Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 15-15 (más artículos en esta revista)

1, antagonista de los receptores de ratones knockout muestran una mayor activación microglial y daño neuronal inducido por la infusión intracerebroventricular humanos de β-amiloide

BioMed Central
Jeffrey M Artesanía (craft@md.northwestern.edu) [1], D Martin Watterson (m-watterson@northwestern.edu) [1], Emmet Hirsch (e-hirsch@northwestern.edu) [4], Linda J Van Eldik (vaneldik@northwestern.edu) [1]
[1] Centro para el Descubrimiento y Biología Química, Northwestern University, Chicago, IL, EE.UU.
[2] Biología Celular y Molecular, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Chicago, IL, EE.UU.
[3] Farmacología Molecular y Química Biológica, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Chicago, IL, EE.UU.
[4] Obstetricia y Ginecología, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Chicago, IL, EE.UU.
[5] Departamento de Obstetricia y Ginecología, Evanston Northwestern Healthcare, Evanston, Illinois, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Interleucina 1 (IL-1) es un mediador clave de la respuesta inmune en la salud y la enfermedad. Aunque clásicamente la función de la IL-1 se ha estudiado en el sistema inmune sistémica, la investigación en la última década ha puesto de manifiesto análogas funciones en el SNC donde la citoquina puede contribuir a la neuropatología y neuroinflammation visto en una serie de enfermedades neurodegenerativas. En la enfermedad de Alzheimer (EA), por ejemplo, pre-clínicos y clínicos de los estudios han implicado la IL-1 en la progresión de una patológica, neuroglia mediada pro-estado inflamatorio en el SNC. La neuroglia impulsada neuroinflammation puede conducir a daño neuronal, que, a su vez, estimula nuevas neuroglia activación, potencialmente perjudiciales para la propagación de un ciclo que contribuye a la progresión de la patología. Una predicción de este neuroinflammation hipótesis es que el aumento de la IL-1 de señalización in vivo se correlacionan con una mayor severidad de la AD-neuroinflammation pertinentes y daño neuronal.

Métodos

Para probar la hipótesis de que el aumento de la IL-1 de señalización predispone a los animales a beta-amiloide (A β) - inducida por los daños, hemos utilizado la IL-1 antagonista de los receptores de Knock-Out (IL1raKO) y de tipo salvaje (WT) littermate ratones en un modelo que implica De la infusión intracerebroventricular humanos oligomeric A β1-42. Este modelo imita muchas de las características de la EA, incluyendo neuroinflammation robusto, A β placas, sináptica daños y pérdida neuronal en el hipocampo. IL1raKO y WT ratones fueron infundidas con un β de los 28 días, sacrificaron a los 42 días, y el hipocampo criterios de valoración analizados.

Resultados

IL1raKO ratones mostraron un aumento de la vulnerabilidad a β-neuropatología inducida en relación con sus homólogos WT. En concreto, los ratones expuestos IL1raKO aumento de la mortalidad, el aumento de la activación microglial y neuroinflammation, y la pérdida más pronunciada de los marcadores sináptica. Curiosamente, una β-inducida astrocyte respuestas no fueron significativamente diferentes entre el TE y IL1raKO ratones, lo que sugiere que el aumento de la IL-1 de señalización afecta predominantemente microglia.

Conclusión

Nuestros datos son consistentes con la hipótesis de que los neuroinflammation aumento de la IL-1 de señalización en AD aumenta la activación y la neuroglia lleva a una aumentada neuroinflammatory proceso que aumenta la gravedad de las secuelas neuropathologic.

Antecedentes

Cada vez hay más pruebas de que la inflamación CNS (denominado neuroinflammation), impulsados por anormal o prolongado neuroglia activación contribuye a la patogenia y progresión de los trastornos agudos y crónicos [1, 2]. Normalmente, subraya neuroglia responder a la activación de un transitorio que sirve una función homeostática. Sin embargo, el aumento de los niveles de la inflamación y el estrés oxidativo producido por moléculas crónicamente activados neuroglia pueden conducir a daños o la muerte de neuronas, lo que puede inducir más gliales activación, lo que llevará a una propagación libre, en detrimento de ciclo neuroinflammation y neurodegeneración [3]. Un gran cuerpo de evidencia [4 - 8] sugiere que la orientación este-neuroglia neurona ciclo representa un atractivo potencial de la estrategia para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para AD que modifique la progresión de la enfermedad. Con este fin, una comprensión más detallada de las proteínas, caminos, y que participan en las respuestas inflamatorias neuroinflammation pertinentes a la progresión de AD es fundamental.

Una de las respuestas bioquímicas de la neuroglia a tanto aguda como crónica, condiciones de daño cerebral es el aumento de la producción de la citoquina pro-inflamatoria IL-1. Un extenso cuerpo de investigación sugiere que la IL-1 tiene un papel integral en la patogenia y progresión AD. En primer lugar, el análisis de tejido cerebral AD demuestra el exceso de IL-1, principalmente en la microglia activada que rodean β-amiloide (A β) placas y los ovillos neurofibrilares que contienen las neuronas [9, 10], las dos neuropatológicos distintivos de la EA. Este hallazgo se complementa con la revelación de que este exceso de IL-1 se corresponde estrechamente con el nivel de neuropatología encuentran en una determinada región del cerebro [11]. En segundo lugar, las células basadas en estudios muestran que la IL-1 puede obtener la producción de una serie de moléculas perjudiciales de microglia, astrocitos y neuronas. Por ejemplo, la IL-1 puede estimular la producción de α 1 anti-quimotripsina, IL-6, S100B, y de óxido nítrico sintasa inducible [12 - 15], que son en sí mismos el aumento de la AD cerebros [2]. Estas moléculas, ya sea por sí mismos o mediante la estimulación de la producción de otras moléculas, neuroinflammatory contribuir a una cascada que se ha sugerido en la celda debido a las lesiones, disfunciones, y la muerte en AD [16]. Esta hipótesis está apoyada por la neuroprotección observó siguientes represión de la cascada neuroinflammatory AD en modelos animales [4, 5]. Por último, varios estudios que examinaron la IL-1 la genética han demostrado que los polimorfismos en el IL-1gnd IL-1 receptor genes aumentan el riesgo de AD por tanto como tres veces en un porteador homocigotos [17, 16].

Todos estos estudios hasta la fecha son consistentes con la hipótesis de que el aumento de cerebro los niveles de IL-1 o de la actividad que se correlacionan con una mayor severidad de la AD-neuroinflammation pertinentes y daño neuronal. Para probar esta hipótesis, hemos utilizado la interleukina-1 antagonista de los receptores de knockout mice (IL1raKO), que han mejorado la IL-1 de señalización debido a la pérdida de la IL-1 receptor fisiológico del antagonista. Provocamos AD-neuroinflammation pertinentes y daño neuronal por intracerebroventricular (ICV) de la infusión humanos β1 A-42 en un modelo experimental de ratón previamente desarrollados por nosotros [4, 5], y se determinó el grado de activación de la neuroglia y neuroinflammation y degeneración sináptica en el hipocampo . Presentamos aquí que IL1raKO ratones son mucho más susceptibles que los ratones WT a la neuroinflammatory neurodegenerativas y secuelas de A β infusión, el apoyo a la idea de que la elevación de la IL-1 de señalización en el cerebro participa en la patogénesis AD.

Métodos
Interleucina-1 antagonista de los receptores de ratones knockout (IL1raKO)

IL1raKO ratones fueron derivados a lo descrito previamente [18] y de la colonia mantenida por el apareamiento de los heterocigotos littermates. Homocigotos IL1raKO ratones y WT littermates fueron seleccionados tras genotipo, y se permite a los adultos hasta las 16 semanas de edad antes de la cirugía. Todos los ratones fueron mantenidos en el Centro de Medicina Comparada (MCP) en la Northwestern University Feinberg School of Medicine. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y utilización Comité en la Universidad Northwestern.

Una infusión β

Infusión de ICV humanos oligomeric A β1-42 o vehículo en IL1raKO y WT littermates se realizó tal como se describe en esencia [4]. En breve, de cuatro meses de edad, los ratones (n = 5-12 por grupo), fueron anestesiados con isoflurano 2% vaporizado, y un Alzet micro-bomba osmótica (Durect, Modelo # 1002) fue adjunto a un pre-corte 2,5 mm de largo cánula (Uno de Plásticos) stereotaxically implantados en el ventrículo cerebral lateral derecho (en las coordenadas mm mediolateral -1,0, -0,5 mm anterioposterior de Bregma; -2,0 mm dorsal-ventral del cráneo). Bombas figura ya sea de vehículos (4 mM Hepes + 250 μ g / ml humanos lipoproteínas de alta densidad, HDL) o oligomeric A β1-42 (45 μ g; Péptido de América) [19] disuelto en el vehículo. Desde HDL normalmente lleva un β en el suero, se utiliza en la bomba para reducir la agregación y β A fin de facilitar el suministro a la neuropil [20, 21]. Osmótica bombas fueron parcialmente recubiertos con parafina a un punto 5 mm del extremo distal de la bomba. Esto frena el paso osmótico de las bombas de agua en el 'gel tripas y se ha demostrado en experimentos ex vivo para reducir la tasa de infusión a 1,6 μ ~ g/3.5 μ l ~ por día durante 28 días (datos no presentados).

A los 42 días después del inicio de una infusión β, los ratones fueron anestesiados con pentobarbital (50 mg / kg) y perfundidos con un buffer Hepes que contiene un cóctel de inhibidores de la proteasa. La parte superior del cráneo fue incisa, y cerebros fueron removidos y atravesada longitudinalmente. Con el fin de excluir la posibilidad de que una parte del cerebro puede poseer más importantes a raíz de una patología unilateral de perfusión y, por tanto, confundir los resultados y / o conclusiones, sólo la mitad derecha del cerebro se fijó en un paraformaldehído / solución tampón fosfato y Incluidas en parafina para examen histológico, mientras que el hipocampo sólo se aisló en el hemisferio izquierdo y broche de congelados para la evaluación bioquímica. Además, las bombas Alzet fueron examinadas para asegurar que el recubrimiento de parafina fue intacta y el embalse solución fue expulsado.

Análisis bioquímicos de inflamación y los marcadores neuronales

Hipocampo soluble extractos fueron preparados por dounce y sonicación en un buffer Hepes que contiene un inhibidor de la proteasa cóctel seguido de centrifugación y la recaudación de sobrenadante como se describe [4]. Los niveles de las citoquinas proinflamatorias IL-1 β, el factor de necrosis tumoral (TNF) α, S100B, y la proteína presináptica en el hipocampo sinaptofisina sobrenadantes por ELISA se determinó que se describió anteriormente [4]. Western blots de sobrenadantes hipocampo (10 μ g de proteína sobrenadante cargado por carril) se realizó con un anticuerpo a postsináptica densidad de la proteína-95 kDa (PSD-95) (1:100000 dilución; Upstate Biotecnología), tal como se describe [4]. Los anticuerpos contra la β-actina (1:500000 dilución, Sigma) fueron utilizados para confirmar la igualdad de proteína de carga entre las muestras. Densitometría se hizo con ImageQuant software (Molecular Dynamics).

Histología

Detección inmunohistoquímica de astrocitos y microglia activada se realizó en 10 μ m secciones con anti-GFAP (1:1500 dilución; Sigma) y anti-F4/80 (1:100 dilución; Serotek) anticuerpos, respectivamente, como ha sido descrito previamente [4]. Células fueron determinadas por dos observadores cegados y posteriormente analizados de la siguiente manera. Por microglia y astrocyte análisis, todos diaminobenzidine (DAB) de las células teñidas cuerpos fueron contados manualmente en el hipocampo (con exclusión de la fimbria) de tres F4/80- y GFA-etiquetados secciones coloca en -1,8, -2,1 y -2,3 mm de Bregma. En todos los estudios, la concordancia entre observadores fue en el 10% o fue retirado de la sección de análisis.

Los análisis estadísticos

Grupos experimental y control se compararon cuatro grupos independientes utilizando utilizó un modelo lineal con SNK post-hoc de análisis estadístico utilizando un paquete de software (GraphPad Prism versión 4,00, GraphPad Software, San Diego CA, http://www.graphpad.com]. GraphPad Prism también se utilizó para la construcción de Kaplan-Meier y las curvas de mortalidad para evaluar la significación. Significación estadística se asumió cuando p <0,05.

Resultados
Un aumento de la mortalidad en β-infundido IL1raKO ratones

En nuestros estudios anteriores que utilizan la A-β infusión modelo [4, 5], encontramos que intra-, peri-, y después de la operación los animales de mortalidad fue de aproximadamente 1-2%. La mortalidad en IL1raKO ratones que recibieron una infusión de A β fue mucho mayor, alcanzando el 50% en el momento de su sacrificio a los 42 días (Figura 1]. En marcado contraste, la mortalidad fue ningún animal con experiencia en el IL1raKO ratones que recibieron una infusión de vehículos, o en WT littermates infundido con β o bien un vehículo.

Aumento de las respuestas microglial en A β-infundido IL1raKO ratones

Sobre la base de la alta mortalidad visto en A β-infundido IL1raKO ratones, la infusión experimento se repitió con otros ratones para permitir la supervivencia de ratones KO suficiente para su posterior análisis. A los 42 días después del inicio de la cirugía, los ratones fueron sacrificados y el hipocampo del tejido analizado. Medición de la microglia activación de puntos finales (Fig 2] no reveló diferencias significativas en los niveles basales de las citoquinas proinflamatorias IL-1 β (Figura 2A] y TNF α (Figura 2B] en el vehículo-WT infundido IL1raKO y ratones. Hubo un ligero aumento en el número de positivos F4/80 microglia en vehículo-IL1raKO infundido en comparación con los ratones WT homólogos (Fig. 2C]. Sin embargo, en ratones IL1raKO infundido con un β, la intensidad de la respuesta microglial, medida por varios bioquímicas e histológicas de puntos finales, fue mucho mayor que en una β-WT infundido ratones. Por ejemplo, la IL-1 β niveles fueron significativamente mayores en A β-IL1raKO infundido en comparación con un β-WT infundido ratones (Figura 2A]. Del mismo modo, los niveles de TNF α fueron significativamente más altos después de una infusión en β IL1raKO ratones WT versus littermates (Figura 2B]. Por último, el número de microglia activada, medida por inmunoticción F4/80 fue mayor en A β-infundido IL1raKO ratones frente a sus homólogos WT (Figura 2C]. Representante de fotomicrografías el hipocampo de ratones WT y IL1raKO infundido con un β (Fig. 2D y 2E, respectivamente) demuestran la amplitud de esta activación microglial.

Astrocyte activación en A β-infundido IL1raKO ratones

A diferencia de los resultados por encima de microglia con puntos finales, se observó que no existen diferencias significativas en el estado de activación astrocyte entre IL1raKO y WT ratones después de una infusión de β. Por ejemplo, los niveles de las citoquinas derivadas astrocyte-S100B fueron significativamente siguientes upregulated A β infusión para el WT y IL1raKO ratones (Fig 3A], pero no hubo diferencias significativas en la magnitud de este aumento entre la A-β infundido WT y IL1raKO Ratones. Estos resultados también fueron vistos por la proteína ácida glial fibrilar (GFAP) inmunohistoquímica. Como se muestra en la Fig 3B, hubo aumentos significativos en la tinción de GFAP en el hipocampo de los ratones después de una infusión β, y el número de astrocitos GFAP-positivas fueron similares en el TE y IL1raKO ratones.

El aumento de la degeneración sináptica en A β-infundido IL1raKO ratones

Dado el importante aumento de microglial neuroinflammation tras una infusión β IL1raKO en ratones, es importante investigar el efecto de este aumento de neuroinflammation sobre las respuestas neuronales. Por lo tanto, dos diferentes marcadores bioquímicos de la degradación de sináptica se examinaron. Una infusión β llevado a la reducción de los niveles de la postsináptica proteína PSD-95, en tanto el IL1raKO WT y ratones en comparación con vehículos-infundido ratones, sin embargo, la reducción fue significativamente mayor en comparación con los ratones IL1raKO WT (Fig 4A]. Del mismo modo, los niveles de la proteína presináptica sinaptofisina se redujeron en un β-infundido en comparación con ratones vehículo-infundido ratones y, si bien no muy alcanzar significación estadística (p = 0,07), la reducción en los niveles de sinaptofisina fue mayor en A β-IL1raKO infundido en comparación con ratones A β-infundido WT (fig. 4B].

Discusión

El principio de la búsqueda de este estudio es que el aumento de la IL-1 de señalización resultados en el aumento de la mortalidad, microglial neuroinflammation, y el daño neuronal tras una infusión crónica de humanos β1 A-42 en un modelo murino. Estos datos proporcionan apoyo adicional a la idea de que la IL-1 es un componente importante en la cascada neuroinflammation que impulsa AD progresión.

Un extenso cuerpo de evidencia indica la importancia de la IL-1 en la regulación de la susceptibilidad a las lesiones CNS. Por ejemplo, la IL-1 β niveles en líquido cefalorraquídeo (LCR) son aumentado poco después de la lesión cerebral traumática grave en el ser humano, y la magnitud de este aumento es directamente proporcional a la presión intracraneal [22]. Los estudios en animales han demostrado también la importancia de la IL-1 en la mediación daños después de un grave insulto, como la hipoxia-isquemia neonatal [23], y la progresiva neurodegeneración que sigue leve insultos aguda en roedores [24]. Esto no es inesperado, dada la variedad de moléculas potencialmente perjudiciales producidas por el CNS, en respuesta al aumento de la producción de IL-1. Por ejemplo, la IL-1 β y / o IL-1 α han estado implicados en la producción de otras citoquinas pro-inflamatorias tales como S100B [14]. Además, la IL-1 β gliales iNOS puede estimular la producción [15], que a su vez puede aumentar el estrés oxidativo sufrido por el cerebro y potencialmente conducir a daño neuronal a través de la proteína nitration vías [25].

Más de interés para el presente estudio, se ha intensificado la señalización de IL-1 en enfermedades neurodegenerativas crónicas. Además de la IL-1 y la enfermedad sobreexpresión de distribución pertinentes en AD [26, 10], IL-1 también aumenta en otras condiciones crónicas que involucran la neurodegeneración. Estos incluyen el síndrome de Down [26], que posee muchas de las características distintivas de la AD neuropatológico, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob [27], la demencia y el VIH [28]. En particular, los modelos de roedores in vivo de AD también han puesto de manifiesto una correlación entre el grado de neuropatología y el nivel de la producción de IL-1 [4, 5, 21]. Lo que es más importante, una serie de intervenciones terapéuticas dirigidas a la disminución de neuroinflammation Se ha demostrado que tanto disminuir la producción de IL-1 y reducir la cantidad de sináptica degeneración y muerte neuronal [8, 4, 6]. Estas observaciones confirman la utilidad de la medición de IL-1 β niveles, en términos de demostrar un vínculo con la progresión de la enfermedad y la vigilancia de respuesta a las intervenciones terapéuticas que se traducen en la atenuación de la enfermedad.

Los resultados del estudio actual, en el que un modelo de roedor que se ha incrementado la IL-1 de señalización debido a la pérdida de la IL-1 antagonista de los receptores de la muestra fisiológica de un aumento de β-inducida neuroinflammation y daño neuronal, son consistentes con anteriores trabajos en el campo. Los aumentos en los niveles de TNF α y F4/80-positive células documento que el aumento de la IL-1 estimula la señalización de un sólido y generalizado microglia respuesta tras una infusión β. Estas observaciones también ilustran la escalada, la naturaleza cíclica de la A-β neuroinflammatory respuesta inducida, ya que con el aumento de la IL-1 de señalización también hay un aumento de los niveles de IL-1 β. Esto es similar a los resultados con el ratón IL1raKO en modelos de inflamación sistémica [18]. Además, el aumento resultante de la neuroinflammation en ratones IL1raKO infundido con un β fue acompañado por un agravamiento en la pérdida sináptica de los marcadores, especialmente PSD-95. Este particular hallazgo, en conjunto con nuestros hallazgos similares en una β-S100B infundido overexpressing ratones transgénicos [29], sostiene firmemente a la conclusión de que los animales predispuestos a neuroinflammation sufren con mayor severidad de las secuelas neurodegenerativas tras una infusión β. Prueba de la evaluación epidemiológica de los factores de riesgo de AD también apoya esta conclusión. Anterior heridas en la cabeza, por ejemplo, el medio ambiente es un importante factor de riesgo para el desarrollo de la EA en la que es la hipótesis de que la IL-1 mediada por neuroinflammation desempeña un papel fundamental [30, 31].

Un tanto sorprendente conclusión fue que, a diferencia de la mayor microglia y las respuestas neuronales en la A-β infundido IL1raKO ratones en comparación con ratones WT, el astrocyte respuestas a una infusión β son muy similares en las dos cepas de ratón. Ambos IL1raKO y WT upregulation ratones mostraron similares niveles de S100B inmunoreactividad GFAP y después de una infusión de β. Una posible explicación es que, en el momento en el punto examinado (42 días), astrocyte las respuestas aún no han llegado a su máximo después de una infusión de β. Esta posibilidad indica una necesidad de futuros estudios para examinar el desarrollo temporal de microglia, astrocyte, neuronales y respuestas después de un inicio de la infusión β.

El IL1raKO ratones infundido con una amplia experiencia β mortalidad en el curso del experimento, a pesar de un mínimo de mortalidad de otras cepas de ratones en nuestros estudios anteriores [4, 5, 29]. En la primera inspección, este aumento de la mortalidad se explica por la pro-inflamatorias estado de IL1raKO ratones, que pueden predisponer a sépticos sistémicos similares a los episodios en una mayor frecuencia que sus WT littermates, especialmente a raíz de una importante operación quirúrgica para colocar una bomba inhabitación ICV y catéter. Sin embargo, la falta de mortalidad en el IL1raKO ratones que recibieron una infusión de vehículos argumentarían en contra de esta conclusión. A más intrigante posibilidad es que estos ratones murieron directa o indirectamente de una mayor gravedad del neuroinflammatory respuesta a una β de los ratones que sobrevivieron. El neuroinflammation sólido y coherente, que es una de las características clave que caracteriza el modelo A β infusión, apoya esta conclusión como una posibilidad concreta. Aunque muy interesante, especialmente a la luz de un síndrome similar aflige a un subgrupo de individuos inscritos en el ahora suspendido A β ensayos de vacunas [32], elucidación de los mecanismos subyacentes al aumento de la mortalidad se requieren investigaciones adicionales.

Conclusión

La principal conclusión de este estudio es la demostración de que IL1raKO ratones muestran selectiva sobre regulación de microglial neuroinflammation y el aumento de daño neuronal después de una infusión de β en comparación con WT littermates. La susceptibilidad de los ratones IL1raKO a un aumento de β-inducida neuroinflammation fue demostrado por mediciones bioquímicas e histológicas de la activación microglial. Este aumento de la activación microglial en el IL1raKO ratones también está asociada con un aumento en el grado de degeneración sináptica observado tras una infusión β, lo que sugiere que la mejora de la señalización IL1 deletéreos neuroinflammation conduce a que los daños ya sea en forma directa las neuronas y / o potencia los efectos neurotóxicos de A β. Estos datos proporcionan apoyo adicional a la hipótesis de que los aumentos en el nivel de IL1 señalización en el cerebro AD puede ser perjudicial a través de la función de las citocinas como un componente clave de la cascada neuroinflammatory que contribuye a la progresión de la neuropatología. También sugiere que la manipulación de la señalización de IL-1 y otros mediadores y neuroinflammatory vías podrían utilizarse para desarrollar clínicamente significativo, modificador de la enfermedad AD terapias.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses en los resultados, los resultados o conclusiones de esos estudios.

Contribuciones de los autores

CMM ayudó a concebir el estudio llevado a cabo con animales y cirugías, atención, y bioquímica / histológico ensayos. DMW ayudó a concebir el estudio, interpretar los resultados y ayudar en la preparación del manuscrito. EH desarrollado y aportado la IL1raKO ratones y dio consejos útiles para el manejo y el cuidado de los animales. LVE ayudó a concebir el estudio, el análisis de los datos y ayudar en la preparación del manuscrito.

Agradecimientos

Damos las gracias a Sara Medgysi de asistencia con ratón colonia mantenimiento y ensayos. Estos estudios fueron apoyados en parte por el Instituto para el Estudio de Envejecimiento (DMW) y por el NIH subvenciones R37 AG13939 (LVE), R01 AG20243 (LVE), y P01 AG21184 (LVE, DMW). CMM es un becario predoctoral del Centro de Descubrimiento y Química Biología programa de capacitación, apoyado en parte por el NIH T32 AG00260, una beca predoctoral de la Investigación Farmacéutica y Fabricantes de América (PhRMA) Fundación, y un Ruth L. Kirschstein NRSA becas F30 NS46942.