Cancer Cell International, 2005; 5: 23-23 (más artículos en esta revista)

Terapéuticas sobre campos electromagnéticos (TEMF) y la radiación gamma sobre el cáncer de mama humano xenoinjertos crecimiento, la angiogénesis y la metástasis

BioMed Central
Ivan L Cameron (cameron@uthscsa.edu) [1], Lu-Sun Zhe (sunl@uthscsa.edu) [1], Nicholas corto (nshort@rice.edu) [1], W Elaine Hardman (hardmawe @ pbrc. Edu) [2], C Douglas Williams (dwilliams@bouldincorp.com) [3]
[1] Departamento de Biología Estructural y Celular de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio, 7703 Floyd Curl Drive, San Antonio, Texas 78229, EE.UU.
[2] Centro de Investigaciones Biomédicas de Pennington, Lousiana State University, 6400 Perkins Road, Baton Rouge, Louisiana 70808, EE.UU.
[3] EMF Therapeutics, Inc., P.O. Box 679, Signal Mountain, Tennessee 37377, USA

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Resumen
Antecedentes

Los efectos de un rectificado semi-sinewave señal (15 mT amplitud, 120 pulsos por segundo, EMF Therapeutics, Inc) (TEMF) solo y en combinación con radiación gamma (IR) en ratones desnudos teniendo un humano MDA MB231 xenoinjertos de cáncer de mama Se pusieron a prueba. Proteína de fluorescencia verde transfectadas las células del cáncer se inyecta en la almohadilla de grasa mamaria de ratones jóvenes. Seis semanas después, los ratones fueron divididos aleatoriamente en cuatro grupos de tratamiento: los controles no tratados, 10 minutos diarios TEMF; 200 cGy de IR cada dos días (total 800 cGy); IR más el diario TEMF. Algunos ratones en cada grupo fueron sacrificados 24 horas desde el final de la IR. TEMF tratamiento continuado durante 3 semanas adicionales. Tumor secciones fueron teñidas con: las células endoteliales con CD31 y PAS o hipoxia inducible factor 1 α (HIF).

Resultados

La mayoría de los tumores <35 mm 3 eran blancos, pero los tumores> 35 mm 3 son de color rosa y tenía una cápsula vascularizada. La corteza de 100 micrones de la cápsula había poca vascularización. Los vasos sanguíneos, capilares, y endoteliales pseudopods fueron encontrados en la> 100 micras de la cápsula (subcortex). Tumores> 35 mm 3 tratados con 24 horas antes de infrarrojos o con TEMF habían disminuido los vasos sanguíneos en el subcortex endotelial pseudopods y más en la proyección de hipoxia, HIF zonas de tumores positivos del grupo de control. Los ratones que recibieron ya sea IR o TEMF había un número considerablemente menor de metástasis pulmonares y de los sitios más lento el crecimiento del tumor superior que los ratones no tratados. No hay efectos secundarios perjudiciales se atribuyeron a TEMF.

Conclusión

TEMF terapia siempre un método seguro para retardar la vascularización del tumor, el crecimiento y metástasis.

Antecedentes

Publicados anteriormente en un informe de investigación experimental, se constató que expondría a un adenocarcinoma mamario murino trasplantable a un 15 mT EMF dado a 120 pulsos por segundo durante 10 minutos por día redujo significativamente el crecimiento del tumor y la vascularización y traducido en un aumento del tiempo de supervivencia [1] . Este informe publicado parece ser la única literatura disponible sobre el uso de campos magneticos pulsantes para reducir la angiogénesis tumoral. Los autores de este informe sugiere que el campo magnético de tratamiento utilizado actuado para reducir la angiogénesis tumoral y podrían tener valor como alternativa modalidad terapéutica para el tratamiento de los pacientes con tumores. El estudio informó aquí fue diseñado para investigar más a fondo el potencial de la misma EMF terapia para inhibir el crecimiento y la angiogénesis de un humano xenoinjertos de cáncer de mama y comparar los efectos de: 1) un curso de uso de la irradiación gamma (IR) que impliquen una exposición a 200 CGy cada dos días por un total de 800 cGy, 2) exposición diaria a TEMF, y 3) una combinación de estos dos regímenes de tratamiento terapéutico en el crecimiento tumoral, la angiogénesis tumoral, metástasis tumoral, y de los efectos secundarios de cada tratamiento. A pesar de que este estudio utilizó todo el cuerpo IR terapia, la mayoría de infrarrojos terapia de los pacientes humanos se limita a regiones localizadas del cuerpo general de evitar efectos secundarios de los tratamientos de infrarrojos. La MDA MB231 cáncer de células transfectadas con línea y expresar una proteína verde fluorescente (GFP) de genes se utiliza para facilitar el estudio de las metástasis de las células cancerosas en el sitio del tumor primario [2].

Nuestro estudio resultados demuestran el potencial de la terapia para retrasar TEMF tumor: crecimiento, la angiogénesis y la metástasis, sin efectos secundarios perjudiciales.

Resultados
Peso corporal

Una vez que los ratones se dividieron en grupos de tratamiento el peso corporal de cada ratón se midió cada 3 a 4 días para el resto de la prueba. Como se ilustra en la Fig. 1, los dos grupos que recibieron la terapia de IR cada segundo día durante 8 días demostraron una media de pérdida de peso corporal durante el inicio de terapia IR y duradera hasta unos 8 o 9 días después del final de la terapia de infrarrojos. Tras la finalización de la terapia de infrarrojos, los ratones irradiados de nuevo comenzó a recuperar su peso hacia el medio de peso de los dos grupos de ratones no sometidos a la terapia de infrarrojos. El grupo de ratones que recibieron sólo terapia EMF demostrado un continuo aumento de la media de peso corporal similar en el grupo de ratones dado ningún tratamiento.

El crecimiento del tumor

Fig. 2 ilustra significa cambiar el volumen de los tumores de cada uno de los cuatro grupos de tratamiento a partir del principio de IR y / o terapia de los CEM. Todos los tumores de la terapia en cada grupo fueron menos de 35 mm 3 al inicio del período de tratamiento. Para evaluar estadísticamente la tasa de crecimiento del tumor, los datos de cada tumor en cada grupo de ratones fue sometido a análisis de regresión lineal. El volumen de los tumores dio un buen ajuste a un modelo de regresión lineal. La pendiente (tasa de crecimiento) derivados de la regresión lineal de cada volumen de los tumores se utilizó para determinar las diferencias estadísticas en las tasas de crecimiento entre los grupos de tratamiento (Fig. 2]. Tasa de crecimiento de los tumores del grupo sin tratamiento fue significativamente más rápida (p <0,001) que cualquiera de los tres grupos de animales tratados. La tasa de crecimiento del tumor el grupo de ratones tratados únicamente con terapia CEM fue significativamente inferior a la tasa de crecimiento del tumor el grupo sin tratamiento. El tumor de las tasas de crecimiento de los dos grupos de ratones tratados con irradiación gamma fueron significativamente inferior a la tasa de crecimiento del tumor sin tratamiento o la TEMF sólo dos grupos de tratamiento.

Los resultados de una evaluación de las tasas de crecimiento del tumor el día 7, aunque el día 15 post tratamiento IR son presentados en la Fig. 3. Como se ilustra en la Fig. 3, la media de la tasa de crecimiento del tumor de ratones dado ni IR ni TEMF tratamiento fue significativamente más alto que los tres grupos de IR y dado TEMF terapia sola o en combinación. El grupo de ratones dado tanto IR y TEMF seguido de TEMF diario había una media de la tasa de crecimiento del tumor significativamente más bajo que el de los otros tres grupos. Es evidente que la continuación de la aplicación de la terapia diaria TEMF siguiente IR terapia había un aditivo efecto inhibidor sobre el crecimiento del tumor durante la tasa de 7 a 15 días después del curso de la terapia de infrarrojos.

Vasculatura tumoral

Mientras que las mediciones sobre el volumen de los tumores, se observó tumor de color a través de la piel de los ratones nude. Después de registrar color y el volumen tumoral de cada ratón, se puso de manifiesto que los tumores más pequeños eran blancos, mientras que los grandes tumores eran de color rosa. Fig. 4 ilustra la relación entre el color y el tumor de volumen de los tumores. Casi todos los tumores de menos de 35 mm 3 fueron en blanco mientras que los tumores mayores que aproximadamente 35 mm 3 fueron en color rosa. Aplicación de la presión de un dedo de la rosa a un tumor seguida de la rápida eliminación de la presión con el dedo mostró un rápido cambio de color del blanco al rosado.

El examen histológico de midsections PAS manchadas de tumores se realizó para evaluar los patrones de vascularización del tumor. Los tumores con un volumen> 35 mm 3 demostrado una cápsula de tejido conectivo con vasos sanguíneos (Fig. 5A]. Un aumento mayor en el área cortical en los cerca de 100 μ m de la cápsula reveló algunos vasos sanguíneos mientras que el área mayor de 100 μ m de la cápsula mostró evidencia considerable de los vasos sanguíneos y capilares con muchos endotelial pseudopods extender fuera de los capilares (Fig. 5B y 5C ). La dirección general de la pseudopods fue paralelo a la superficie de la cápsula tumoral. Localización inmunohistoquímica de CD-31, utilizado como un marcador específico del endotelio, demuestra una reacción positiva de pseudopods (Fig. 5D]. Las áreas de necrosis tumoral se observaron, por debajo de la zona subcortical (Fig. 5E y 5F]. Inmunohistoquímica localización de hipoxia-inducible factor 1 - α (HIF) revela subcortical la zona del tumor para contener HIF positivo mientras que el tumor de células de la cápsula, corteza y áreas necróticas del tumor demostrar ninguna evidencia de HIF. Así, la zona que se encuentra HIF positivos fueron enriquecidos en pseudopods endotelial.

Ocular red interceptar couting se utilizó para cuantificar la vascularización del tumor en 8 μ m de espesor PAS manchadas histológicos de los tumores. Los números de red intercepta ocular se anotó sobre la zona de: vasos sanguíneos y capilares, pseudopods endoteliales y más de la zona sin que haya indicios de estas estructuras. Este método ha demostrado ser una útil medida de la densidad de volumen ocupado por las estructuras reconocibles. Los resultados de la puntuación de los vasos sanguíneos y de pseudopods endotelial en la regiones subcorticales de los tumores se resumen en la Fig. 6A y 6B. El análisis estadístico de la media de los vasos sanguíneos frente a la densidad de volumen pseudopod volumen revela una significativa densidad exponencial coeficiente de correlación de 0,966. Por lo tanto, como la densidad de los vasos sanguíneos disminuyó de volumen, la densidad endotelial pseudopod volumen aumentado. Como se ilustra en la Fig. 6A y 6B, IR resultó significativamente en la reducción de la densidad de los vasos sanguíneos volumen, pero un aumento significativo del volumen en la densidad de pseudopods un día después de la última dosis de irradiación, pero la densidad de los vasos sanguíneos, aumento de volumen y la densidad de pseudopod volumen disminuyó a El nivel del control no tratado por 22 días después de la última dosis de irradiación. Sin embargo, los grupos de ratones tratados únicamente con EMF ha significativamente menor densidad de los vasos sanguíneos y un volumen significativamente mayor volumen pseudopod densidad a un día después de la final de IR. La baja densidad de los vasos sanguíneos y el volumen pseudopods de alta densidad en el volumen de los tumores de los ratones tratados CEM sigue siendo el mismo a los 22 días después del final de la IR tratamiento.

Metástasis

El número de metástasis pulmonares colonias por ratón en cada uno de los cuatro grupos de tratamiento se resume en la Fig. 7. Tanto el número medio de colonias en los pulmones por el ratón, así como la incidencia de metástasis fue significativamente mayor en el grupo sin tratamiento que en los tres grupos tratados con IR y / o terapia de los CEM. No se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de tratamiento en número o en la incidencia de metástasis pulmonares colonias por ratón.

Efectos secundarios de la terapia de irradiación de rayos gamma y de la terapia TEMF

Los ratones fueron sacrificados a los dos en un día y 22 días después de la última exposición de infrarrojos. Los datos sobre el hígado y el bazo pesos se resumen en la Tabla 1, y los datos sobre los recuentos sanguíneos se resumen en la Tabla 2. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de tratamiento en el promedio de peso del hígado en la anterior o posterior mata. Por otra parte, el bazo de ratones pesos que fueron sacrificados un día después de su última exposición a la IR fue significativamente menor que el bazo no ponderaciones de los grupos de rayos gamma irradiados. La media del bazo ponderaciones de los ratones IR recuperado al nivel de los grupos no tratados por 22 días después de su última exposición de infrarrojos. No hubo pérdida significativa de peso bazo en el momento de la primera o en el momento de la tarde debido a la eutanasia TEMF terapia.

Hubo una disminución significativa en el recuento de leucocitos, glóbulos rojos, plaquetas y los cargos atribuidos a la exposición a la irradiación gamma de 1 día después del final del tratamiento de radiación (Cuadro 2]. No hubo diferencias significativas en el recuento de leucocitos, glóbulos rojos, plaquetas y los cargos atribuidos a TEMF tratamiento. En 22 días después del final de la IR tratamiento, el recuento de leucocitos y glóbulos rojos en cuenta los dos grupos de infrarrojos no es tan baja, pero sigue siendo significativamente más baja que en los dos grupos no irradiado mientras que el IR grupos de plaquetas significativamente mayor que cualquiera de Los otros grupos. Evidentemente, plaquetas han hecho una importante rebote compensatorio por 22 días después del final de la terapia de infrarrojos. El análisis estadístico de los micronúcleos cuenta indica que no hay daño genotóxico significativo debido a uno de los tratamientos ya sea en el momento de la eutanasia.

Otra medida de lo posible los efectos secundarios fue el marcador de la actividad mitótica en las criptas duodenales. Fig. 8 resume los resultados de la actividad mitótica en las criptas duodenales de ratones sacrificado un día después de la final de la terapia de infrarrojos. Los dos grupos de ratones tratados con IR 24 horas antes había una cantidad significativamente menor de metafase por cripta cifras que el grupo no tratados o en el grupo de ratones tratados únicamente con el curso de la terapia TEMF.

Todos los ratones tratados con IR demostrado un bronceado la piel inmediatamente después de los 8 días de curso de la terapia de infrarrojos, pero el color de la piel bronceado regresó a la normalidad el color de la piel en 22 días después del curso de la terapia se ha cerrado de IR. El color de la piel en los dos no irradiado grupos de ratones normales en apariencia se mantuvo a lo largo del curso del estudio.

Discusión
En la vascularización tumoral

La localización inmunohistoquímica de la hipoxia inducida por el factor (HIF) en los tumores ayuda a explicar el patrón vascular de los tumores encapsulados. El HIF reactividad positiva en el tumor fue localizado a las áreas subcorticales del tumor en la misma zona han encontrado a la mayoría de los vasos sanguíneos, capilares y pseudopods. Estas observaciones sugieren que esta zona subcortical del tumor es de hipoxia conduce a la producción de la angiogénesis en los factores de crecimiento, que a su vez actúa en las células endoteliales de acogida de brotar pseudopods. Brotes de células endoteliales cultivadas en respuesta a factores de crecimiento endotelial vascular se sabe que se producen [4]. Feraud et al. También informó de que esta célula endotelial de brotes podría ser inhibido por varios agentes angiostatic. La presencia de estructuras pseudopodal como viable en zonas de un tumor inmediatamente adyacentes a las áreas necróticas del tumor se ha informado anteriormente [5]. La falta de HIF reactividad en la zona cortical debajo de la cápsula bien vascularizada tumor cortical sugerir esta zona no es de hipoxia y que no necesitan de un amplio vasculatura. Parece que el PSA tinción de las células endoteliales en la brotación pseudopods tumores da cuantificables sobre la información espacial en donde el tumor que HIF y factores de crecimiento endotelial vascular se encuentran.

Acción de IR y de los CEM terapias

EMF ha informado de la terapia para frenar el crecimiento del tumor y la angiogénesis tumoral y de aumentar el tiempo de supervivencia de ratones con tumor [1]. Un experimento se diseñó para probar si la terapia de combinación de IR y CEM terapia en un modelo de ratón con tumor podría dar un adictivo índice terapéutico.

Más de la mitad de todos los pacientes con cáncer se dan las radiaciones ionizantes (IR) durante el ciclo de tratamiento [6]. Las interacciones entre IR y vascularización tumoral son complejas [7, 8]. Se ha demostrado que la terapia de IR depende de la vascularización tumoral y que inicialmente terapia IR interfiere con vascularización tumoral conduce a la hipoxia tumoral [9]. Sin embargo hipóxico zonas son resistentes a la radio hasta que puedan inducir la angiogénesis y re-oxigenación. Hipóxico zonas de producir tumores HIF conduce a la producción de la angiogénesis en los factores de crecimiento, que estimulan la angiogénesis a que se continúe el crecimiento del tumor. Esta secuencia de acontecimientos conocidos a raíz de un tratamiento IR tumorales de un paciente ha llevado a la utilización combinada de terapia IR junto a la utilización de un agente anti-angiogénesis. Al bloquear los factores angiogénicos, como el VEGF, y por el bloqueo de la formación de nuevos vasos en combinación con terapia IR investigadores han aumentado notablemente la eficacia de la terapia de infrarrojos en varios tipos de tumores [7 - 9]. El uso de agentes anti-angiogénicos ha demostrado ser útil en el tratamiento del cáncer de progresión en la mayoría de los ensayos preclínicos y clínicos [10, 11]. Sin embargo, la prevención de la metástasis (Inoue et al.) Por agentes anti-angiogénicos [11, 12] no ha ido sin [[13] y ver refutación por Kieran et al. [14]].

Los resultados experimentales indican que la terapia, ya sea IR o EMF terapia reprimido el crecimiento del tumor. El IR demostrado ser la terapia más eficaz a suprimir el crecimiento tumoral que hizo el EMF terapia mientras que el IR terapia, pero no tuvieron la EMF efectos secundarios perjudiciales. Ambos IR terapia y terapia EMF reducido volumen densidad de los vasos sanguíneos dentro del tumor cuando se mide un día después de la final de la terapia, pero IR volumen densidad de los vasos sanguíneos en los tumores de los ratones tratados IR regresado a los niveles pre IR tratamiento. La continua utilización de la terapia diaria EMF en el IR ratones tratados no reprimir el regreso de los vasos sanguíneos dentro de la densidad de volumen del tumor después de la terapia de infrarrojos. La combinación de ambas modalidades terapéuticas, por lo tanto, llevó a una reducción significativa y sostenida en la medida en tumor de los vasos sanguíneos de la densidad de volumen.

Pseudopod que la densidad de volumen es relativamente elevado en el 22 día después de IR en el grupo de ratones que se han sostenido sobre la terapia diaria EMF sugiere que las principales áreas de estos tumores y, por tanto, se anóxica HIF y se producen como consecuencia del VEGF en la brotación de las células endoteliales pseudopods. Esto indica que estos primeros eventos en el proceso de la angiogénesis no fueron reprimidas por la continuación del uso de la terapia EMF. Dado que el uso continuado de los CEM hizo reprimir tumor volumen densidad de los vasos sanguíneos a 22 días después de la EMF de infrarrojos terapia terapia puede actuar para reprimir una de más de los pasos más adelante en el proceso de vascularización del tumor, tales como: la proliferación de las células endoteliales, lumen formación, la generación de Vasculares y de los tubos de inicio de la circulación de la sangre [15].

Como se ilustra en la Fig. 6A, el continuo uso diario de TEMF siguiendo el curso de la terapia IR reprimidas tumor volumen densidad de los vasos sanguíneos en comparación con ratones dado el IR solo. Los datos sobre la tasa de crecimiento del tumor, a partir de una semana después de la terapia de infrarrojos, reveló que la continuación de la terapia TEMF suprimida la tasa media de crecimiento tumoral de los tumores en comparación con los de los ratones tratados sólo con terapia de infrarrojos. De hecho, el análisis de regresión lineal de los datos indica que la pendiente de la tasa de crecimiento del tumor, del RE TEMF además de los animales tratados no difieren de una pendiente de cero. Así, la tasa de crecimiento del tumor estos resultados indican una importante ventaja para el tratamiento diario continuo TEMF la terapia después de un curso estándar de la terapia de infrarrojos.

Dado el grado de vascularización del tumor ha sido positiva vinculada a la probabilidad de metástasis de las células del tumor [12, 16 - 18] se prevé que la disminución de la densidad de volumen de los vasos sanguíneos en el tumor, como se observa en los experimentos informó aquí, disminuiría La posibilidad de que las células tumorales a metástasis a áreas distantes en el tumor teniendo ratón modelo utilizado en el estudio. Inspección de la incidencia de metástasis en los pulmones observado del cáncer de mama humano xenographs reveló: IR terapia que reduce las metástasis en un 49%, que solo EMF metástasis reducido en un 54% mientras que la combinación de IR y CEM terapias cuando seguida de la terapia diaria CEM Dio lugar a un 73% de reducción en la incidencia de metástasis a pulmón. Aunque todos los tres de estos regímenes de terapia causado una disminución significativa en la incidencia de metástasis de las células tumorales a los pulmones la mayor disminución, aunque no estadísticamente significativa, fue con la combinación de terapias de IR y CEM.

En resumen los resultados indican que la terapia EMF sostenido por sí reducido: en la medida en tumor de los vasos sanguíneos de la densidad de volumen, la tasa de crecimiento del tumor y la metástasis de las células tumorales a los pulmones, sin efectos secundarios perjudiciales. TEMF solo puede ser una alternativa útil para la terapia de pacientes con cáncer que deciden no someterse a la radiación o de quimioterapia. El IR sola reducido notablemente: la tasa de crecimiento del tumor, la reducción de la metástasis tumoral, pero sólo transitly tumor reducido volumen densidad de los vasos sanguíneos. El IR terapia Sin embargo, tienen efectos secundarios perjudiciales. Estos efectos adversos pueden ser minimizados por la exposición dirigida IR. La combinación de terapia y continuó IR TEMF terapia notablemente reprimida el regreso de los vasos sanguíneos de volumen y densidad de crecimiento del tumor después de la terapia de infrarrojos y ha dado lugar a la menor incidencia de la metástasis tumoral. Así, estos hallazgos apoyan las ideas que TEMF del tipo utilizado en este experimento puede ser una terapia eficaz antiangiogenic y que una combinación de un anti-vascular modalidad, como TEMF, con infrarrojos terapia puede mejorar el índice terapéutico de la terapia para el cáncer de infrarrojos.

Materiales y métodos
Animales

Mujeres athymic nude mice (comprados en Harlan Sprague Dawley, Inc, Indianapolis, IN), de 6 semanas de edad, se utilizaron para este estudio. Los animales fueron alojados bajo condiciones libre de agentes patógenos y alimentaron una AIN-76 semipurified dieta ligeramente modificado para contener un 10% w / w de aceite de maíz.

Cell Lines

Humanos línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 se obtuvo de la American Type Culture Collection. Para determinar el efecto de los tratamientos sobre el potencial metastásico de la MDA-MB-231 células fueron transfectadas establemente con la mayor expresión plásmido GFP, pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, Inc). La expresión de las buenas prácticas agrarias para permitir la detección de micrometastatic colonias en todo el aplanado pulmones con un microscopio de fluorescencia epilumination. Las líneas de células se cultivaron en McCoys del 5A suplementado con piruvato, vitaminas, aminoácidos, antibióticos, y el 10% de suero fetal bovino [2]. HDMECs y el medio de cultivo EGM Mv-2 se mantuvieron a 37 ° C en una incubadora humidificado con 5% de CO 2.

El crecimiento tumoral in vivo

Las células fueron cosechadas MDA-MB-231/GFP exponencial de las culturas y las inoculadas en el 2 × 10 6 células / inóculo en la almohadilla de grasa mamaria inguinal área de las mujeres athymic nude mice, 6 semanas de edad. Cuando el tumor creció a un promedio de diámetro de alrededor de 3 mm después de 5 semanas, los ratones fueron divididos en 4 grupos de tal manera que la media y la mediana del volumen de los tumores de los cuatro grupos fueron acompañadas de cerca. El crecimiento de cada xenoinjertos fue supervisado por el exterior medición de los tumores en tres dimensiones utilizando calibradores digitales de 3 veces por semana. Xenoinjertos de volumen (V), se determinó mediante la siguiente ecuación: V = (L W × 2) × 0,5, donde L es la longitud y W es el ancho de un xenoinjertos.

Irradiación Gamma (IR) Terapia

Ochenta tumor-teniendo ratones recibieron una dosis acumulativa de 800 cGy de IR (200 cGy cada tercer día durante 4 ciclos). Los 200 cGy / día, la dosis se basa en los resultados preliminares de un estudio dosis-respuesta utilizando el mismo modelo de ratón y en el hecho de que 180 a 250 cGy / día es de uso común la dosis aguda de la radioterapia de los seres humanos. Acerca de 815 cGy de irradiación corporal es la LD50/30 para ratones (50% letal dentro de los 30 días). Los ratones fueron irradiados en un 137 Cs Cell Gamma-40 Irradiator (de la Energía Atómica de Canadá) en la instalación de nuestro Departamento de Radiología. Dosimétricas para el análisis de este instrumento se realiza mensual para el cálculo de una precisa exposición de 200 cGy. Los animales fueron trasladados a una jaula circular con compartimentos individuales para cada ratón durante la irradiación. Los ratones fueron sacrificados en un día o 23 días después del último tratamiento de radiación. La sangre periférica, duodeno, pulmones, el hígado, el bazo y el tumor se ha cosechado para el análisis y los cuerpos congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -20 ° C para su posterior análisis de la metástasis.

Campo magnético de la terapia

Un campo electromagnético terapéutico (TEMF) tener un sistema de propiedad señal ideado por EMF Therapeutics, Inc (Chattanooga, TN, EE.UU.) se utilizó. El sistema genera un medio palpitante sinewave campo magnético con una frecuencia de 120 pulsos por segundo [1]. Elipsoidales con una bobina de 21 "eje mayor y 14" eje menor fue utilizada para generar el campo magnético. En el experimento informó aquí, la densidad de flujo magnético medido en la sala de exposición fue de 15 mT. Este valor de densidad de flujo del campo magnético se ha elegido, basado en nuestra experiencia previa y los datos [1]. Una minuciosa 3-D de la cartografía de campo magnético se realizó para todo el espacio cubierto por la bobina. La densidad de flujo del campo magnético en la cámara de la exposición (25 cm de largo, 10 cm de ancho y 13 cm de alto) fue coherente dentro de todo el volumen de la cámara. Las paredes de la sala de exposición fueron perforados para permitir el intercambio de aire y de limitar el cambio de temperatura en el interior de la cámara durante la exposición TEMF tratamiento fue de menos de 1 ° C.

La eutanasia y la manipulación de tejidos

Los ratones fueron profundamente anestesiados utilizando una ketamina / rompun mezcla preparada por el UTHSCSA veterinario de animales de laboratorio, cervically dislocada, y luego se exsanguinated por punción cardiaca. La sangre fue recogida en un microtube que contiene EDTA para sanguíneos completos.

El tumor, duodeno, hígado y bazo fueron retirados en el momento de la eutanasia mientras que el canal (incluyendo los pulmones) se ha congelado y almacenado a -20 ° C para su posterior análisis. Las secciones del duodeno, el tumor, y un lóbulo del hígado fueron fijadas en Omni Fix II (Mt Vernon NY) y embebidos en parafina. Embedded tejidos se cortaron 4 μ m u 8 μ m de espesor, cortar secciones se colocaron en el microscopio entonces deparafinized y teñidas con hematoxilina y eosina o con ácido periódico de Schiff (PAS) para el análisis morfológico. Secciones adicionales fueron preparados para inmunohistoquímica.

Metástasis estudios

Pulmones fueron eliminados de la descongelados en canal para examinar cualquier espontáneo metástasis. Los pulmones se colocaron en un 25 × 75 mm portaobjetos de microscopio luego rompieron con una segunda diapositiva a una superficie de alrededor de 100 mm 2. Los pulmones se rompieron garantizado en la condición aplanado por rapping Magic cinta (Scotch) alrededor de cada final de la preparación rompieron pulmón. El GFP-expresando cáncer metastásico de células colonias, en su caso, fueron identificadas y contadas usando un microscopio de fluorescencia Zeiss (ET-200) con un 3,5 × 10 × y un objetivo. GFP micrometastatic parcelas con tres o más células fue evaluado como positivo. No hay grandes sitios de metástasis se observaron en los pulmones.

Tumor Vascularity

Para determinar el efecto del tratamiento sobre la angiogénesis del tumor, que mide la vascularización de los tumores extirpados. Tumor de los tejidos y se fija incrustada en parafina. Mediados tumor secciones de 8 μ m fueron cortadas de los tejidos incrustados y teñidas con ácido periódico de Schiff (PAS). Las secciones fueron examinadas por microscopía de luz. CD31 inmunomarcación para ratón vasos sanguíneos se realizó por secciones incubando tumor con una rata antimouse CD-31 (PECAM-1) anticuerpo monoclonal (PharMingen) a los 5 μ g / ml durante 30 minutos a 37 ° C. Las secciones fueron incubadas con un biotina-etiquetados cabra antirat IgG (Zymed; dilución 1:200) por 30 min a temperatura ambiente, seguida de ABC kit de reactivos (Vector Laboratories) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Color de reacción se realizó con 3, 3'-diaminobenzidine (Vector Laboratories) y counterstained con hematoxilina. Hypoxia-inducible factor-1 alfa inmunohistoquímica se realizó después de la instrucción para la recuperación de antígeno (Biogenex protocolo) y iso-IHC (inno-Genex Mouse-on-ratón iso-kit IHC) con estos cambios: Dewaxing fue con 3 cambios de xileno, 10 minutos / cambio. Rehidratación en el 100%, 90% y 70% de etanol, 10 minutos cada una. La dilución inicial de los anticuerpos se 1:200. Antibody: Stressgen anti-HIF-1 alfa, producto # OSA-601. Todas las secciones fueron codificados, entonces tratadas como superiores y en la medida de los vasos sanguíneos, las células endoteliales pseudopods superficie total y densidad de volumen se anotó utilizando una rejilla ocular. El número de línea de la cuadrícula, intercepta más de los vasos sanguíneos y endoteliales pseudopods dio una medida de la densidad de volumen total de estas estructuras.

Los ensayos a realizar
Completa y diferencial de células sanguíneas

Un contador de células de sangre con envase veterinaria se utiliza para la cuenta de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas en la sangre anticoagulada EDTA de los ratones. Nuestro Laboratorio de Recursos Animales división realizó esta prueba.

Sangre periférica micronúcleos

Por lo menos 1000 acridina naranja células teñidas fueron contados y el porcentaje de eritrocitos que contienen micronúcleos se determinó [3].

Análisis histológico de duodeno

Fijo especímenes de duodeno fueron recortados, procesados y orientada a la inserción de parafina. Cuatro μ m de espesor de las secciones de los bloques de parafina fueron montadas en láminas. Complete midaxially seccionó criptas sobre H & E manchadas diapositivas fueron seleccionados para análisis. Complete criptas fueron definidas como aquellas con: 1) la cripta base en la muscularis mucosa, 2) una luz de la boca abierta a la base y 3) una única columna de las células epiteliales hasta cada lado de la cripta. El número de cifras de metafase por cripta midaxial se cuenta a la sección de 10 criptas de cada ratón.

Los análisis estadísticos

SAS programas de computadora se utilizó para los análisis estadísticos. Las pruebas de normalidad (estadísticas básicas), se ha utilizado en cada conjunto de datos. Una de las formas y de dos vías de análisis de varianza, seguido por Student-Newman-Keuls gama múltiples pruebas, en su caso, se utilizó para determinar si fueron estadísticamente significativas (p ≤ 0,05), las diferencias en ningún parámetro medido debido a los tratamientos. Cambiar el volumen de los tumores para cada tumor se determinó a través de mínimos cuadrados análisis de regresión lineal del volumen de los tumores usando Prism ™ (Graphpad Software, Inc). Las diferencias en las proporciones de ratones con metástasis pulmonares que los sitios se evaluaron utilizando la prueba exacta de Fischer análisis.

Las abreviaturas utilizadas

GFP, proteína verde fluorescente; TEMF, terapéuticos campo electromagnético; PAS, ácido periódico de Schiff; HIF, hipoxia inducible factor 1 - alfa; CD-31, anticuerpo monoclonal contra células endoteliales; infrarrojos, la radiación ionizante

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

Este trabajo recibió el apoyo de los CEM Therapeutics, Inc y la concesión NIH CA 75253.