínicos. Además, así se define inmune instrumentos de supervisión, incluido el uso de ARN de células B que expresan las líneas, están disponibles. Por lo tanto, esta estrategia de DC vacuna puede compararse directamente con un ensayo de terapia genética utilizando ingeniería genética en las variantes de la RCC-26 línea celular como vacunas para la RCC pacientes con enfermedad metastásica.

Antecedentes

Carcinomas de células renales (CCR) se clasifican como tumores inmunogénicos basa en la observación de que los pacientes con CCR metastásico demuestran algunas de las respuestas más favorables a la inmunoterapia [revisado en [1, 2]]; tumor infiltrante linfocitos (TIL) que se han aislado Matar las células tumorales autólogas siguientes restimulation in vitro [revisado en [3]] y adoptivos transferencia de TIL siempre el beneficio clínico de algunos pacientes con CR [4 - 7]. Sería conveniente aprovechar estos reservorios de células efectoras en pacientes con CR, a fin de mejorar la inmunidad antitumoral. Esto podría lograrse ya sea mediante la vacunación de los pacientes para impulsar la pre-existentes inmunidad celular adoptiva o usando la transferencia de células efectoras específicas que se han activado y ampliado ex vivo.

La aplicación de antígenos específicos para estos fines se ha visto obstaculizada en la RCC por la escasez de información sobre la identidad de los antígenos asociados a tumores (TAAs) que pueden servir como eficaz rechazo antígenos tumorales. Por ejemplo, los miembros del cáncer germinal de la familia, como NY-ESO-1 y las moléculas de varios miembros de la familia MAGE que muestran características adecuadas como inmunógenos para otros tumores, no se expresó en la mayoría de los CCR [8 - 12]. Por lo tanto, la vacuna contra la evolución de RCC se han concentrado hasta la fecha sobre el uso de las células tumorales a proporcionar mezclas de desconocidos TAAs como inmunógenos. Sobre esta base, varios tipos de estrategias de vacunación autólogo RCC han sido evaluados en ensayos clínicos, incluyendo el uso de células tumorales inactivadas, de genes modificados de países en desarrollo o las células tumorales que expresan antígenos derivados de lisados RCC, el ARN del tumor o después de la fusión con células tumorales autólogas [Revisado en [13]]. Si bien estos enfoques resultaron ser viable, demostrada toxicidad limitada, y mostró algunos y bioactividad impacto clínico a largo plazo de vacunación se vio obstaculizada por la falta de suficientes cantidades de tumor de muchos pacientes. Para superar esta limitación, utilizando estrategias alternativas alogénico línea celular pueden ser empleados, en virtud del cual el desarrollo de la inmunidad antitumoral eficaz depende de la presencia de moléculas objetivo que se comparten entre varios RCC. CTL reconocimiento de los estudios y perfiles moleculares de las células tumorales de apoyo a la validez de este argumento para RCC [14 - 22].

Hemos desarrollado una vacuna alogénico de células tumorales mediante un tumor bien caracterizado línea (RCC-26) que se elaboró a partir de un paciente con la enfermedad en estadio precoz (T1, N0, M0). Estudios de autólogo y alogénico TIL RCC demostrado que esta línea está representada una serie de distintos péptido-complejo principal de histocompatibilidad (pMHC) ligandos, algunas de las cuales fueron restringidas por HLA-A * 0201-codifican moléculas y compartida por otros RCC. TIL-26 autólogo de células reconocidos sus ligandos específicos pMHC en RCC-26 células, pero no en células derivadas de parénquima renal normal (NKC-26) o el virus de Epstein-Barr de las células transformadas lymphoblastoid (LCL-26) [14], revelando su tumor Asociada a la especificidad. Estamos ingeniería genética RCC-26 células CD80 para expresar junto con citoquinas seleccionados a fin de aumentar su inmunogenicidad natural y hemos iniciado un juicio de dos centro de la comparación de las variantes que expresan CD80 vacuna con IL-2 o IL-7 en HLA-A * 0201 -- Coincide con los pacientes con enfermedad metastásica [13, 23].

Alogénico Si bien este enfoque tiene la ventaja de que las vacunas pueden ser derivados de las células tumorales así charcterized y una fuente genérica de la vacuna se puede utilizar en múltiples pacientes, que está limitado por el hecho de que la inmunización sólo puede ser óptimamente eficaz en pacientes que se corresponde en parte para HLA allotypes con la vacuna de células, desde el encuentro con la cruz de países en desarrollo que permite la presentación de TAAs puede no ser muy eficiente en vivo. Además, en caso de la vacuna de células es el directo de APC para la estimulación de células T, las respuestas se limitan a los linfocitos T CD8 +, porque la RCC células no expresan moléculas MHC de clase II.

Para superar esta limitación y permitir que los pacientes con HLA allotypes diversos que se introducirán en los ensayos clínicos, el desarrollo de una vacuna contra el uso autólogo países en desarrollo cargados con tumor derivado de ARN representa un nuevo enfoque prometedor [24]. Estamos motivados de que el RNA derivados de nuestro bien caracterizado RCC-26 línea celular podría ser utilizada no sólo como fuente de múltiplex TAAs, pero también podría servir como una herramienta para posteriores a la vacunación de la vigilancia inmune. Presentamos nuestra estrategia para el desarrollo de un genérico de ARN-DC pulsada la vacuna y la caracterización de los países en desarrollo cargados con RCC derivados de ARN.

Métodos
Líneas celulares y de las culturas

El carcinoma de células renales línea celular RCC-26 se estableció una de las principales de la etapa I (T1, N0, M0, G2) carcinoma de células claras de los pacientes-26, tal y como se describe anteriormente [14] (alelos HLA: A * 0201, A * 3303 , B * 4101, B * 5101, Cw y Cw * 1502 * 1701). El RCC-53 línea celular, se ha generado de manera similar de un segundo paciente (T2, N1, M1, G2-3) con carcinoma de células claras (alelos HLA: A * 0201, A * 2501, B * 1501, B * 1801, Cw * 1203 y Cw * 0303) [25]. Virus de Epstein-Barr (VEB)-transformado lymphoblastoid líneas celulares (LCLs) se generaron como se describe [26]. Todas las líneas de células fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 12% de suero fetal bovino (SFB), 2 mM de L-glutamina, 1 mM piruvato sódico y 1 × no aminoácidos esenciales. TIL-26 La línea celular se obtuvo del tumor primario de los pacientes tal y como se publicaron-26 [14], cultivados en el medio RPMI 1640 que contiene 7,5% de SFB, el 7,5% inactivado por calor, suero humano mezclado, 2 mM L-glutamina, 1 mM Y piruvato de sodio-1 × no aminoácidos esenciales y restimulated cada 14 días con células tumorales autólogas irradiadas.

Generación de los países en desarrollo derivados de los monocitos de sangre periférica de células mononucleares

Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron por norma Ficoll-Paque (PAN Biotech, Aidenbach, Alemania) gradiente de densidad heparinized centrifugación de la sangre de donantes sanos y lavados dos veces en PBS. Posteriormente, las células CD14 + se afinidad purificado utilizando el kit magnetico de células de clasificación (MACS) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, el PBMCs aislados se incubaron con CD14 MicroBeads en una concentración de 15 μ l/10 7 PBMCs en PBS con 1% de SFB a 4 ° C por 15 min. El etiquetado células fueron lavadas una vez, pasó por una columna de selección, lavado tres veces y eluida de la columna. Para generar países en desarrollo, las células CD14 + se cultivaron en X-Vivo 15 medianas (Cambrex Bio Science, Verviers, Bélgica) suplementado con 800 U / ml rhuGM-CSF (Leukine, Berlex, Richmond, EE.UU.) y 10 ng / ml rhuIL - 4 (Promocell Bioscience, Heidelberg, Alemania) en una celda de concentración de 1,5 × 10 6 / ml en 6-así la cultura placas (PCC, Peske, Aindling, Alemania). Para la maduración de los países en desarrollo inmaduro (iDCs), las células fueron incubadas en el día 6-7 con un cóctel de citoquinas que contienen 250 U / ml rhuTNF-α, de 20 ng / ml rhuIL-1 β (Promocell Bioscience), 1 μ M PGE2 (Sigma, Taufkirchen , Alemania) y 1000 U / ml rhuIL-6 (R & D Systems, Minneapolis, EE.UU.) durante 48 h [27]. Además, los cultivos fueron suplementados con 800 U / ml rhuGM-CSF y 10 ng / ml rhuIL-4.

El aislamiento total del tumor RNA

Total RNA tumor es extraído de las líneas celulares humanas RCC, CCR-26 y RCC-53, utilizando el reactivo Tri ® (Sigma), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Generación de in vitro-ARNm transcrito

In vitro-transcrito mayor proteína verde fluorescente (EGFP) mRNA se preparó a partir del vector pGEM4Z/GFP/A64 [28] (amablemente proporcionados por E. Gilboa, El Centro de Terapias Celular y Genética, del Centro Médico de la Duke University, Durham, NC, EE.UU.), en el que ya figura el poli (A) plantilla. Transcripción in vitro bajo el control de un promotor T7 se llevó a cabo utilizando el mMESSAGE mMACHINE ™ kit T7 (Ambion, Austin, Texas, EE.UU.). IVT mRNA fue purificado utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo de limpieza ARN.

Transfección de los países en desarrollo

Transfección de los países en desarrollo con el RNA se llevó a cabo utilizando el reactivo de lípidos catiónicos DMRIE-C (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). El día 7, fueron cosechadas iDCs y resuspendido en OptiMEM ® I (Invitrogen) a una concentración final de 1,0 × 10 6 CDs / ml. Esta suspensión celular se distribuyó inmediatamente en el 24 y placas (0,5 ml / y = 0,5 × 10 6 iDCs / así). El ARN y lípidos solución se preparó de la siguiente manera: para cada cultura así DC 0,5 ml OptiMEM ® se me mezcla con 5 μ l DMRIE-C, en un tubo de poliestireno y la cantidad deseada de ARN se añade a la mezcla. En general, 2,5 - 5,0 μ g de mRNA IVT o 5,0 μ g de ARN total del tumor se aplicaron para la transfección de 0,5 × 10 6 iDCs. El ARN y lípidos solución fue trasladado inmediatamente a la iDCs. Después de un período de 4 h de incubación a 37 ° C, la solución de transfección fue removido y reemplazado por VIVO X-15, complementado con el cóctel de citoquinas DC para la maduración como se indica.

Análisis de citometría de flujo

Análisis fenotípico de los países en desarrollo fue llevado a cabo por la tinción de inmunofluorescencia dendríticas y monocitos marcadores de diferenciación y activación. Las células fueron marcadas con anticuerpos monoclonales de ratón (mabs), ya sea directamente o cribado conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE). Los siguientes FITC-conjugado mabs fueron utilizados: anti-HLA-DR (IgG2a, clon G46-6), anti-CD83 (IgG1, clon HB15e), de lucha contra el DC-SIGN (IgG2b, clon DCN46), anti-CD14 (IgG2a , Clon M5E2) (BD Pharmingen, San Diego, EE.UU.). Los siguientes fueron utilizados como mabs PE-reactivos conjugados: anti-CD86 (IgG1, clon 2331 FUN-1), anti-CD80 (IgG1, clon L307.4) (BD Pharmingen), anti-CD40 (IgG1, clon) (mAb89 Beckman Coulter, Krefeld, Alemania). Clonar humanos 2H4 específicas para CCR7 (BD Pharmingen) fue cribado. Inmunofluorescencia indirecta se realizó a través monoclonal conjugado con biotina-rata-IgM anti-ratón (clon II/41) en combinación con PE-conjugados streptavidina (BD Pharmingen). PE / FITC isotipo de las inmunoglobulinas acompañado ratón se utilizaron como controles negativos (BD Pharmingen).

Las células fueron lavadas una vez con PBS con 1% de SFB y se incubaron con las adecuadas mab durante 30 min en hielo en PBS / 1% de SFB. Luego se lavaron las células, una vez más, y fijó en PBS / 1% paraformaldehído. Las muestras fueron adquiridas mediante un instrumento FACSCalibur (BD Bioscience Immunocytometry Systems, San Jose, EE.UU.) y el análisis de datos se realizó a través del software CellQuest Pro. Para la determinación de EGFP expresión, de países en desarrollo se cosecharon aproximadamente 24 horas después de transfección, una vez lavadas y directamente analizadas por citometría de flujo.

Análisis de la expresión de citoquinas

Liberación de citocinas por los países en desarrollo se mide a través de la muy sensible Bio-Plex humanos de citoquinas kit de reactivos (BioRad Laboratories Inc, Hercules, CA, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. El análisis de los datos se ha realizado mediante el Sistema de Operación de BioRad Array (BioRad) y cinco parámetro se aplica algoritmos de regresión logística.

Estimulación de células T de ensayo

Estimular las células fueron cosechadas y chapada por triplicado en 96 y U-placas de fondo en una concentración de 1,5 × 10 4 células por así en el 100 μ l de las células T de medios adecuados. Las células T se añadieron en una concentración de 3000 células / así (en el caso de la TIL-26 (GG) clon), o 1,5 × 10 4 células / así (en el caso de novo cebados líneas de células T) en 100 μ l, Dando un volumen total de 200 μ l /. Cultura sobrenadantes se cosecharon 24 h después de un período de incubación a 37 ° C y la liberación de interferón gamma (IFN γ) se midió usando una venta en el comercio ensayo inmunoenzimático (BD Pharmingen).

Cebado de células T

La generación de líneas de células T antitumorales se realizó utilizando células autólogas derivadas de la sangre de los voluntarios sanos. IDCs derivados de los monocitos fueron transfectadas con RNA total de tumores, como se ha descrito anteriormente y madurado durante 48 h. En 24 y placas, 1,25 × 10 5 mDCs fueron incubadas con 1 × 10 6 autólogo PBMCs en un volumen total de 2 ml / así en medio RPMI 1640 que contiene 12% inactivado por calor, suero humano mezclado, 2 mM L-glutamina, 1 MM de piruvato de sodio y 1 × no aminoácidos esenciales. Tras 10-12 días de la cultura, se restimulated con células autólogas mDCs transfectadas con RNA celular total en una proporción de 4:1 (PBMC: mDC). Posteriores rondas de restimulation se llevaron a cabo en una forma análoga, en sustitución de estimulador países en desarrollo cada 7 días. 10 ng / ml rhuIL-7 (Promocell Bioscience) y 20 U / ml rhuIL-2 (Proleukine ®, Chiron, Emeryville, CA, EE.UU.) se añadieron a la cultura tres veces por semana a partir de día 12 y 18, respectivamente. La actividad citolítica inducida de CTLs fue analizado en el día 4 después de la última ronda de restimulation en un estándar de 51 a la liberación de cromo ensayo. Liberación de IFN γ tras la estimulación de células T se midió en el día 10 después de la última ronda de restimulation, disponible en el comercio mediante un ensayo inmunoenzimático (BD Pharmingen).

51 Cromo-liberación de ensayo

Lisis mediada por células se midió en un estándar de 51 Cr-liberación de ensayo tal y como se describe anteriormente [29]. En resumen, las células diana fueron etiquetados con Na 2 51 CrO4 (Hartmann Analítica, Braunschweig, Alemania) a 37 ° C durante 1 h y co-cultivadas con las células efectoras en el efector se indica: blanco (E: T) en una celda de ratios 96-V-tocó fondo y placa para 4 h. 51 Cr espontánea de liberación fue obtenida al incubar células objetivo por sí solo y por la liberación máxima etiquetados directamente contando sólo las células. El porcentaje específico de lisis se calculó como: 100 × (experimental impulsos por minuto (cpm) - espontánea cpm) / (cpm máxima - espontánea cpm). Triplicado de las mediciones de cuatro pasos y monitoreo de las células efectoras fueron utilizados para los experimentos.

Resultados
Estrategia para un genérico de ARN-pulsado DC vacuna para pacientes con CR

Prevemos que la siguiente estrategia para el desarrollo y la aplicación de un genérico de ARN-pulsado DC vacuna para RCC (Figura 1]. En un primer paso, PBMCs de un CCR metastásico (mRCC) están aislados del paciente antes del tratamiento para adquirir monocitos (Paso 1a), y para generar autólogo VEB-transformado LCLs para estudios a largo plazo (Paso 1b). En un segundo paso, los monocitos aislados se diferencian en células dendríticas inmaduras (iDCs), en presencia de GM-CSF e IL-4 (paso 2). El día 7 de la cultura, iDCs son transfectadas con RNA total derivada de la RCC-26 línea celular y posteriormente madurado definido utilizando una citoquina pro-inflamatoria cóctel para 48 h (paso 3).

La aplicación de RNA derivados de un establecido y bien caracterizado RCC línea celular comprende el componente genérico de este enfoque. Total RNA está aislado de esta línea celular, proporcionando una fuente virtualmente ilimitada de TAAs. Esto no pasa por la necesidad de la preparación de ARN, a menudo limitado, de los tejidos tumorales de cada paciente. Madurado completamente países en desarrollo, cargados de ARN genérico que puede ser aplicado para la vacunación de pacientes mRCC (Paso 4).

El autólogo LCLs son instrumentales para el análisis de la activación, la expansión y la perseverancia de las respuestas específicas de células T después de la vacunación. Transfección de LCLs autólogo con RCC derivados de ARN (Paso 5) generará vehículos blindados expresando diferentes complejos pMHC con diversos epítopos TAA. Por co-cultivo de estos vehículos blindados con autólogo PBMCs post-tratamiento, en virtud de la limitación de las condiciones de dilución de la cultura, debería ser posible para realizar el seguimiento del desarrollo de ambas MHC clase Iy clase II-Restringido células T que contribuyen a la inmunidad antitumoral (Paso 6). Cualquiera de RCC-26-ARN o derivados de especies únicas RNAs correspondientes a los distintos TAAs expresadas por las células RCC-26 [23] puede emplearse para determinar la multa potencialmente especificidad de las respuestas de células T nuevas.

Inmaduros países en desarrollo puede ser eficiente con transfectadas in vitro utilizando ARNm transcrito lipofection

Pasos 1 y 2 de la estrategia descrita anteriormente son los procedimientos normales hoy en día. En nuestros estudios, la generación de derivados de los monocitos iDCs en presencia de GM-CSF e IL-4 considerable dado el número de células (aproximadamente el 50% de las cepas aisladas monocitos) y la posterior activación de la iDCs podría alcanzarse a través de la estimulación con un pro - Cóctel de citoquinas inflamatorias (TNF-α, IL-1 β, PGE 2 y la IL-6) durante 48 h [26]. Esto dio lugar a la activación plena madurez países en desarrollo (mDCs) mostrando alta expresión de marcadores de activación de la maduración y, como CD86, CD80, CD83, CD40 y el receptor de quimioquinas CCR7. En contraste, los monocitos marcador CD14 fue completamente regulado (Fig. 2].

Diferentes técnicas se discuten en la literatura para los países en desarrollo con la carga de ARN (Paso 3) [30 - 36], pero el procedimiento para generar plenamente inmunocompetentes ARN-expresando países en desarrollo para la aplicación in vivo aún no se ha definido. En nuestros estudios, hemos utilizado el método de carga lipofection a países en desarrollo con tumor derivado del ARN. Para cuantificar la eficiencia de transfección de ARN, con iDCs se lipofected in vitro-EGFP ARNm transcrito utilizando el reactivo de transfección DMRIE-C en el día 7 de la cultura. DMRIE-C fue elegido, ya que mostró la más baja toxicidad y transfección mayor eficiencia en comparación con otros reactivos de transfección, como DOTAP y TransFast (datos no presentados). Análisis de citometría de flujo EGFP expresión de las 48 h posteriores a la transfección reveló un promedio tasa de transfección, de 20 - 40%, dependiendo de las condiciones elegido (Fig. 3].

Al abordar la cuestión de si la posterior maduración de los países en desarrollo transfectadas tenido un impacto en la expresión de la proteína, encontramos un aumento de la EGFP-positivos cuando las células transfectadas países en desarrollo (2,5 μ g mRNA/0.5 × 10 6 células) fueron expuestos a la maduración cóctel para 48 h ( Fig. 3A]. Lipofection la eficiencia también se puede mejorar mediante la aplicación de cantidades cada vez mayores de EGFP ARNm. Por ejemplo, el uso de 5,0 μ g mRNA/0.5 × 10 6 células aumentó el porcentaje de células positivas en un 10% frente a 2,5 μ g mRNA (Fig. 3B]. En todos los casos, lipofection de mRNA dado lugar a una amplia gama de proteínas de densidad, la generación de países en desarrollo con la expresión de la proteína EGFP que van de bajo a muy altos niveles (Fig. 3 A, B y 3C].

Lipofection de países en desarrollo con ARN no interferir negativamente con maduración de las células

Dado que nos interesaba saber si ARN lipofection de iDCs interferido con la maduración DC, co-incubaron la iDCs transfectadas con los diferentes componentes lipofection (lípidos + RNA), con o sin maduración cóctel de citoquinas, y se analiza la DC fenotipo por citometría de flujo 48 H más tarde. Incubación de los lípidos iDCs con más ARN no tuvo impacto significativo en la maduración DC (Fig. 4, dos paneles de la izquierda). A plena madurez DC fenotipo sólo puede ser inducida por la incubación de la citoquina pro-inflamatoria cóctel, lo que resulta en alta expresión de CD40 y sobre regulación de la expresión CD86 y CD83. Además, la expresión de los receptores de quimioquinas CCR7, que es crucial para la migración de los países en desarrollo a los órganos linfoides secundarios [37 - 40], fue significativamente hasta reguladas sólo después de citocinas inducidas por la maduración de los países en desarrollo (Fig. 4, dos paneles de la derecha) .

Además, se analizaron las citocinas secretadas por los países en desarrollo a fin de determinar si la carga de iDCs con ARN alterada su capacidad de producción de citoquinas. Hemos probado sobrenadantes de los tratados diferencialmente países en desarrollo mediante un panel de citoquinas múltiplex. El día 7 de la cultura, iDCs se incubaron con los diferentes componentes (lípidos solos, solos o RNA RNA, en combinación con los lípidos). Posteriormente, fueron países en desarrollo, ya sea legalmente o mantenerse en la etapa inmadura de 48 h antes de sobrenadantes fueron recolectadas y analizadas. IL-12p70 se detectó en niveles muy bajos, mientras que la IL-10 y IL-2 se detectaron en cantidades ligeramente superiores, pero ni la aplican ni la ARN lipofection reactivo mostró ningún impacto significativo sobre los niveles de citocinas secretadas por iDCs o mDCs. En general, la maduración de los países en desarrollo llevado a un aumento de la secreción de estas tres citoquinas (datos no presentados).

Efectoras específicas de la memoria CTLs pueden ser activados por los países en desarrollo lipofected con tumor de células derivadas de la línea de ARN

Los países en desarrollo aplican para la vacunación (Fig. 1, en el Paso 4) debe ser competente para estimular una respuesta inmunitaria específica. Para evaluar el potencial específico immunostimulatory ARN-cargado de países en desarrollo para efector de memoria CTLs, iDCs derivados de HLA-A * 0201-positivo donantes sanos fueron transfectadas en el día 7 con ARN total preparado a partir de la línea de tumor RCC-26 usando lipofection (5,0 μ g RNA/0.5 × 10 6 CDs). Después de transfección, países en desarrollo fueron madurados durante 48 h. El día 9, transfectadas países en desarrollo fueron co-cultivadas con células TIL-26. TIL-26 línea es un antígeno tumor específico CTL línea que se extendió desde el tumor infiltrante de la población de linfocitos de pacientes-26 y se demostró a reconocer una RCC-26-asociados determinante presentada por HLA-A * 0201-codifican moléculas [14 ]. La TIL-26-derivados clon, TIL-26 (GG) [41] se emplean para todos los experimentos. Después de un período de incubación de 24 h, los sobrenadantes de TIL-26 (GG) co-cultivadas con países en desarrollo han sido recolectados y se evaluaron para IFN γ en un ensayo ELISA.

Para demostrar la especificidad, la TIL-26 (GG) clon fue co-cultivadas con diferentes líneas celulares. Sólo con la cultura co-RCC-26 células, pero no con autólogo LCL-26, la línea celular renal normal (NKC-26), o el HLA-A * 0201-coincide con la línea de células tumorales RCC-53 inducida por IFN-γ en libertad, lo que indica Que sólo RCC-26 células siempre que el ligando específico para TIL-26 activación (Figura 5A]. Por otra parte, TIL-26 (GG) no tenía LAK NK o actividad dirigida contra las células Daudi o K562. Los países en desarrollo transfectadas con el RCC-26-ARN derivados, pero no por sí sola países en desarrollo, fueron capaces de inducir la secreción de IFN-γ en TIL-26 (GG) las células, lo que indica que el RCC-26-ARN se deriva también capaz de proporcionar la TIL-26 - Epítopo específico a los países en desarrollo. Los países en desarrollo transfectadas con RNA derivados de la RCC-53 o LCL-26, que son HLA-A2-positivo líneas celulares que no expresan la TIL-26 epítopo (Fig. 5A], no fueron reconocidos por el clon de células T, más Confirmando la especificidad de la activación de células T ARN-pulsada por países en desarrollo (Fig. 5B y 5C]. ARN-cargado preparado países en desarrollo de HLA-A * 0201-también fueron negativos los donantes no pueden reactivar específicamente TIL-26 células (datos no presentados).

Entre los experimentos, las respuestas estimulada por países en desarrollo alcanzado niveles que van desde el 20% - 80% de las observadas con la estimulación por el RCC-26 línea celular. Estas variaciones en la estimulación de la capacidad de la ARN-cargado países en desarrollo, podría ser una consecuencia de las variaciones en los países en desarrollo de que los donantes no eran evidentes desde la caracterización del fenotipo de la DC. Alternativamente, las diferencias en la prevalencia de epítopo-ARN específicos en diversas preparaciones de ARN o diferencias en la eficiencia de transfección puede haber contribuido a estas variaciones. En el caso óptimo, los TIL-26 de activación de la capacidad de RCC-26-transfectadas países en desarrollo fue casi tan alta como la de estimular el potencial de la RCC-26 sí misma línea celular (Fig. 5B]. Figura 5C muestra otro experimento en el que el RNA-cargado DC estimulación fue sólo alrededor del 30% del nivel de RCC-26 células. Estos datos se incluyen en la figura 5D, que combinaron los resultados de cuatro experimentos independientes.

Inducción de la RCC-26-CTL-líneas específicas utilizando ARN-pulsado países en desarrollo

Para analizar la capacidad de los países en desarrollo ARN-pulsado de nuevo para cebado de antígeno-específica de células T respuestas, que generó países en desarrollo de HLA-A * 0201-positivo donantes sanos y los utilizaron como vehículos blindados después de lipofection con total RNA o bien derivados de la RCC - 26 o RCC-53 líneas celulares (5,0 μ g RNA/0.5 × 10 6 CDs). PBMCs autólogo cocultivated fueron transfectadas con el mDCs en una proporción de 8:1 en la primera ronda de la estimulación y en una proporción de 4:1 después. Encontramos que países en desarrollo, ya sea transfectadas con RCC-26-RCC-53 o derivado de ARN funciona como potente y vehículos blindados fueron capaces de inducir RCC-26-RCC-53 y asociada a las respuestas de células T, respectivamente, después de tres (en el caso de RCC-26) o cuatro (en el caso de RCC53) rondas semanales de restimulation (Fig. 6].

El CTL línea inducida con RCC-26-ARN transfectadas países en desarrollo se analizó usando una de 4 h 51 Cr-liberación de ensayo. Ellos mostraron una eficiente específicas lisis de la RCC-26 línea celular propio, pero no de la autotransfusión descargadas LCL-26 células (Fig. 6A]. Asimismo, la línea de células T cebados con RCC-53-RNA carga fue activada específicamente a secretar IFN γ usando ya sea RCC-53 o las células tumorales autólogas LCLs pulsado con RCC-53-derivados de ARN total (Fig. 6B]. Re-activación de las células T específicas de ARN-autólogas transfectadas LCLs lo que puede ser fundamental para el análisis de las respuestas de células T específicas en desarrollo como consecuencia de la vacunación DC (Fig. 1, en el Paso 6). De hecho, es posible mantener la RCC-53-T específicos de la línea de células autólogas con LCLs transfectadas con RCC-53-ARN derivados. Estas observaciones indican que la continua preparación de los países en desarrollo de PBMCs paciente, ya sea para el análisis de las respuestas de células T o T de mantener líneas de células ex vivo puede no ser necesario.

En ambos ejemplos, Daudi y / o K562 células se utilizan para medir no MHCrestricted lisis o la secreción de citoquinas, respectivamente. Un bajo nivel de actividad se detectó en las poblaciones de células T uncloned pero esto ha sido decididamente inferior a la reactivación específica logrado gracias a las correspondientes líneas de células tumorales.

Discusión

En el presente informe presentamos nuestra estrategia para el desarrollo de un genérico de ARN-pulsado DC vacuna para mRCC. Los pacientes con mRCC tienen un mal pronóstico y las pocas opciones de tratamiento, por lo que la mayoría de los ensayos clínicos el análisis de la eficacia de las vacunas basadas en células, han estudiado el tratamiento de pacientes con enfermedad avanzada. Un DC-basado en la presentación de la vacuna RCC-antígenos asociados con un enfoque prometedor para la generación de respuestas antitumorales, ya que países en desarrollo son los más potentes células presentadoras de antígeno y que son capaces de "cebado" de novo de antígenos específicos de CD4 y CD8 células efectoras de las células T ingenuas In vivo [revisado en [42, 43]]. Mieloide países en desarrollo pueden ser generados a partir de monocitos cuando cultivados en presencia de GM-CSF e IL-4 ex vivo y, por lo tanto son de fácil acceso en un número considerable [44].

En contraste con melanoma péptido que diferentes enfoques específicos de la vacunación se ha estudiado en numerosos ensayos clínicos, menos conocida es la TAAs en RCC. Por lo tanto, la mayoría de los ensayos clínicos en marcha para evaluar la seguridad y la viabilidad de la DC basada en las vacunas contra la RCC hasta ahora han utilizado los países en desarrollo que fueron cargados con lisados tumorales autólogas [17, 18, 45 - 47]. Este enfoque tiene la desventaja de que el material del paciente debe estar disponible y, a menudo, puede ser limitada. Como alternativa, dos ensayos clínicos han utilizado tumor lisados preparado a partir de las líneas establecidas alogénico RCC, que supera este obstáculo mediante el suministro de un genérico fuente de las células tumorales para la preparación de lisados de tumor [18, 48]. Sin embargo, no está claro cómo eficientemente diversos TAAs se transfieren por lisados de células. Es una alternativa atractiva para utilizar los países en desarrollo se define o transfectadas con total tumor derivado del ARN. Mediante la aplicación de ARN, la transferencia de TAAs se puede cuantificar usando sustituto marcador ARN especies expresadas por la línea celular, el cual no es posible cuando se utilizan lisados de células [36].

Un reciente ensayo clínico fase I con mRCC pacientes que recibieron vacunas con países en desarrollo expresar autólogo tumor derivado de ARN demostrado la viabilidad y la falta de toxicidad de dichas vacunas [19]. En este estudio, los autores iDCs empleados que fueron incubadas con ARN desnudo en el día de la administración, basándose en la capacidad natural de los países en desarrollo a tomar las ARN. Basándose en el hallazgo de que puede inducir tolerancia iDCs [49, 50], el uso de mDCs que ahora parecen ser una mejor estrategia.

Varios métodos diferentes para lograr la entrega de ARN a países en desarrollo han sido analizados hasta la fecha, en virtud del cual la electroporación lipofection de países en desarrollo y se han investigado más intensamente [19, 28, 30 - 36]. El tipo de entrega que el rendimiento de países en desarrollo incapaces de generar una óptima respuesta de células T in vivo todavía no se ha determinado. Nuestros propios estudios revelaron que la electroporación dado mayores porcentajes países en desarrollo que expresa la proteína, sin embargo, los niveles de expresión de proteínas en una base por célula lipofected fueron mayores en países en desarrollo [36]. ¿Cómo estas diferencias en el impacto de novo priming de las células T que queda por determinar.

En este sentido, países en desarrollo utilizan transfectadas con RCC-26-derivados de ARN total, mediante la técnica de lipofection. Hemos seleccionado los lípidos catiónicos reactivo DMRIE-C, puesto que ofrece el más eficiente la transferencia de ARN y mostró la menor toxicidad DC. Hemos logrado una tasa de transfección de hasta un 40% cuando iDCs fueron transfectadas con EGFP mRNA y posteriormente madurado mediante un cóctel de citoquinas. Se ha informado recientemente que comparativamente alta eficiencia de transfección también podrían ser obtenidos con otros reactivos de transfección [34]. En este sentido, los autores demostraron un promedio transfección de eficiencia del 47%, con una viabilidad del 92%, cuando madura países en desarrollo fueron transfectadas con un in vitro-EGFP ARN transcrito.

Algunos estudios revelaron que transfección con mRNA puede activar parcialmente países en desarrollo, presumiblemente debido a la doble varados estructuras secundarias de la mRNA y de peaje-como los receptores de señalización [51 - 53]. Por lo tanto, estaban interesados en la cuestión de si los elementos utilizados durante el procedimiento de lipofection influiría en el estado de maduración de los países en desarrollo. No se encontraron pruebas de que la aplicación de los lípidos y el ARN, en las concentraciones utilizadas en nuestros experimentos, provocado importantes DC activación. Por lo tanto, con una incubación definido de citoquinas pro-inflamatorias cóctel sigue siendo necesario para inducir un fenotipo maduro DC. Además, la transfección de los países en desarrollo con el ARNm no tiene influencia significativa sobre las citocinas producidas por los países en desarrollo. Por consiguiente, ni DC, ni el fenotipo de los niveles de secreción de citoquinas eran moduladas por el lipofection componentes y / o procedimiento.

Para lograr una efectiva respuesta de células T en los pacientes, generadas ex vivo países en desarrollo debe ser competente, tanto en la activación de re-pre-existentes efectoras de la memoria y en el cebado CTLs específicos de las células T de novo. Antitumorales CTL respuestas a menudo puede ser detectado en pacientes con CR [3 - 7, 41]. Sin embargo, estas respuestas de las células T son insuficientes en el control de la enfermedad, posiblemente debido a un desarrollo tardío general inmunológico debido a la represión o el encuentro de esas células T defectuosos con células presentadoras de antígeno [54 - 60]. Estimulación de la memoria de las células T antígeno-cargado con países en desarrollo generados ex vivo puede superar estas limitaciones y mejorar tumor específicas de la inmunidad de células T en pacientes con CR.

Para probar si los países en desarrollo con lipofected RCC derivados de ARN podría reactivar CTLs específicos, hemos utilizado el tumor de células T específicas de clon, TIL-26 (GG), que es HLA-A2-restringida y específica para un TAA expresadas por RCC-26 células [14, 41]. Hemos podido demostrar que países en desarrollo con lipofected RCC-26-ARN derivados son muy competentes en la reactivación de estas células TIL-26. En cambio, los países en desarrollo transfectadas con RNA derivados de la RCC-53, una línea celular que no expresa este epítopo TIL-26, no están en condiciones de activar TIL-26 (GG) las células, lo que demuestra la especificidad de esta respuesta. Se encontró que el ARN-transfectadas variados países en desarrollo en su capacidad de restimulate TIL-26 células, con frecuencia son más débiles que los RCC-26 células tumorales. Hemos demostrado en otro lugar [36] que el ARN ha transferido una muy corta vida media en países en desarrollo a fin de que los péptidos de MHC presentación presumiblemente sólo estará disponible a partir de una ronda de la síntesis de proteínas. Variaciones de la reconstitución ligando en países en desarrollo con lo que se depende de la cantidad de ARN transferido a los países en desarrollo mientras que las células tumorales pueden generar nuevas transcripciones que puede ofrecer un suministro continuo de péptidos MHC para la presentación.

Otra importante característica del ARN funcional pulsátil países en desarrollo, a saber, su capacidad de las células T específicas principal de novo, también se ha demostrado en nuestros estudios. Encontramos que países en desarrollo con lipofected RCC-26-RCC-53 o derivado de RNAs son capaces de inducir las respuestas de células T específicas contra las correspondientes líneas de células tumorales. Fenotipo análisis de novo cebados poblaciones de células T reveló que figuran tanto CD4 + y células T CD8 +. Una mayor expansión de los linfocitos T CD8 + se produjeron durante restimulation, en última instancia, dando alterado CD4 + / CD8 + ratio en comparación con las poblaciones de linfocitos ingenuo de donantes sanos (datos no presentados).

Aunque, la in vitro de líneas de células T cebados mostraron algunos no MHC-actividad restringida contra NK-K562 sensibles o delicados-LAK células Daudi, sustancialmente más fuertes se detectaron respuestas específicas en contra de la línea celular cuyo ARN se utiliza para la cebado. En otros estudios, hemos demostrado que la no-MHC restringida células T y células NK pueden desempeñar un papel importante en la lucha contra la RCC inmunidad [61, 62]. Por lo tanto, consideramos que la inducción de estas células efectoras innata por las países en desarrollo a ser una ventaja.

Un aspecto crítico en la generación y caracterización de células T específicas es la necesidad de un número elevado de países en desarrollo para su uso como potentes vehículos blindados. Durante la generación de la RCC-53 específicos de la línea de células T, LCLs autólogas transfectadas con RCC derivados de ARN podría ser sustituido con éxito por restimulation como vehículos blindados, además de ser utilizados para la función y la especificidad estudios. Esto demuestra que el RNA-transfectadas LCLs podría proporcionar eficientemente pMHC ligandos de interés y, por tanto, ofrecía una alternativa de fácil acceso a los países en desarrollo cargados de ARN-. Sin embargo, hay que advirtió que podría sustituir LCLs países en desarrollo sólo después de las respuestas de células T específicas se ha desarrollado con el fin de evitar la reactivación de EBV de las células T específicas. Las culturas se pueden establecer las condiciones en virtud de la limitación de las diluciones con el fin de separar las células T con diferentes especificidades. Alternativamente, el uso de mini-VEB construcciones que codifican un número limitado de VEB proteínas, y aún conservan la capacidad de inmortalizar las células B, ofrece un elegante medios para reducir esta desventaja [63].

Un punto más decisivo en el análisis de las respuestas a una vacuna genérica basada en ARN total tumor autólogo LCLs es que puede proporcionar una herramienta muy útil para elucidar la multa especificidad de las respuestas de células T. Tras cargar con RNA, que pueden presentar tanto en epítopos de clase Iy clase II moléculas. Además, se puede LCLs transfectadas con cualquier TAA mRNA de interés, a fin de evaluar la aparición de TAA específicos de las células T después de la vacunación. Ensayos clínicos previos han indicado que, tras la vacunación de células T DC respuestas podrían ser detectados en contra de antígeno oncofetal [18, 19], la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT) [19] y G250/CA-IX antígenos [19]. Transfección de LCLs con estos ARNm codificación específica TAAs podría ser útil para la evaluación de las respuestas de células T específicas.

Dos GMP-certificada, ingeniería genética RCC-26 líneas celulares, RCC-26/B7.1/IL-2 y RCC-26/B7.1/IL-7, son estudiados actualmente en la fase I de ensayos clínicos [13, 23] . Estas líneas de células tumorales podrían fácilmente servir como fuentes de la calidad GMP-ARN para el desarrollo ulterior de la propuesta genérica DC enfoque basado en la vacuna. Las conclusiones relativas a la viabilidad, la toxicidad y el potencial de inducción de la autoinmunidad que salen de estos ensayos de fase I en curso también será útil para el diseño de un ensayo clínico sobre la base de ARN-cargado países en desarrollo. ARN generados por estos certificados GMP-RCC-26 líneas de células que codifican un conjunto de TAAs presente en las células del tumor. Por ejemplo, las dos variantes de la vacuna ha sido demostrada para mostrar la sobre expresión de PRAME, antígeno oncofetal, adipophilin y hTERT ARN's [23], todos los cuales se han encontrado a menudo que se sobre-expresan en tumores frescos y servir como objetivos para T Respuestas de la célula [11, 18 - 21, 64, 65]. Los instrumentos de vigilancia inmune específica para esas moléculas que resulte útil para la definición de las respuestas de células T que se desarrollan después de la vacunación de células tumorales también puede utilizarse para el análisis de las respuestas de células T específicas para la DC genéricos basados en la vacuna propuesto aquí. Como se desprende más información acerca de TAAs específicos que se pueden utilizar para orientar la respuesta inmune a la RCC, será posible el desarrollo de las vacunas se define basado en el uso de piscinas de la codificación del ARN seleccionado TAAs. Este enfoque ha sido recientemente descritas en el melanoma [35].

Conclusión

Describimos el caso de un DC basado en la estrategia para la vacuna contra la RCC pacientes utilizando una fuente genérica de ARN derivados de una línea celular tumoral caracteriza. Cuando los países en desarrollo derivados de HLA-A2-positivo donantes fueron cargados con tumor de células derivadas de la línea de ARN utilizando el método de lipofection, pudieron volver a activar la memoria CTLs efector-y también fueron capaces de cebado células T de novo para mediar citotoxicidad o Secretan citoquinas después del contacto con las células RCC. La disponibilidad de células certificado GMP-, que expresa una variedad de TAAs que son compartidas por muchos RCC y pueden proporcionar objetivo epítopos para células T permitirá a esta estrategia para ser más fácilmente adaptada para los ensayos clínicos. Además, la capacidad de carga de la línea de células tumorales derivadas de ARN en autólogo LCLs proporciona una herramienta útil para la vigilancia inmune.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

CG y AR desarrolló el ARN-cargados los países en desarrollo y realizado estudios funcionales, que analizó los datos y redactó el manuscrito.

AW llevado a cabo experimentos con el ARN-países en desarrollo cargados de novo priming de las células T.

ES indicación de la TIL-26 (GG) para la evaluación de las células efectoras de las respuestas de células T de memoria.

DJS estableció el RCC y TIL líneas, concibió la estrategia de la vacuna, participaron en el diseño y análisis de las experiencias y ayudó a redactar el manuscrito.

Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas de la alemana de Investigación (SFB 455) y el 6 º Programa Marco Europeo ( "Allostem" LSHB-CT-2004-503319). Damos las gracias a Miran Javorovic de asesoramiento sobre la preparación de in vitro-ARN transcrito, Anke Zobywalski de sugerencias sobre DC fenotipificación y Sabine Eichenlaub y Anna Brandl excelente para la asistencia técnica.