Archazolid y apicularen: Novela específicos V-ATPasa inhibidores

ATPases de tipo vacuolar (V-ATPases) son muy abundantes bombas de protones en el sistema de todos endomembrane células eucarióticas y en muchas de las membranas plasmáticas de células animales en el que dinamizar los procesos de transporte a través de la membrana o regular el pH de los compartimentos correspondientes [1]. Son heteromultimeric enzimas que consiste en una membrana obligado, de protones translocating V _o complejas y un catalizador V ₁ complejas que se orientan hacia el citosol. En los últimos años se hizo cada vez más evidente que el mal funcionamiento de la V-ATPasa se correlaciona con una multitud de enfermedades, como osteopetrosis, la infertilidad masculina o renal, acidosis [2 - 4]. Por lo tanto, la V-ATPasa, resultó ser un tema para la investigación biomédica e incluso fue considerado como un objetivo potencial para la quimioterapia del cáncer [5]. Con el fin de comprender el desarrollo de estas enfermedades y diseñar fármacos eficaces para su tratamiento, es necesario obtener un más amplio conocimiento del modo de acción de la enzima, así como de la V-ATPasa conocidos inhibidores por un lado, y, Por otra parte, a la búsqueda de nuevos inhibidores potentes y específicos con diferentes características de inhibición.

La mejor examinado y establecido V-ATPasa los inhibidores de la plecomacrolides bafilomycin [6] y concanamycin [7], que a la vez tenga efecto en las concentraciones nanomolar por su unión a la subunidad V _o c [8 - 10]. Recientemente algunos de los nuevos inhibidores de la V-ATPases como la benzolactone enamides [11] o chondropsines [12], se han descrito (revisado en [13]], pero hasta la fecha ningún caso en el sitio de unión se ha determinado. Sólo para el benzolactone enamide salicylihalamide se demostró que su lugar de unión es diferente a la de plecomacrolides [10] y pueden residir en algún lugar entre la V _o V ₁ y el complejo [14]. En el presente informe presentamos dos tipos de antibióticos producidos por myxobacteria, apicularens, nuevo benzolactone enamides [15, 16] y archazolids, una nueva clase de macrolactones [17], que ambos representan muy potente y específico V-ATPasa inhibidores, sin embargo, con Diferentes modos de acción y de diferentes sitios de unión.

La novela antibióticos archazolids y apicularens (Fig. 1] se contrastaron sus efectos en el crecimiento de las células de una variedad de líneas de células de mamíferos de diferentes tejidos (Tab. 1]. Para casi todos ellos se encontraron los valores de CI ₅₀ en el rango nanomolar, comparables con los valores de CI ₅₀ A concanamycin y bafilomycin A _1. Apicularen B fue la única excepción, con un valor promedio de CI ₅₀ dos órdenes de magnitud mayor. La inhibición del crecimiento de las células resistentes a varios línea KB-V1 también fue medido en presencia de verapamilo. Como este compuesto inactiva el Pgp bomba de salida, una comparación de los valores de CI ₅₀ obtenidos en la presencia y en ausencia de verapamilo puesto de manifiesto en qué medida los compuestos se bombea fuera de las celdas por el MDR1 Pgp. Los datos de la Ficha 1. Muestran, que a diferencia de la archazolids, la apicularens pobres son sustratos de la Pgp. Para visualizar el impacto de los antibióticos, PtK ₂ (potoroo riñón) las células fueron incubadas con inhibidores de la intacta y teñidas con ácido lisosomas (Fig. 2]. Evidentemente, en presencia de un apicularen y archazolid A, así como en la presencia de un concanamycin y de bafilomycin A ₁ (no se muestra), la tinción de rojo, que indica ácidas lisosomas, desaparecido en comparación con las células que no han sido tratados por las drogas. La misma observación se hizo con KB-3-1 células (datos no presentados). Estos resultados proporcionó a la primera indicación de que los nuevos antibióticos, como concanamycin o bafilomycin, están interfiriendo con la V-ATPasa, que es el obligatorio acidifier de lisosomas. A diferencia de las líneas celulares que figuran en el Tab. 1, el crecimiento de las células PtK ₂ no fue cesado por completo. Lo mismo ocurre con las células A-498 (carcinoma de riñón humano). Las dos líneas de células epiteliales similares a crecer. Obviamente, hubo reacción diferencial de las líneas celulares a la V-ATPasa inhibidores. A-431 para las células (humanas carcinoma epidermoide) una dependencia de la expresión del receptor de EGF fue demostrado [18].

Para comprobar nuestra hipótesis, hemos probado la eficacia de los inhibidores archazolid AyB, así como de apicularen AyB, en la V-ATPasa purificada holoenzyme de la midgut del tabaco hornworm. Como se muestra en la Fig. 3, ambos archazolids inhibe la enzima purificada de medio máximo a una concentración de ca. 20 nM, equivalente a un valor de la CI ₅₀ ca. 0,8 nmol por mg de proteína. Apicularen AyB inhibe la enzima purificada de medio máximo a concentraciones de aprox. 20 nM y 60 nM, respectivamente, equivalentes a los valores de CI ₅₀ ca. 0,8 nmol y 2,4 nmol por mg de proteína. Estos valores fueron inhibitorio en el mismo rango de concentración como los medidos para el plecomacrolides concanamycin A, bafilomycin A ₁ y B _1, y de la benzolactone enamide salicylihalamide que todos mostraron una inhibición media máxima a ca. 10 nM y una CI ₅₀ de ca. 0,5 nmol por mg de proteína [10]. Así, la novela compuestos son altamente eficaces inhibidores de V-ATPasa.

Estos hallazgos confirman nuestra hipótesis de que la inhibición del crecimiento y cambios morfológicos inducidos por archazolid y por apicularen se deben a su efecto inhibidor sobre la V-ATPasa. Apicularen B fue ligeramente inferior en comparación con los activos de otras drogas, pero la diferencia es mucho menor que el esperado de los ensayos de cultivo de células. Esta diferencia puede ser el resultado de una menor permeabilidad de la membrana de apicularen B debido a su adicionales N-acetil-β-D-glucosamina de residuos.

Si bien el macrolactones (archazolid A y B) y la benzolactone enamides (apicularen AyB, salicylihalamide) se mostraron como potentes inhibidores de crecimiento en cultivo de células de mamíferos, todos ellos no inhiben el crecimiento bacteriano, mientras que sólo archazolid mostró débil actividad frente a hongos; Además, la benzolactone enamide salicylihalamide inhibido eficazmente V-ATPases mamíferos, pero no en todos los V-ATPases de hongos, como Saccharomyces cerevisiae o Neurospora crassa [11, 15, 17]. Dado que el tabaco hornworm V-ATPasa es muy sensible a todos los antibióticos y las cantidades disponibles en miligramo, resulta ser un modelo apropiado para nuevas investigaciones sobre el mecanismo de inhibición por archazolid y la benzolactone enamides.

Habiendo demostrado la alta sensibilidad de la V-ATPasa a los dos nuevos antibióticos, también quiso estimar su efecto inhibidor de la F-tipo y P-ATPases. En varios cultivos de células de crecimiento fue inhibido en nanomolar concentraciones (véase más arriba). Por lo tanto hemos pedido, si una concentración de 1 μ M, que es bastante suficiente para eliminar el V-ATPasa actividad y que es claramente superior a los valores de CI ₅₀ en los experimentos de crecimiento, que también afectan a F-ATPases como la ATP-sintasa mitocondrial o P-ATPases como la membrana plasmática de Na ⁺ / K ^+-ATPasa. Por ello, hemos preparado membranas de las mitocondrias ricas en crudo corazón de ratón y submitochondrial partículas de carne del corazón, así como altamente purificada, Na ⁺ / K ^+-ATPasa de la membrana plasmática que contiene cerdo riñón, y probado potencial de los inhibidores de archazolid y apicularen. Para detectar F-ATPasa actividad que utiliza su inhibidores específicos, azida o oligomycin [19], y ouabain o vanadato se utilizaron como inhibidores específicos de la Na ⁺ / K ^+-ATPasa [20, 21]. Considerando que la actividad ATPasa en el ratón y los preparados de carne del corazón se redujo a valores de alrededor del 25% de las F-ATPasa o inhibidores de azida oligomycin, los nuevos antibióticos archazolid y apicularen así como los específicos establecidos V-ATPasa inhibidores concanamycin y la reducción de la bafilomycin Actividad sólo ligeramente a aproximadamente el 80% (Fig. 4]. Un aumento de la concentración de inhibidor a 10 μ M en archazolid y apicularen no tuvo efecto sustancial. Como se muestra en la Tab. 2, Na ⁺ / K ^+-ATPasa actividad fue completamente inhibida por 1 mM y vanadato por 1 mM ouabain, mientras que era sólo ligeramente afectado por apicularen A, y por archazolid A. Una ligera inhibición de tamaño comparable también fue Observó establecido para el inhibidor de la V-ATPases, concanamycin A, corroborando el hecho bien conocido de que los antibióticos plecomacrolidic empezar a inhibir P-ATPases a concentraciones en el rango micromolar [6, 7]. En conjunto con nuestros resultados y F-P-ATPases sugieren fuertemente que archazolid y apicularen son específicos inhibidores de V-ATPasa.

Para investigar el modo de V-ATPasa inhibición en más detalle, hemos utilizado la semi sintético derivado de concanamycin, 9 - O - [p - (trifluoroethyldiazirinyl) benzoil] ^{-21,23-dideoxy-23-[125} I] iodo-concanolide A (I-concanolide A, Fig. 1], que ya se había utilizado con éxito para identificar el sitio de unión de plecomacrolides en V-ATPases sin ambigüedades [10]. En nuestro estudio previo ha demostrado que la subunidad c V _o es la única subunidad de la V-ATPasa que estén etiquetados por I-concanolide A este etiquetado y que se podrían evitar por pre-incubación con la plecomacrolides concanamycin A, bafilomycin A ₁ Y B _1. Comparable en un experimento de la radiación UV-etiquetado de la subunidad c concanolide por I-A fue completamente abolida por pre-incubación con archazolid A (Fig. 5], lo que indica que plecomacrolides y archazolid A compartir, al menos parcialmente, el mismo sitio de unión en Subunidad C.

A diferencia de archazolid, la benzolactone enamide apicularen A no parece interferir con el etiquetado de la subunidad c concanolide Un derivado ya que la señal obtenida es casi tan fuerte como en el de control (Fig. 4]. Por lo tanto sugerimos que apicularen se une a un sitio que es en gran medida diferente de la de la plecomacrolides. Este resultado está de acuerdo con nuestra observación de que el ex benzolactone enamide salicylihalamide no se une a la subunidad c y apoya nuestra conclusión de que los sitios y mecanismos de inhibición para benzolactone enamides son diferentes de las de plecomacrolides [10].

La novela antibióticos archazolid y apicularen son muy eficientes y novedosos inhibidores específicos de V-ATPases. A pesar de las diferentes estructuras de archazolid y la plecomacrolides que probablemente tienen un modo similar de la inhibición y de sus sitios de unión en la V-ATPasa tener por lo menos un considerable solapamiento. En cambio, apicularen lo que demuestra la eficacia de inhibición de la misma no interfiera con concanolide I-A, sugiriendo un modo de inhibición diferente de la de la plecomacrolides.

El V-ATPasa holoenzyme fue purificado tal y como se publicaron en otra parte [10]. Preparación de membranas altamente purificada que contiene Na ⁺ / K ^+-ATPasa de riñón de cerdo seguido el protocolo de Jørgensen [22] con los tres principales pasos de centrifugación diferencial, la incubación con SDS en presencia de ATP y sacarosa densidad de centrifugación en un gradiente de ángulo fijo Rotor, y dio lugar a una determinada actividad de la enzima que se encuentra en el mismo rango que la de los autores. La muestra resultante se almacena congelada a -20 ° C. Para preparar extractos de crudo de membrana, los corazones de los tres animales fueron lavados tres veces con un helado buffer de pH 8,1 consistente en 0,25 M de sacarosa, 5 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 10 mM y Pefabloc SC (Biomol), homogeneizada En 5 ml de este buffer y se centrifuga a 4 ° C durante 25 min a 233000 × g _max en un rotor de ángulo fijo. El pellet resultante se resuspendió en 5 ml de un buffer de pH 7,5, que consta de 5 mM Tris-MOPS (ácido 3-morpholinopropanesulfonic), 10 mM NaCl, 10 mM Pefabloc SC, 9,6 mM 2-mercaptoetanol, 0,53 mM EGTA y 0,1% Triton X-100. Después de una alícuota para la determinación de proteínas se han adoptado, el 10% de albúmina sérica bovina (concentración final) se añadió a la suspensión que luego se almacena en hielo hasta que los ensayos de actividad se ejecute. Carne corazón mitocondrias se aislaron por centrifugación diferencial, siguiendo el protocolo de Smith usando una batidora para homogeneizar pelos en el corazón [23]. La homogeneización de amortiguación inicial constaba de 250 mM sacarosa, 10 mM KH ₂ PO _4, 10 mM Tris, 2 mM EGTA, 2 mM de MgCl _2, pH 7,4, y un mayor aislamiento procedimientos se llevaron a cabo en el mismo medio sin EGTA [24]. Submitochondrial partículas fueron obtenidos por ultrasonidos tratamiento de la mitocondria.

I-etiquetados concanolide A fue sintetizado como se describe en otro lugar [25]. Archazolid AyB, apicularen AyB, y concanamycin A bafilomycin A ₁ y B ₁ fueron aisladas de acuerdo a los procedimientos publicados [15 - 17, 26]. Con el fin de evitar los ciclos de congelación-deshielo, que tienen una influencia importante en la estabilidad de las sustancias, alícuotas de las soluciones stock en dimetil sulfóxido se almacenaron a -70 ° C, y sólo una vez descongelado inmediatamente antes de su uso. La concentración real de la población de soluciones se determina por espectrofotometría.

Standard V-ATPasa ensayos con un volumen final de 160 μ l y un pH de 8,1 constaba de 3-4 μ g de proteína, 50 mM Tris-MOPS, 3 mM 2-mercaptoetanol, 1 mM MgCl _2, 20 mM KCl, 0,003% C ₁₂ E _10, 20 mM NaCl, y 3 mM Tris-HCl. Después de 5 minutos de la pre-incubación a 30 ° C, con o sin inhibidores, 1 mM Tris-ATP fue añadido y después de una incubación de 2 minutos la reacción fue detenido por la colocación de tubos en nitrógeno líquido. Los ensayos con Na ⁺ / K ^+-ATPasa se realizaron en 160 μ l en pH 7,5 y 0,5 μ g contenidos de proteína, 50 mM Tris-MOPS, 5 mM imidazol, 0,2 mM EDTA, 4 mM MgCl _2, 20 mM KCl y NaCl 100 mM . Después de 5 minutos de la pre-incubación a 37 ° C, con o sin inhibidores, 3 mM Tris-ATP fue añadido y después de 1 min de incubación, la reacción fue detenido por la colocación de tubos en nitrógeno líquido. Los ensayos con membranas crudo corazón de ratón tenían un volumen de 160 μ l y un pH de 7,5, y constaba de 10 μ g de proteína de membrana, 50 mM Tris-MOPS, 3 mM 2-mercaptoetanol, 1 mM MgCl _2, 20 mM KCl, 100 MM NaCl, 0,02% Tritón X-100 y 0,3 mg / ml de BSA. Después de 5 minutos de la pre-incubación a 30 ° C, con o sin inhibidores, 1 mM Tris-ATP fue añadido y después de un tiempo de incubación de 10 minutos la reacción fue detenido por la colocación de tubos en nitrógeno líquido. ATPasa submitochondrial ensayos con partículas de la carne del corazón se realizaron en un volumen final de 1 ml y un pH de 8,0. Las muestras contenidas 9-12 μ g de proteína, 50 mM Tris, 50 mM KCl y 2,5 mM de MgCl _2. Después de 5 minutos de preincubación con o sin inhibidores, 5 mM ATP fue añadido, y después de un nuevo tiempo de incubación de 15 minutos se detuvo la reacción mediante la adición de 0,4 ml de TCA 20%.

Fosfato inorgánico producidos en el análisis de la V-ATPasa, Na ⁺ / K ^+-ATPasa y el ratón corazón F-ATPasa se midió según el protocolo de Wieczorek et al. [27], mientras que la determinación de fosfato inorgánico producidos en el sector de la carne el corazón de ensayos de F-ATPasa seguido el método de Fiske y Subarrow [28] con ácido ascórbico como agente reductor.

Veinte microgramos de la validez de las muestras fueron incubadas con inhibidores de la 1 h sobre hielo. La etiqueta I-concanolide A continuación se añade para dar una concentración final de 10 μ M. Los controles se ejecute sin efectores. Mezclas con volúmenes de 40 μ l se incubaron por un período adicional de 1 h en hielo y luego tratados durante 3 min con luz ultravioleta (366 nm) en hielo. Después de la irradiación UV, 10 μ l de 5 veces muestra buffer [10] se añadió, la mezcla se calienta durante 45 s a 95 ° C, enfriado en hielo, y sometidos a Tricine-SDS-PAGE (16,5% T, 3% C La separación de gel y el 10% T, 3% C spacer gel [29]], seguido por la tinción de Coomassie. Los geles fueron selladas en plástico antes de ser expuestos a un phosphoscreen para un máximo de 72 horas y se analizaron con la ayuda de un phosphoimager (Molecular Dynamics).

Líneas celulares se obtuvieron de la Colección de Microorganismos alemán y de células de las Culturas (DSMZ). 3Y1 líneas celulares y M1 (embrional fibroblastos de 129/Ola × C57BL / 6 ratones, [30]] fueron un generoso regalo del doctor S. Miyamoto, Fukoka, Japón, y el doctor PF Mühlradt, Braunschweig, Alemania. Todas las líneas de células fueron cultivadas en las condiciones recomendadas por el proveedor. La inhibición del crecimiento se mide en microtiterplates. Alícuotas de 120 μ l de la suspensión de células (50000/ml) a 60 μ l de una serie de la dilución del inhibidor. Después de 5 días, el crecimiento se determinó utilizando el MTT ensayo [31].

PtK ₂ (ATCC CCL-56) o KB-3-1 células fueron cultivadas en coverslips de vidrio (13 mm de diámetro) en cuatro placas bien. Exponencial creciente células fueron incubadas con los inhibidores de 4 horas y teñidas con lisosomas con 50 nM LysoTracker Roja DND-99 y de las mitocondrias con 75 nM MitoTracker Verde FM (ambos de sondas moleculares) a 37 ° C durante 30 min. Los núcleos se tiñeron utilizando Hoechst 33258 (5 μ g / ml). El coverslips fueron montadas al revés en PBS, fijo con esmalte de uñas, y observó bajo el microscopio de fluorescencia.

Quinto estadio las larvas de M. Sexta (Lepidoptera, Sphingidae), 6-8 g de peso, fueron criados bajo condiciones de día largo (16 h de luz) a 27 ° C utilizando una dieta sintética modificadas de acuerdo a Bell et al [32].

MH purificada la V-ATPasa y de la Na ⁺ / K ^+-ATPasa, llevó a cabo la enzima y el etiquetado ensayos, y redactó el manuscrito. FS hizo la fermentación de la archazolids y llevó a cabo los estudios de cultivo de células. BK hizo la fermentación de la apicularens y probado F-ATPasa actividad en el sector de la carne corazón mitocondria. RJ apicularens aislados. HS archazolids aislados. GI y la plecomacrolides AZ purificado y sintetizado la I-concanolide A. HW participado en la concepción y diseño del estudio y redactó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.