Journal of Nanobiotechnology, 2005; 3: 6-6 (más artículos en esta revista)

Interacción de las nanopartículas de plata con el VIH-1

BioMed Central
José Luis Elechiguerra (josee@che.utexas.edu) [1], Justin L Burt (burt@che.utexas.edu) [1], Jose R Morones (morones@che.utexas.edu) [1], Alejandra Camacho - Bragado (camacho-bragado@mail.utexas.edu) [2], Xiaoxia Gao (kathygao@mail.utexas.edu) [2], Humberto Lara H (dr_lara@lycos.com) [3], Miguel José Yacaman ( Yacaman@che.utexas.edu) [1]
[1] Department of Chemical Engineering, The University of Texas at Austin, Austin, Texas 78712, USA
[2] Texas Materials Institute, The University of Texas at Austin, Austin, Texas 78712, USA
[3] Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León, San Nicolás de los Garza, Nuevo León, Mexico

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Resumen

La interacción de nanopartículas con biomoléculas y microorganismos es una ampliación de campo de la investigación. Dentro de este campo, un área que ha sido en gran parte sin explorar es la interacción de los virus con las nanopartículas de metal. En este trabajo se demuestra que las nanopartículas de plata someterse a un tamaño que dependen de la interacción con el VIH-1, con nanopartículas exclusivamente en el rango de 1-10 nm adjunta al virus. El ordinario de la disposición espacial de las nanopartículas adjunta, la de centro a centro de la distancia entre las nanopartículas, y el hecho de que la exposición de azufre de residuos de la glicoproteína perillas sería atractiva para los sitios sugieren que la interacción de nanopartículas de plata nanopartículas interactuar con el VIH-1 Virus a través preferencial vinculante a la glicoproteína gp120 perillas. Debido a esta interacción, las nanopartículas de plata inhibir el virus de la unión a la célula huésped, como se ha demostrado in vitro.

Antecedentes

La nanotecnología proporciona la capacidad de ingeniero de las propiedades de los materiales mediante el control de su tamaño, lo que ha impulsado la investigación hacia una multitud de posibles usos de los nanomateriales [1]. En las ciencias biológicas, muchas aplicaciones de las nanopartículas de metal se están estudiando, incluyendo biosensores [2], las etiquetas de las células y biomoléculas [3], y el cáncer de la terapéutica [4].

Se ha demostrado que, en el caso de metales nobles-nanocrystals, electromagnético, óptico y propiedades catalíticas son altamente influenciados por la forma y el tamaño [5 - 7]. Esto ha impulsado el desarrollo de las rutas de síntesis que permitan un mejor control de la morfología y el tamaño [8 - 13]. Noble-metal nanomateriales han sido sintetizados utilizando una variedad de métodos, incluida la plantilla de difícil [14], la reducción de la bio-[9] y la fase de solución de síntesis [8, 10 - 13].

Entre noble-metal nanomateriales, las nanopartículas de plata han recibido considerable atención debido a sus atractivas propiedades fisicoquímicas. La resonancia de plasmones superficiales y gran dispersión efectiva de sección transversal de cada uno de nanopartículas de plata que sean candidatos ideales para el etiquetado molecular [15], donde fenómenos como aumentar la superficie de dispersión Raman (SERS) pueden ser explotados. Además, la fuerte toxicidad plata que exhibe en diversas formas químicas a una amplia gama de microorganismos es bien conocida [16 - 18], las nanopartículas de plata y recientemente se han demostrado ser una prometedora antimicrobianos material [19].

Por estas razones, y sobre la base de nuestros trabajos anteriores con respecto a las interacciones de las nanopartículas de metales nobles con biomoléculas [20], se decidió estudiar la interacción de las nanopartículas de plata con el virus. Aquí, presentamos las primeras conclusiones de nuestra investigación, el descubrimiento de que las nanopartículas de plata someterse tamaño dependen de la interacción con el VIH-1.

Apreciación
Caracterización de las nanopartículas de plata a prueba los preparativos

Las propiedades físico-químicas de las nanopartículas son fuertemente dependientes de sus interacciones con las moléculas de ph [21]. De hecho, la química de la superficie de las nanopartículas puede modificar sus interacciones con sistemas externos. Por esta razón, hemos probado las nanopartículas de plata con tres marcadas diferencias de superficie químicos: espumoso de carbono, poli (N-vinil-2-pyrrolidone) (PVP), y la albúmina sérica bovina (BSA).

Espumosa recubierto las nanopartículas de carbono se obtuvieron de nanotecnologías, Inc, y se utilizan sin más tratamiento. Estas nanopartículas están incrustados en una matriz de carbono espumosa que evita que coalescencia durante su síntesis. Las nanopartículas recibido-como muestra consiste en una multa de polvo negro. A los efectos del presente trabajo, como el polvo-fue recibido dispersos en agua desionizada por ultra-sonicación. TEM análisis muestra que las nanopartículas tienden a ser espumoso aglomerado en el interior de la matriz de carbono, aunque una parte considerable de la población es liberado de esta matriz por la energía procedente de la ultra-sónica baño (Figura 1a-1f]. Estas nanopartículas son liberados principalmente nanopartículas a la superficie libre, y se observó que sólo las nanopartículas que han escapado de la espumosa matriz de carbono interactuar con el VIH-1 en las células.

La interacción de las nanopartículas de carbono con la espumosa matriz es lo suficientemente débil que simplemente por condensación de la TEM haz de electrones, incluso las nanopartículas que inicialmente no fueron liberados por el ultra-sonicación son expulsados de la espumosa aglomeración de carbono. En realidad, después de este experimento el tamaño completo de distribución de estas nanopartículas es mejor observado, por favor, consulte el archivo adicional: 1. Alta resolución microscopio electrónico de transmisión (TEM) reveló que la plata liberados de las nanopartículas de carbono espumosa matriz ultrasonication por tener un tamaño de la distribución de 16,19 ± 8,68 nm (Figura 2a-b]. Poniendo en libertad a los restantes nanopartículas de carbono a partir de la matriz de espumosa con la acción del haz de electrones, el tamaño medio fue 21 ± ~ 18 nm. Además, TEM examen demostró que la muestra se compone de varias morfologías incluyendo múltiples hermanados nanopartículas con simetría cinco veces, es decir, decahedra y icosahedra, pirámides truncadas, y octahédrica cuboctahedral nanopartículas, entre otros (Figura 1c-1f].

PVP recubierto las nanopartículas fueron sintetizados por el método de poliol utilizando glicerina como agente reductor y disolvente. En este método, un precursor de metal se disuelve en un líquido poliol en presencia de un ph como la protección de las variedades vegetales [22]. PVP es un polímero lineal y se estabiliza en la superficie de nanopartículas a través de la vinculación con el anillo pyrrolidone. De infrarrojos (IR) y de rayos X espectroscopia de fotoelectrones (XPS), los estudios han revelado que los dos átomos de oxígeno y nitrógeno de la pyrrolidone anillo puede promover la protección de las variedades vegetales de las cadenas de adsorción en la superficie de plata [23]. El tamaño de la muestra se obtuvo de la distribución de alto ángulo anular campo oscuro (HAADF) imágenes. Las nanopartículas exhiben un tamaño medio de 6,53 nm, con una desviación estándar de 2,41 nm. (Figura 2d-e]

Nanopartículas de plata directamente conjugado con BSA se sintetizan las moléculas de proteínas en solución acuosa. Las concentraciones séricas de albúmina es una proteína globular, y es el más abundante de proteínas en el plasma sanguíneo. Albúmina de suero bovino (BSA) es una sola cadena polipeptídica compuesta por 583 aminoácidos [24]. Varios residuos de la BSA han azufre, oxígeno, nitrógeno y que devengan los grupos que pueden estabilizar la superficie de nanopartículas. La más fuerte de plata probables interacciones con la participación de los 35 tiol que devengan los residuos de cisteína. Mediante el uso de sodio borohydride, un fuerte agente reductor, la BSA se estabiliza a través de nanopartículas de unión directa con estos tiol devengan residuos de cisteína, y proporciona protección estéricos debido al volumen de la proteína. El tamaño de la muestra se obtuvo de la distribución HAADF imágenes. Casi el 75% de la BSA-conjugado nanopartículas de plata fueron 2,08 ± 0,42 nm de diámetro, pero una fracción importante de las partículas más grandes también se observó, con lo que el total promedio de 3,12 ± 2,00 nm (Figura 2 g-h].

Espectroscopia UV-visible es una valiosa herramienta para la caracterización estructural de las nanopartículas de plata. Es bien sabido que los espectros de absorción óptica de nanopartículas de metal están dominadas por las resonancias de plasmones superficiales (SPR), que paso a longitudes de onda más largo con el aumento de tamaño de las partículas [25]. Además, es bien conocido que la absorbancia de las nanopartículas de plata depende principalmente al tamaño y la forma [26, 27]. En general, el número de SPR picos disminución como la simetría de las nanopartículas aumenta [27]. Recientemente, Schultz y compañeros de trabajo [28] la correlación de cada uno de los espectros de absorción de las nanopartículas de plata con su tamaño (40-120 nm) y la forma (las esferas, decahedrons, triangular truncado pirámides y plaquetas) determinado por TEM. Se encontró que aproximadamente esférica y nanopartículas esféricas, decahedral nanopartículas o pentagonal, triangular y pirámides truncadas y plaquetas absorber en el azul, verde y rojo del espectro, respectivamente. En todos los casos los recursos especiales del pico de longitud de onda aumenta con el tamaño, como se esperaba.

Los espectros UV-Visible para todos los preparativos nanopartículas se muestra en la Figura 2. Todas las muestras presentaron un mínimo de ~ 320 nm que corresponde a la longitud de onda en la que las partes real e imaginaria de la función dieléctrica de plata casi desaparecer [27]. La muestra con carbono recubierto las nanopartículas de plata exhibe cuatro picos en ~ 400, ~ 490, y ~ 560 ~ 680 nm, como se muestra en la Figura 2c. La óptica de la firma de esta muestra puede ser mejor entendido en términos de la distribución de tamaños y formas observadas en el TEM. Como ya se ha mencionado anteriormente, la distribución de las formas en la que la muestra es amplia, y una cantidad significativa de las nanopartículas no son esféricas, como multi-hermanada con cinco veces simetrías. La presencia de las nanopartículas con pentagonal triangular y secciones transversales pueden ser responsables de la absorción en longitudes de onda más largo. Por lo tanto, es evidente que las características de absorción de estas nanopartículas se debe a la contribución de diferentes formas y tamaños, que está de acuerdo con las observaciones TEM.

Por otro lado, la protección de las variedades vegetales y revestida de BSA recubierto las nanopartículas de plata la actualidad sólo un pico en ~ ~ 390 y 450 nm, respectivamente. Estos resultados indican que tanto la preparación como se componen principalmente por pequeñas nanopartículas esféricas de plata. También es bien sabido que para las pequeñas partículas de una ampliación de las bandas de absorción de plasmones se espera, ya que existe una dependencia lineal de la anchura completa a la mitad del máximo (FWHM) con la reciprocidad de la partícula de diámetro [29]. Los resultados de la BSA recubierto las nanopartículas de acuerdo con la última declaración, la presentación de sólo una amplia simétrico pico en ~ 390 nm. Por otro lado, el espectro de la protección de las variedades vegetales recubierto las nanopartículas de plata no es simétrico alrededor de la longitud de onda de máxima absorción. De hecho, este espectro se deconvoluted en dos curvas diferentes, uno centrado en ~ 430, y otra a ~ 520 nm. El pico a ~ 430 nm podría ser asignado a la salida fuera del avión dipolo de resonancia de las nanopartículas de plata que indica la presencia de partículas esféricas con diámetros pequeños. Además, la síntesis de nanopartículas de plata por el método de poliol en presencia de PVP también promueve la formación de múltiples hermanados nanopartículas (MTPs), siendo la mayoría de las nanopartículas decahedra termodinámicamente estable MTPs [23]. Por lo tanto, el cambio observado leer es una consecuencia tanto de las nanopartículas de mayor tamaño y la presencia de nanopartículas decahedral pentagonal con secciones transversales.

Interacción con el VIH-1

Alto ángulo anular campo oscuro (HAADF) escaneo microscopía electrónica de transmisión fue empleado para estudiar la interacción de las nanopartículas de plata con el VIH-1. En nuestros trabajos anteriores, HAADF ha demostrado ser una poderosa técnica para el análisis de muestras biológicas, como las proteínas [20] y [30] bacterias, en interfase con nanopartículas inorgánicas. HAADF imágenes son principalmente formada por los electrones que han sido objeto de retrodispersión Rutherford. Como resultado de ello, el contraste de imagen está relacionada con las diferencias de número atómico [31] con intensidad variable como Z ~ 2. Por lo tanto, el contraste de imagen está estrechamente relacionado con su composición. Como una buena aproximación, más ligeros elementos aparecen oscuras y elementos más pesados parecen brillantes. Debido a la gran diferencia en el número atómico, las nanopartículas de plata son fáciles de distinguir de la materia orgánica que compone el virus.

En la figura 3, se presenta HAADF imágenes de la epidemia del VIH-1 con virus (3 bis) y sin (3b) nanopartículas de plata. Para completar experimental obtener más información, consulte la sección Métodos. La presencia de la plata fue confirmado independientemente por dispersivo Energía Espectroscopía de rayos X (EDS), se muestra en la Figura 3c. Curiosamente, el tamaño de las nanopartículas vinculado al virus (Figura 3d] eran exclusivamente dentro del rango de 1-10 nm. En el caso de las nanopartículas de plata liberado de la matriz de carbono, el hecho de que las nanopartículas no mayor de 10 nm de diámetro se observaron interactuar con el virus es importante, ya que el tamaño de ~ 40% de la población total está fuera de este rango. Esto proporciona una fuerte evidencia de la magnitud de la dependencia de la interacción.

Además, la nanopartículas observarse en la figura 3 bis no se asigna aleatoriamente a los virus, como regular las relaciones espaciales se observan entre los grupos de tres partículas. Tanto el arreglo espacial del tamaño de las nanopartículas y de la dependencia de la interacción puede ser explicado en términos de la epidemia de VIH-1 envoltura viral, y puede proporcionar más detalles sobre el modo de interacción entre el virus y las nanopartículas.

El exterior del virus VIH-1 se compone de una membrana lipídica intercalados con protuberantes glicoproteína perillas, formada por trimers, constituido por dos subunidades: la subunidad gp120 glicoproteína de superficie está expuesta al exterior, y la subunidad de glicoproteína transmembrana gp41 se extiende por la membrana viral y Gp120 conecta el exterior con el interior glicoproteína matriz de la proteína p17 [32]. La función principal de estas protuberancias glicoproteína gp120 perillas es vincular con receptores CD4 de la célula huésped. Numerosas proteínas celulares también están integrados dentro de la cubierta del virus [33]. Sin embargo, la glicoproteína gp120 protuberantes perillas están más expuestos al exterior, y debe ser más accesible para los posibles interacciones nanopartículas.

Leonard y compañeros de trabajo [34] informó de que la subunidad gp120 tiene nueve disulfuro de bonos, tres de los cuales están situados en las proximidades de las CD4 vinculante de dominio. Estos expuestos disulfuro de los bonos sería los lugares más atractivos para las nanopartículas de interactuar con el virus. Como se mencionó anteriormente, la nanopartículas en la Figura 1a parecen estar situados en posiciones específicas, con regulares relaciones espaciales observadas entre los grupos de tres partículas. Los arreglos espaciales observó correlación con las posiciones de la glicoproteína gp120 perillas en el modelo estructural para el VIH-1 propuesto por Nermut y compañeros de trabajo [32].

Regular relaciones espaciales también se encuentran en la superficie del virus sin tratamiento, como se ha visto en la inserción de la figura 1b. El contraste observado más oscuro en estos sitios podría indicar la ubicación de la glicoproteína perillas. Como se mencionó anteriormente, en contraste HAADF imágenes depende en gran medida de las diferencias en el número atómico. Sin embargo, este no es el único factor en la determinación de la imagen de contraste. Si el material se compone de elementos de número atómico similar, como es el caso de los compuestos orgánicos de la pura virus, las variaciones locales de densidad en la muestra ofrecerá notable contraste. La mayor parte de la cubierta del virus consiste en una alta densidad de los lípidos de membrana envasados. Sin embargo, para que la glicoproteína perillas, nos espera un localizados región de menor densidad debido a la presencia de la membrana de la gp41 glicoproteínas que abarca más que la densamente repleto de lípidos. Por lo tanto, esas zonas deben aparecer más oscura que el resto de la cubierta del virus.

Ha sido determinado que la de centro a centro de espaciamiento entre glicoproteína perillas es ~ 22 nm [35]. En la inserción de la figura 3 bis, el promedio medido de centro a centro de espaciamiento entre las nanopartículas de plata es ~ 28 nm, que se correlaciona con el esperado espacio entre glicoproteína perillas. El promedio de centro a centro de espaciamiento entre las pequeñas regiones más oscuras sobre el virus sin tratamiento es ~ 22 nm, lo que sugiere de nuevo estos sitios son la glicoproteína gp120 perillas. Así, observó la disposición espacial de las nanopartículas ", de centro a centro de la distancia entre las nanopartículas, y el hecho de que la exposición de azufre de residuos de la glicoproteína perillas sería atractiva para los sitios de interacción de nanopartículas sugieren fuertemente que las nanopartículas de plata con el VIH - 1 preferencial virus a través de su unión a la glicoproteína gp120 perillas.

Suponer que los lugares más atractivos para la interacción son el azufre de residuos de la glicoproteína gp120 perillas, sólo hay un número limitado de bonos que una nanopartícula pueden formar. Este número limitado de estabilización de los sitios más grandes pueden explicar por qué no se observan las nanopartículas de adjuntar al virus. Suponiendo que cada nanopartícula interactúa con un único mando de glicoproteína, y que cada vecino más cercano de mando es ocupado por otro nanopartículas, de las consideraciones geométricas teórico límite superior para el diámetro de estas nanopartículas se ~ 20 nm. Sin embargo, si una nanopartícula más grande que el diámetro de un mando (~ 14 nm [35]] que se adjunta, sólo una pequeña fracción del total de la superficie de nanopartículas se basa, por lo menos en una interacción estable. Así pues, si las nanopartículas están interactuando con el VIH-1 a través preferencial vinculante en la glucoproteína gp120 tiradores, que espera encontrar la mayoría de las nanopartículas de menos de 14 nm de diámetro, como las partículas en este rango de tamaño tendría la mayoría de las interacciones superficie estable. Esto corresponde estrechamente con nuestra observación experimental que las partículas mayores de 10 nm no se adjunta a la cubierta del virus.

Aunque el mecanismo por el que el VIH infecta a la célula huésped no es aún plenamente entendido, hay dos medidas que están ampliamente de acuerdo en que se crítica. El primer paso consiste en unión de la gp120 con el receptor CD4 sitio en la célula huésped. Luego, tras su unión a CD4, un cambio conformacional es inducida en la gp120, lo que resulta en la exposición de los nuevos sitios de unión para un receptor de quimioquinas, es decir, el CCR5 o CXCR4 [36 - 38]. Preferentemente un agente que interactúa con la glicoproteína gp120 bloquearía el virus de vinculante con la célula huésped. Por lo tanto, los efectos inhibitorios medido de las nanopartículas de plata contra el VIH-1 in vitro.

La capacidad de las nanopartículas de plata para inhibir el VIH-1 se determinó por la infecciosidad en contra de las pruebas de CD4 + MT-2 y cMAGI células VIH-1 en las células reportero. Para completar experimental obtener más información, consulte la sección Métodos. El efecto citopático de CD4 + MT-2 la infección se analizaron por microscopía óptica sincitio evaluación de la formación, tal como se describe en otro lugar [39, 40], así como por la infección por VIH-1 de células por medio de la cMAGI Azul Cell ensayo [41, 42]. La citotoxicidad de las nanopartículas todos los preparativos contra células MT-2 se determinó a través de la exclusión de Trypán Azul ensayo [43]. Para los tres nanopartículas preparados en concentraciones por encima de la plata 25 μ g / ml, la infectividad viral se redujo en una medida que no puede ser detectado por sincitio formación, tal y como se muestra gráficamente en la Figura 4. Para cada nanopartícula preparación, que forma dosis-dependiente la inhibición de la infectividad de VIH-1, con una CI 50 donde sólo moderada de células se observó toxicidad, como se ha visto en la Figura 4.

Aunque las conclusiones relativas a la interacción con el VIH-1 son congruentes entre las nanopartículas con marcadas diferencias de superficie química, la toxicidad y la inhibición de los resultados no eran los mismos. Las diferencias en las tendencias observadas en la inhibición del VIH-1 puede ser explicado en términos de los topes de los agentes empleados para cada preparación de nanopartículas. BSA-y-PVP protegidas nanopartículas exposición ligeramente inferior debido a la inhibición de la superficie de nanopartículas está directamente vinculado a encapsulada y por el ph. En cambio, la plata de las nanopartículas de carbono liberado de la matriz tiene un mayor efecto inhibidor debido a su superficie esencialmente libre. El hecho de que el carbono recubierto las nanopartículas presentan mayores citotoxicidad también puede ser explicado en términos de la química de superficie. Dado que una cantidad significativa de estas nanopartículas de plata poseen cerca de superficies libres, que sean capaces de interactuar más con la célula huésped, lo que aumenta su toxicidad. Evidentemente, la selección de los agentes de la limitación será crucial para la investigación futura sobre la interacción de las nanopartículas con los virus, microorganismos, y más compleja biosistemas, y muchas más variables requieren más pruebas, incluidos los efectos a largo plazo de la presencia de las nanopartículas, y el impacto De las trazas de moléculas precursoras y de los subproductos de la reacción.

En conclusión, hemos encontrado que las nanopartículas de plata someterse tamaño dependen de la interacción con el VIH-1, y que la exposición regular obligado partículas relaciones espaciales. Estas observaciones nos llevan a sugerir que las nanopartículas someterse preferencial vinculante con la subunidad gp120 de la cubierta del virus glicoproteína. Nanopartículas de plata inhibir el VIH-1 del virus de la infectividad in vitro, que también apoya nuestra propuesta relativa a la interacción con gp120 preferencial. Estos resultados proporcionan evidencia indirecta sólo para nuestro proyecto de modo de interacción, y en la actualidad estamos realizando pruebas para determinar concluyentemente si la conjugación directa entre gp120 y nanopartículas de plata existe.

Las interacciones de nanopartículas inorgánicas con biosistemas apenas están empezando a ser entendidos, y las potenciales aplicaciones se han descubierto a un ritmo creciente. Sin embargo, a fin de hacer realidad la promesa futura de las nanociencias, es imperativo que la toxicidad a largo plazo y los efectos sobre la salud de la exposición a los nanomateriales que explorar plenamente. La flexibilidad de los métodos de preparación de nanopartículas, la multitud de técnicas de funcionalización, y fácil incorporación de nanopartículas en una variedad de medios de comunicación de proporcionar los incentivos para realizar nuevas investigaciones sobre la interacción de los virus con las nanopartículas de metal.

Métodos
A) las cepas del VIH-1 y líneas celulares

VIH-1 IIIB cepa de laboratorio de VIH-1 en una X4 tipo salvaje (peso) fue obtenido del virus del SIDA a través de la investigación y de reactivos de referencia del Programa, de la División de SIDA, NIAID, NIH. CD4 + MT-2 línea celular se obtuvo de la American Type Culture Collection. El cMAGI VIH-1 reportero células fueron un generoso regalo del Dr Phalguni Gupta de la Universidad de Pittsburgh. Todos los demás reactivos utilizados fueron de la más alta calidad disponible.

CMAGI células se cultivaron en MEDM Dulbecco modificada de Eagle Media (MEDM) (1X) líquidos sin sodio y fosfato de sodio piruvato. La figura medio 4500 mg / L de D-glucosa y L-glutamina (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), con 10% de suero de ternera fetal (FCS), 0,2 mg / mL geneticin (G418), y 0,1 μ g / ml puromycin. MT-2 células fueron cultivadas en RPMI 1640, que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS) y los antibióticos.

VIH-1 IIIB primaria de los aislados clínicos fueron propagadas por subcultura en la MT-2 y cMAGI células. VIH-1 IIIB fue reproducido de acuerdo con el Manual de Virología DAIDS para el VIH Laboratories, versión de 1997, elaborado por la División de SIDA del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y el Instituto Nacional de Salud, y Colaboradores. Alícuotas de células libres de la cultura viral sobrenadantes se utilizaron como inóculo viral.

Todo el trabajo relacionado con VIH-1 en las células, a excepción de TEM análisis, se hizo en un Nivel 3 de Bioseguridad (BSL-3) Laboratorio.

B) Síntesis de las tres preparaciones diferentes de nanopartículas de plata

Nanopartículas de carbono recubiertos de plata probadas en este estudio fueron obtenidos de nanotecnologías, Inc y se utilizan sin más tratamiento. Para obtener más información acerca de la síntesis de estas nanopartículas, por favor, visite http://www.nanoscale.com

PVP recubierto las nanopartículas de plata fueron sintetizados por el método de poliol utilizando glicerina como agente reductor y disolvente. Sulfato de plata (Ag 2 SO 4, de grado reactivo) y poli (N-vinil-2-pyrrolidone) (PVP-K30, MW = 40.000) fueron adquiridos de Sigma Aldrich y 1,2,3-Propanetriol (glicerina,> 99 %) Se adquirió de Fischer productos químicos, todos los materiales fueron utilizados sin ningún tipo de tratamiento adicional. En pocas palabras, que añadió 0,2 g de PVP a un matraz siguiente ronda final mediante la adición de 30 ml de glicerina. PVP Una vez que se disolvió, el aumento de la temperatura a 140 ° C. Después de 30 minutos, hemos añadido 2 mL de 0,015 M Ag 2 SO 4 y reaccionar a la izquierda por 1 h.

Nanopartículas de plata directamente conjugado con albúmina sérica bovina (BSA) moléculas de la proteína se produjeron como se describe siguientes. De nitrato de plata (AgNO 3, 0,945 M), borohydride sodio (NaBH 4, 99%) y 200 la prueba espectrofotométrica de la categoría de etanol se compraron Aldrich. Albúmina de suero bovino (BSA) se adquirió de Fisher y se utilizó sin más tratamiento. En pocas palabras, el sodio borohydride fue añadido a una solución acuosa de nitrato de plata y BSA bajo agitación vigorosa. La razón molar de Ag +: BSA se 28:1, y la proporción molar de Ag +: BH4 - fue 1:1. El volumen de reacción fue de 40 ml, y contiene 13,50 μ mol BSA. La reacción fue autorizado a proseguir durante 1 h, y el producto fue purificado por precipitación a -5 ° C, seguido de filtración en frío etanol.

C) Caracterización de los diferentes preparados de nanopartículas de plata

Microscopio electrónico de transmisión se realizó en una HRTEM microscopio JEOL 2010F equipadas con Schottky de tipo cañón de emisión de campo, ultra-alta resolución polo pieza (Cs = 0,5 mm), y un microscopio de barrido electrónico de transmisión (STEM) con una alta dependencia de anular el ángulo oscuro campo ( HAADF) detector de funcionamiento a 200 kV. En pocas palabras, una gota de cada solución de nanopartículas de plata se colocó sobre una rejilla con Cu lacey película de carbono (Ted Pella), y se permite que se evapore. Tamaño distribuciones para cada preparación de nanopartículas se obtuvieron de TEM análisis basado en la medición de partículas de 400, y 600 partículas en el caso de BSA recubierto las nanopartículas.

UV-visible espectros fueron obtenidos a temperatura ambiente usando un camino de longitud 10 mm en una cubeta de cuarzo Cary espectrómetro de 5000. Todas las soluciones son 30 × diluido en agua desionizada antes de la adquisición de los espectros.

D) Microscopía electrónica de VIH-1 y nanopartículas de plata

Las muestras se prepararon para microscopía electrónica de la siguiente manera: 10 5 TCID 50 muestras de VIH-1 IIIB de células libres de virus fueron tratados con soluciones de los diferentes nanopartículas de plata en una concentración de 100 μ g / ml. Después de 30 segundos, a 10 μ l gota fue en un depósito de carbono recubiertos de níquel TEM red y expuesto a un 2,5% de solución PBS / vapores de glutaraldehído durante 30 minutos. Microscopía se realizó utilizando un JEOL 2010-F TEM equipado con una unidad de EDS Oxford, en una tensión de aceleración de 200 kV y operada en el modo de escaneo usando un detector de HAADF.

E) La inhibición del VIH-1 con las nanopartículas de plata

RPMI mediano o sólo contienen diferentes concentraciones de las nanopartículas de plata se mezclaban con las muestras 10 5 TCID 50 de VIH-1 IIIB de células libres de virus. La mayor concentración de las nanopartículas de plata utilizada fue de 100 μ g / ml. Después de 30 segundos, 2 veces sucesivas diluciones de las soluciones que se han añadido a las culturas de las células diana (2 × 10 5 MT-2 y 2 × 10 5 cMAGI VIH-1 en las células reportero 0.2-0.5 con multiplicidad de infección (moi) de VIH -1 IIIB virus), preparado como se mencionó antes. Cada dilución fue expuesto a cuatro pozos de replicar. Después de eso, las células fueron incubadas en el 5% de CO 2 humidificado incubadora a 37 ° C durante 3-5 días. Evaluación de VIH-1 mediada por la formación de sincitio se realizó para las células MT-2, mientras que para cMAGI células, el porcentaje de transmisión se calcula de la siguiente manera: el número de células teñidas de azul obtenido de la sobrenadante de cada uno de los pozos de prueba se dividió Por el número de células teñidas de azul obtenido de la cultura y en el sobrenadante del control positivo.

F) citotoxidad de nanopartículas de plata contra las células MT-2

La citotoxicidad de las nanopartículas en los preparativos contra células MT-2 se determinó a través de la exclusión de Trypán Azul ensayo. En todos los casos, la concentración inicial de las nanopartículas de plata era de 50 μ g / ml y secuencial de doble diluciones se hicieron mixtas y con 2 × 10 5 células MT-2. Las muestras fueron incubadas a 37 ° C, y las células fueron evaluadas a través de microscopía óptica, después de 3 h y 24 h de la exposición a las nanopartículas de plata. En pocas palabras, una parte alícuota de la suspensión celular fue diluido 1:1 (v / v), con el 0,4% de Trypán Azul y las células fueron contados utilizando un haemocytometer. La viabilidad se expresa como el porcentaje del número de células tratadas unstained a la del número total de células.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Información de apoyo. El archivo es un documento de Word que contiene el tamaño completo de la distribución de carbono recubiertos de nanopartículas de plata evaluadas por TEM
Agradecimientos

Los autores desean agradecer a nanotecnologías, Inc para proporcionar a sus nanopartículas de plata. Elechiguerra JL, JR Morones, y A. Camacho-Bragado agradecer el apoyo recibido de CONACYT-México. JLBurt agradece a la Universidad de Texas en Austin Escuela de Ingeniería y Robert L. Mitchell por su apoyo financiero a través del empuje 2000 Robert L. y Jane G. Mitchell Dotada de Becas de Postgrado en Ingeniería. Este material está basado en trabajo apoyado en virtud de una Fundación Nacional para la Ciencia de becas de investigación de posgrado (para JLB).