Particle and Fibre Toxicology, 2005; 2: 4-4 (más artículos en esta revista)

Liberación de citoquinas de los macrófagos alveolares ambiente expuestos a partículas: la heterogeneidad en relación con el tamaño, la ciudad y la estación del año

BioMed Central
Ragna B Hetland (ragna.hetland @ fhi.no) [1], Flemming R Cassee (f.cassee @ rivm.nl) [2], Marit Låg (marit.lag @ fhi.no) [1], Magne Refsnes ( Magne.refsnes @ fhi.no) [1], Erik Dybing (erik.dybing @ fhi.no) [1], Per E Schwarze (per.schwarze @ fhi.no) [1]
[1] Division of Environmental Medicine, Norwegian Institute of Public Health, P.O. Box 4404 Nydalen, N-0403 Oslo, Norway
[2] Centre for Environmental Health Research, National Institute for Public Health and the Environment, P.O. Box 1, NL-3720 BA Bilthoven, the Netherlands

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Resumen
Antecedentes

Varios estudios han demostrado una asociación entre la exposición al ambiente de partículas en suspensión (PM) y de enfermedades respiratorias y cardiovasculares. La inflamación parece jugar un papel importante en los efectos observados en la salud. Sin embargo, el componente predominante de partículas (s) que impulsa la inflamación todavía no está totalmente aclarado. En este estudio representante gruesa (2.5-10 μ m) y la multa (0.1-2.5 μ m) de muestras de partículas de un occidental, un oriental, un norte y una ciudad del sur de Europa (Amsterdam, Lodz, Oslo y Roma) se reunieron durante tres temporadas ( Primavera, verano e invierno). Todas las fracciones fueron investigados con respecto a la inducción de citoquinas-potencial en la enseñanza primaria macrófagos pulmonares aisladas de rata. Los resultados se relacionaron con los parámetros físicos y químicos de las muestras, a fin de revelar las conexiones posibles entre inflamatoria potencial y características específicas de las partículas.

Resultados

En comparación sobre un gramo por gramo, tanto específicos del lugar y de las variaciones estacionales en la PM-inducida por citocinas se demostraron las respuestas. Las muestras recogidas en la zona oriental (Lodz), y el sur de las ciudades (Roma) parece ser el más potente. La variación estacional es más evidente con las muestras de Lodz, con las más altas respuestas inducidas por la primavera y el verano de muestras. El sitio específico o en la variación estacional de liberación de citoquinas no podía atribuirse a las variaciones en cualquiera de los parámetros químicos. Fracciones gruesas de todas las ciudades eran más potentes para inducir a las citoquinas inflamatorias, interleukina-6 y factor de necrosis tumoral-α de la correspondiente multa fracciones. Los niveles más elevados de elementos específicos como el hierro y el cobre, algunos hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) y endotoxina / lipopolysaccaride parece ser frecuente en las fracciones gruesas. Sin embargo, las variaciones en el contenido de estos componentes no refleja la variación de la liberación de citoquinas inducida por las diferentes fracciones gruesas. Además de polimixina B no afecta a la partícula inducida por liberación de citoquinas, lo que indica que las variaciones en la potencia entre las fracciones gruesas no se explica por endootoxin.

Conclusión

El potencial del ambiente inflamatorio PM demostrado heterogeneidad en relación con la ciudad y la estación del año. Las fracciones de partículas gruesas fueron consistentemente más potente que la multa respectivas fracciones. Aunque un mayor nivel de algunos elementos, PAH y endotoxina se encontró en la fracciones gruesas, la presencia de componentes específicos no es suficiente para explicar todas las variaciones inducidas en la tarde de liberación de citoquinas.

Antecedentes

Anteriores estudios epidemiológicos en Europa han demostrado una heterogeneidad en las enfermedades cardiovasculares y respiratorias después de la exposición al ambiente de partículas en suspensión (PM) [1, 2]. La inflamación desempeña un papel fundamental en el desarrollo a largo plazo de enfermedades pulmonares, y posiblemente también las enfermedades cardiovasculares inducida por partículas. Exacerbación de las respuestas inflamatorias también parece estar implicado en los graves efectos provocados por la exposición a corto plazo a las partículas [3 - 5].

La composición de la tarde está influenciado por las emisiones de diferentes fuentes, tales como el tráfico, las actividades industriales, y la calefacción residencial de larga distancia transportan la contaminación del aire. La PM puede, en ciertas áreas contienen cantidades considerables de minerales partículas generadas por carretera abrasión superficial, debido a la utilización de neumáticos modestas durante la temporada de invierno. En ocasiones, una parte importante de la larga distancia transportados PM consta también de las partículas minerales del seco sur de Europa y África. Además, las variaciones temporales en fuente de emisiones y / o las variaciones estacionales de la temperatura y otras condiciones meteorológicas pueden influir en la composición de ambiente PM. Como resultado, una considerable específicos del lugar y las variaciones estacionales en las características físicas y químicas de las partículas en la contaminación del aire pueden ocurrir.

Tamaño de las partículas es un parámetro crítico debido a la diferencia de la deposición en el tracto respiratorio, sino también debido a los efectos sobre el diferencial de las células pulmonares de por sí. Los datos epidemiológicos sugieren que las partículas finas ambiente puede ser más importante que en el grueso PM-mortalidad asociada y negativos efectos en la salud respiratoria [6 - 8]. Por el contrario, las asociaciones entre la PM y la mortalidad diaria en un entorno en el que la tarde está dominado por la fracción gruesa También se han reportado [9, 10]. Nuestros estudios previos han demostrado que gruesas y finas partículas minerales inducir respuestas diferenciales en las células pulmonares [11, 12]. Además, varios in vivo e in vitro han demostrado los estudios más grandes respuestas inflamatorias de las fracciones gruesas de la tarde en comparación con multa [13 - 15].

Varios componentes químicos pueden influir en el ambiente inflamatorio potencial de las partículas. Con respecto a los componentes inorgánicos, la importancia de los metales ha sido demostrada. La capacidad de las partículas recogidas en el valle de Utah para inducir la producción de citoquinas correlaciona con su contenido de metal [16]. Los metales de transición en la fracción soluble de aceite residual cenizas volantes (ROFA) resultaron ser responsable de una mayor liberación de citoquinas inflamatorias [17, 18]. Sin embargo, esas concentraciones de metales son bastante inusuales y no puede explicar los resultados de salud de todos los estudios epidemiológicos. En otros estudios in vitro con ratas macrófagos pulmonares, sin embargo, respuestas inflamatorias a la tarde no se puede explicar por variaciones en las concentraciones de metales solubles, pero parece atribuible a los componentes insolubles de las partículas [19, 20]. Componentes orgánicos de la PM también puede obtener respuestas inflamatorias [21]. Microbiana componentes vinculados a las partículas, por ejemplo, la endotoxina, puede contribuir a la inflamación potencial ambiente de la tarde. Los estudios in vitro han demostrado más fuerte pro-inflamatorias efecto de las gruesas (2,5 - 10 μ m) que el importe de la multa (<2,5 μ m) de las fracciones PM 10 y atribuyó estos efectos a la endotoxina contenido, a pesar de que algunos de la endotoxina se encontró en fracciones de la multa [14, 22 - 24].

Macrófagos alveolares y los diferentes tipos de células epiteliales constituyen el principal blanco de la inhalación de sustancias tóxicas y de pulmón son, por lo tanto, particularmente importante en la inducción de respuestas inflamatorias en el pulmón. Distintas propiedades de las partículas involucradas en la activación de diferentes mecanismos de captación o el desencadenamiento de las respuestas de las interacciones entre las partículas y los receptores en la membrana plasmática a su vez puede dar lugar a diferentes respuestas de citocinas. Macrófagos en libertad una variedad de citoquinas inflamatorias, la exposición a partículas, como el factor de necrosis tumoral (TNF) - α y la interleukina (IL) -6 [25]. TNF-α es conocido para estimular, entre otros efectos, las células epiteliales de liberar diversas citoquinas que participan en el reclutamiento y activación de células inflamatorias, y también mejorar la respuesta al tratamiento posterior con partículas [26]. IL-6 sirve de chemoattractant de linfocitos [27].

Este trabajo se realizó en el marco de un proyecto patrocinado por la Unión Europea titulado "respiratorios y alérgicos Debido a la inflamación Ambient Particles" (RAIAP). El objetivo general fue evaluar el papel de las partículas en suspensión en el ambiente que causan la inflamación en las vías respiratorias y la inducción y estimulación de las alergias respiratorias. Muestras representativas de ambiente de partículas en suspensión (PM 2.5-10 y PM 0,1-2,5) fueron recolectados en las ciudades de toda Europa espera con diferencias en la composición de la tarde y la intensidad del tráfico (Amsterdam, Lodz, Oslo y Roma) durante la primavera, verano e invierno estaciones. En el estudio que aquí se presenta, se determinó la capacidad de las muestras de partículas de inducir a la liberación de citoquinas pro-inflamatorias TNF-α e IL-6, desde la primaria macrófagos alveolares aislados de ratas. Los datos de estos estudios in vitro y los datos de los estudios de caracterización de partículas [28] fueron relacionados posteriormente con el fin de revelar las posibles relaciones entre el potencial para inducir a los marcadores inflamatorios y la presencia de componentes específicos de las distintas muestras de partículas.

Resultados y discusión
Muestras de partículas

Partículas de la muestra en cuatro grandes ciudades (Roma, Amsterdam, Oslo y Lodz), en representación de la zona sur, oeste, este y norte de Europa utilizando un gran volumen de impactador de cascada (HVCI) [29]. Las ciudades fueron seleccionadas sobre la base de diferencias previstos en la composición química, más que en conocer las diferencias en el estado de salud debido a la exposición PM. En vista de ello cabe mencionar que no tienen por objeto comparar las ciudades explícitamente. Ambos estacionales y las diferencias regionales en la tarde de masas se observaron durante el período de recogida (2001 - 2002) [28]. En general, los más altos niveles de PM se observaron durante el invierno (Lodz y Roma), mientras que los niveles más bajos se observaron en la primavera (Oslo y Amsterdam). Las variaciones en la contribución relativa de las fuentes de contaminación en el interior, así como entre las ciudades, puede ilustrarse con las variaciones observadas en la relación entre las partículas finas y gruesas recogidas durante las diferentes estaciones del año (Tabla 1]. En verano, de la fracción fina constituían el 50 - 60% del importe total de cada ciudad sobre la base de los datos HVCI. Durante el invierno, sin embargo, las partículas finas representa el 77% de la masa total en Lodz frente a 51% en Oslo. Este mayor porcentaje de multa PM en el invierno partículas de la contaminación del aire en Lodz puede explicarse por el gran aumento de la utilización de combustibles fósiles para la calefacción. En Oslo, una relativamente baja cantidad de partículas finas en comparación con el grueso se encontró durante el invierno (51%) y primavera (42%). Esto puede ser explicado en parte por la generación de partículas minerales debido a la extensa superficie de la carretera por la abrasión modestas coches con los neumáticos y la arena rociada sobre las carreteras heladas. Cabe mencionar que la técnica de muestreo de gran volumen no es ideal para determinar las concentraciones de partículas ambiente real en el tiempo y estos valores podrían apartarse de los métodos de referencia.

Liberación de citoquinas en relación con la localización y de la estación

La Figura 1 muestra el efecto de aumento de las concentraciones de PM de IL-6 liberación de los macrófagos alveolares. El grueso muestras recogidas en Lodz durante la primavera y el verano parece ser el más potente, llegando a 440% y 460% de aumento, respectivamente, en comparación con el control. Las fracciones gruesas de verano recogidas en Roma y Oslo indujo mayores niveles de IL-6 de la correspondiente muestra de Amsterdam (370% y 310% frente al 190% en el máximo de aumento) (Figura 1, un carril). Las fracciones gruesas de la temporada de invierno, las muestras, sin embargo, mostraron un orden diferente de potencia en comparación con la primavera y el verano de muestras. Tanto las muestras de Roma y Amsterdam indujo mayores niveles de IL-6, que las muestras de Lodz y Oslo (340% y 300% frente a 165% y 160%, respectivamente). En general, las fracciones de la multa no inducir de manera significativa la liberación de citoquinas, a pesar de un ligero aumento dependiente de la dosis se observó después de la exposición a todas las muestras de verano y de invierno muestra de la multa de Lodz (Figura 1, carril B).

Una clara variación estacional en el potencial para inducir a la IL-6 se demostró entre los recogidos en las fracciones gruesas Lodz (Figura 2, carril A). Un particular menor nivel de IL-6 fue inducido por el invierno muestra en comparación con la primavera y el verano de muestras. En contraste con los resultados de Lodz, el grueso fracciones recogidas durante las diferentes estaciones del año en Roma parecía igualmente potente. El grueso de verano fracción de Oslo inducido un mayor nivel de IL-6 en libertad en comparación con la primavera y el invierno de las muestras, aunque no estadísticamente significativa. La fracción gruesa Amsterdam recogidos durante el invierno inducida por el mayor nivel de IL-6, que está en contraste con las otras tres ciudades. Sin embargo, las diferencias en Amsterdam no alcanzó significación estadística. En general, la más alta pro-inflamatorias potencial parecía que se encuentran en las partículas recogidas durante la primavera y el verano, las estaciones con mayor prevalencia de las alergias.

Ambas fracciones de partículas inducida por una parte relativamente similar patrón de las respuestas con el TNF-α como con la IL-6, a pesar de las respuestas en Oslo, Roma y Amsterdam fueron inferiores a los de IL-6. Los resultados de las fracciones gruesas de cada ciudad se presentan como multiplicado en la Figura 2, carril B. Las fracciones gruesas recogidos durante la primavera en Roma y Lodz demostrado un aumento significativo en la liberación de TNF-α en comparación con el control. La multa fracciones no indujo un marcado aumento en la liberación de TNF-α en cualquier estación o de la ciudad (datos no presentados). Los macrófagos utilizados en este estudio fueron de animales sanos. Un resultado diferente puede haber sido demostrado con cebados o macrófagos activados. Los estudios in vitro han demostrado un aumento de los niveles de PM-inducido respuestas inflamatorias en los macrófagos cebados con LPS en comparación con unprimed [26]. Además, las células epiteliales cebados ha puesto de manifiesto que han aumentado las respuestas a las partículas proinflamatorias [30]. Esto puede implicar que las partículas inflamatoria potente podría ser aún más potente a las personas con inflamación preexistentes.

Liberación de citoquinas en relación con las fracciones gruesas y finas

La liberación de citoquinas inducida por la fracciones gruesas en particular fue muy alta en comparación con la liberación de citoquinas inducida por fracciones de la multa (Figura 1]. En un estudio relacionado con este tema, en la que la rata tipo 2 células fueron expuestas a la gruesa y fina de las fracciones de las muestras recogidas, inducida por la liberación de partículas de MIP-2 demostró un patrón relativamente similar de las respuestas como en los macrófagos [31]. Estos resultados están de acuerdo con otros estudios que informan de que el grueso de las fracciones PM ambiente parecen ser más poderosas que la multa fracciones para inducir respuestas inflamatorias [14, 20, 24, 32]. Los autores atribuyen el mayor potencial inflamatorio de las partículas gruesas a niveles superiores de los componentes bioactivos biológicos vinculados principalmente a la fracción gruesa. En un estudio en ratones, sin embargo, respuestas inflamatorias después de la exposición a finas y ultrafinas fracciones ambiente de partículas son similares o incluso mayores en comparación con el grueso [13]. Las respuestas de muy baja después de la exposición a la multa fracciones observada en nuestro estudio podría ser influenciada por una cierta pérdida de partículas ultrafinas debido a la modalidad de funcionamiento del muestreador de alto volumen [29, 33]. Sin embargo, estamos expuestos a las células A549 igualmente recogido muestras de partículas finas, tal como se utiliza con los macrófagos y un incremento dosis-dependiente de la IL-8 se observó (resultados no publicados). Similares niveles de IL-8 también se demostraron liberación A549 cuando las células fueron expuestas a bajas concentraciones de gruesas, finas y ultrafinas fracciones de las partículas recogidas urbano con un sampler similar, tal como se utiliza en este estudio [34]. La anterior explicación, por lo tanto, parece menos probable. Sin embargo, ha sido demostrado que las partículas de diesel puede tener un efecto supresivo sobre la liberación de citoquinas por los macrófagos alveolares [35]. Por lo tanto, si las partículas de diesel constituyen una parte considerable de la fracción de partículas finas en nuestro estudio, la correspondiente supresión podría ser una explicación.

Liberación de citoquinas en relación con los componentes químicos

Las principales diferencias en la composición química se observó en el de las muestras recogidas RAIAP [28]. El predominio de las partículas de combustión en Lodz se refleja en un alto contenido de zinc, PAH y otros componentes orgánicos en comparación con las otras muestras. En cambio, el ambiente PM en Roma parece ser influenciado por partículas transfronterizo de larga distancia del continente africano, lo que resulta en niveles relativamente altos de los metales y minerales componentes. Amsterdam está cercano al Mar del Norte, y el ambiente PM, por lo tanto, contienen sal marina, así como las partículas transportadas a larga distancia. Típico de Oslo, especialmente en invierno, es un nivel relativamente alto de PAH además de los componentes inorgánicos. La HAP es más probable resultado de la combustión de madera amplias para la calefacción. Temporales y espaciales de variación en la composición química del ambiente, la tarde y la correspondiente variación en la actividad biológica han sido previamente reportados por otros investigadores [20, 36 - 39].

Conclusión

El potencial de la inducción de citoquinas-en la recogida de ambiente PM variado entre la toma de muestras in situ y de la temporada. Claro, también se observaron diferencias entre la gruesa y la multa PM fracciones: las fracciones gruesas fueron consistentemente más potente que la correspondiente multa fracciones. Una simple relación entre la presencia de un componente específico en muestras de las partículas y su potencial para inducir citocinas no se ha podido demostrar.

Métodos
Productos Químicos

Lipopolisacárido (LPS) y sulfato de polimixina B se obtuvieron de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.. Suero fetal bovino (SFB) se obtuvo de Gibco BRL, Paisley, Escocia. Los antibióticos ampicilina y fungizone se compraron de Bristol-Myers Squibb AB, Dinamarca, la penicilina y la estreptomicina y el medio de cultivo RPMI 1640 fueron de BIO Whittaker, Walkersville, MD, EE.UU.. El de inmunoadsorción enzimática (ELISA) ensayos para el análisis de rata TNF-α y la IL-6 se obtuvieron de los sistemas de I + D de Europa, Oxon, Reino Unido. Ottawa polvo (EHC-93) fue proporcionado amablemente por el Dr Renauld Vicente, la Dirección de Salud Ambiental, Ministerio de Salud de Canadá, Ottawa, Ontario, Canadá.

Toma de muestras de partículas

La campaña de toma de muestras se describen en detalle en el informe final del proyecto [49]. En resumen, las partículas del aire ambiente, se recogieron en las ciudades de Amsterdam, Lodz, Roma y Oslo, durante la primavera, el verano y el invierno de 2001/2002. Un alto volumen con un impactador de cascada de múltiples etapas hendidura boquilla impactador se ha utilizado para recoger gruesas (PM 2,5-10) y fino (PM 0,1-2,5) en fracciones de espuma de poliuretano (PUF) por impactación. Las fracciones de las muestras de partículas secas con metanol extraído de la PUFs se prestaron para la caracterización de partículas y los experimentos biológicos [28].

Caracterización de partículas

Caracterización de las muestras recogidas se realizó en el Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente (RIVM), Países Bajos, y se describe en detalle por Cassee et al. [28].

Preparación de las partículas para estudios biológicos

Las muestras de partículas recogidas en seco se suspendieron en 0,9% NaCl a una concentración de 20 mg / ml y agita la noche a la mañana. Las suspensiones son más diluido en medio de cultivo a existencias soluciones de 2 mg / ml. Antes de su utilización en los estudios de la exposición, el balance de soluciones se agita, en un agitador magnetico noche a la mañana. Muestras de partículas en seco, así como las suspensiones de partículas, se almacenaron a -20 ° C. En experimentos destinados a estudiar si endotoxinas estaban involucrados en la respuesta observada, existencias soluciones de partículas fueron tratados con el LPS-vinculante sulfato de polimixina B (10 μ g / ml) durante 1 hora antes además de las células.

Primaria rata macrófagos alveolares

Ratas macho (Crl / Wky) fueron adquiridos de Harlan, Reino Unido. Macrófagos alveolares fueron recolectados por lavado de vía aérea, suspendido en medio RPMI con suplementos y agregó a 35 mm 6 platos y cultura (1,5 × 10 6 / así). No inscritos células fueron eliminados después de 1 hora, mientras que el adjunto macrófagos fueron utilizados para la exposición.

La exposición de los cultivos de células de las partículas

Las células fueron cultivadas en medio de SFB-libre desde el inicio de la exposición y la posterior 6 horas, y 5% de SFB se añadió. Después de 20 horas de exposición en un total de 1 ml / así de la cultura del medio, el medio se recogen y se centrifuga durante 10 minutos para eliminar las células (250 × g) y para eliminar las partículas (2500 × g). Sobrenadantes se almacenaron a -70 ° C hasta el momento de un nuevo análisis de las citocinas inflamatorias. Las respuestas después de la exposición a las fracciones gruesas y finas recogidos dentro de cada temporada se estudiaron en el mismo experimento y repetirá al menos tres veces.

Ensayos de citoquinas

Análisis de las citoquinas inflamatorias (IL-6 y TNF-α) se ha realizado mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA), según el manual del fabricante. El aumento de la intensidad de color se cuantificarán mediante un lector de placas con software (TECAN Sunrise Magallanes con 1,10 V, Tecan Austria, Salzburg, Austria).

Análisis estadístico

Se analizaron los datos de importancia por Ida Análisis de varianza (ANOVA) (Prueba de Tukey). Kruskal Wallis ANOVA de las categorías se utilizó cuando normalidad o la igualdad de los ensayos no Diferencia (Método de Dunn). P <0,05 se consideró estadísticamente significativa.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

RBH realizó en los estudios experimentales, la bioquímica y el análisis estadístico, y preparó el manuscrito. ML, MR y PSE realizó el aislamiento de los macrófagos y contribuyó a la redacción del manuscrito. FRC es responsable de la recogida y caracterización físico-química de las muestras de partículas y contribuyó a la redacción del manuscrito. ED RAIAP coordinó el proyecto. Todos los autores han leído, revisado, aprobado y comentó el manuscrito final.

Agradecimientos

Reconoce agradecidamente E. Lilleaas, T. Skuland, H. y HJ Hopen Dahlman, el Instituto Noruego de Salud Pública, Oslo, Noruega, para la valiosa asistencia técnica. Damos las gracias a AJF Boere, DLAC Leseman y PHB Fokkens, Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente, Bilthoven, Países Bajos, para la toma de muestras y manipulación de las muestras PM. Esta labor fue apoyada por el proyecto RAIAP (respiratorios y alérgicos debido a la inflamación Ambient Particles) - Una Comisión Europea de gastos compartidos-Proyecto de Investigación, QLK-CT-2000-00792.