Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 25-25 (más artículos en esta revista)

Un vínculo entre los niveles séricos elevados de gonadotropina coriónica humana coriónica y la expresión de su madurez funcional del receptor (LHCGR), el síndrome de Down en embarazos

BioMed Central
Subhasis Banerjee (dr_sbanerjee@hotmail.com) [1], Alan Smallwood (dr_avsmallwood@hotmail.com) [1], Anne E Salas (annechambers2000@yahoo.co.uk) [1], Aris Papageorghiou (aris_p@lycos.co . Uk) [1], Hugues Loosfelt (hugues.loosfelt @ kb.inserm.fr) [2], Kevin Spencer (kevinspencer1@aol.com) [3], Stuart Campbell (propscampbell@hotmail.com) [1], Kypros Nicolaides (kypros@fetalmedicine.com) [1]
[1] Harris Birthright Research Centre for Fetal Medicine, King's College Hospital Medical School, Dinamarca Hill, Londres SE5 9RS, UK
[2] INSERM U135, Biochimie hormonale, CHU de Kremlin-Bicêtre, Bat Paul Broca, 3e niveau 78 avenue du général Leclerc, 94275 Le Kremlin-Bicêtre, Francia
[3] Endocrino Dependencia, Departamento de Bioquímica Clínica, Hospital de Harold Wood, Gubbins Lane, RM3 0BE Romford, Reino Unido

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen

Gonadotrofina coriónica humana (hCG) es liberado de la placenta y el trofoblasto está involucrado en el establecimiento de embarazo por el mantenimiento de la secreción de progesterona del cuerpo lúteo. Las concentraciones séricas de hCG se detecta en la circulación materna dentro de las primeras 2-3 semanas de gestación y picos al final del primer trimestre antes de disminuir. En el síndrome de Down (SD) embarazos, el suero de hCG sigue siendo significativamente alto en comparación con la gestación emparejados por edad sin embarazos. Se ha propuesto que el aumento de los niveles séricos de hCG puede ser debido a la hiper-activación transcripcional de la CGB (beta hCG) de genes, o de un aumento de vida media de la hormona hCG glicosilada, o ambos. Otra posibilidad es que los niveles séricos de hCG siguen siendo altas debido a la menor disponibilidad de la hormona del receptor afines, LHCGR, conduciendo a la falta de utilización de hormona. Hemos probado esta hipótesis cuantificando la expresión de la beta hCG (CGB) de ARN, LHCGR ARN y proteínas en LHCGR muestras de las vellosidades coriónicas. Demostramos que coriónica expresión de la beta hCG (CGB) mRNA se correlaciona directamente con los niveles séricos elevados de hCG. El estado de equilibrio de la síntesis de ARNm LHCGR (exones 1-5) en DS embarazos fue significativamente más alto que el de los controles, sino la expresión de larga duración LHCGR ARNm (exones 1-11) en DS es comparable a la de sin embarazos. Sin embargo, la síntesis de alto peso molecular madura LHCGR proteínas se redujo significativamente en comparación con el DS sin embarazos, lo que sugiere una falta de utilización de distribuir hCG en embarazos DS.

Introducción

La incidencia de aneuploidía en los embarazos humanos es inusualmente alto (1-2%) en comparación con otros mamíferos [1]. Monosomies y trisomías juntos representan el 35% de los abortos espontáneos detectado clínicamente (6-20 semanas de gestación), muerte (4%) y lo que es más importante, son la causa principal de incapacidad de desarrollo y el retraso mental de los supervivientes esos embarazos [2 - 4 ]. De todos los embarazos genéticamente comprometida, el síndrome de Down (Trisomía 21, T21) es la más frecuente (1 / 700 nacidos vivos [5]]. La Edward's (Trisomía 18, T18) y Pautau's (Trisomía 13, T13) síndromes se consideran relativamente raros los trastornos del embarazo con una prevalencia de 1 en el momento del nacimiento en 7000 y 29000, respectivamente [6, 7].

Genéticamente, el 89-95% de pacientes con síndrome de Down (SD) de los pacientes llevar un cromosoma 21 extra (chr 21) que se plantea debido a meióticas nondysjunction y suele ser heredado de la madre [1]. Sobre el 1-2% de los pacientes con SD tienen mosaicismo genético (nondysjunction siguientes principios de los embriones en la fecundación), mientras que 3-4% de los casos se deben a la translocación de chr 21 al otro autosome, generalmente chr 14 [8]. Además de la característica variabilidad en el retraso mental, físico y rasgos faciales, cardiacas congénitas gastro-intestinal y defectos, el DS pacientes son también susceptibles de padecer leucemia y Alzheimer's-como la demencia [9 - 11].

Las anomalías cromosómicas en DS y otros trisómicas embarazos son muy a menudo asociados con el aumento o reducción de los niveles de proteínas, factores de crecimiento y hormonas en la sangre materna en comparación con los de los embarazos normales. Por ejemplo, en los embarazos DS (11-14 semanas de gestación), los niveles séricos de gonadotropina coriónica humana beta (β-hCG) y el embarazo asociada a proteínas plasmáticas-A (PAPP-A) las concentraciones suelen ser de alta y baja, respectivamente [12 ].

Gonadotrofina coriónica humana (hCG) es la clave de la regulación de la hormona reproductiva, el embarazo humano. Se trata de un miembro de la familia de hormonas glicoproteína que incluye la hormona luteinizante (LH), folículo estimulante estimulante del tiroides y las hormonas, cada uno de los miembros de los cuales funciona a través de la formación de un no-covalentes heterodimer de dos subunidades, α y β.

En placenta humana hCG es principalmente producido por syncytotrophoblasts y, en cierta medida por extravillous citrofoblastos [13]. Una de las primeras funciones endocrinas de hCG es mantener el cuerpo lúteo que debe producir suficiente progesterona para establecer el embarazo desde el principio. Además, facilita la hCG trofoblasto diferenciación, la remodelación del epitelio y estroma uterino (decidualization) y endometrio para la implantación, la invasión de la espiral arteriolas materna, y de la angiogénesis al actuar sobre el músculo liso vascular y las células endoteliales [14]. En los embarazos normales, a niveles detectables de hCG comienzan a aparecer en la circulación materna en aproximadamente 2-3 semanas después de la concepción, y alcanzan su pico en ~ 11-13 semanas antes de disminuir significativamente en las últimas etapas del embarazo. De hecho, los niveles séricos elevados de hCG en la mitad de la última etapa del embarazo se han asociado con la preeclampsia, dentro de la restricción del crecimiento uterino y el síndrome de Down (SD) [15 - 18].

La hormona hCG transduces señales por medio de la unión a sus específicas LH / hCG receptor (LHCGR) expresado en la superficie de la célula. Dado que los receptores de LH y hCG son idénticos, es a menudo como la LH / hCG receptor (LHCGR) y es codificada por un solo ejemplar, ~ 70 Kb LHCGR gen, localizado en el cromosoma 2p21 humanos [19]. Este receptor es estructuralmente muy similares a otros dos receptores hormonales (estimulante del tiroides y de los receptores de hormona folículo estimulante). El LHCGR gen tiene 11 exones y códigos para múltiples especies empalmados alternativamente (al menos 6) de ARNm. Estas transcripciones son diferentes ARNm iniciado en varios sitios de una región que abarca más de una kilobase aguas arriba de la primera exón [20].

Sobre la base de la estructura y topología, LHCGR es miembro de la rhodopsin / receptores adrenérgicos β-G superfamilia de receptores acoplados a proteína. Agonista (hormona) vinculante para LHCGR permite disociación de la membrana afines proteínas G que regulan la fosfolipasa C, adenylyl ciclasa y los canales iónicos, que a su vez el control de celulares inositol fosfatos, cAMP, Ca +2 y otros mensajeros secundarios [21, 22].

LHCGR es un 701 residuos de aminoácidos de proteínas que contienen tres dominios: un inusualmente grande (340 residuos) N-terminal dominio extracelular que se une hCG, una serpentina transmembrana (TM) de la región que contiene siete TM repite conectados por tres extra-e intracelulares bucles, y Un C-terminal de la cola. El predijo masa molecular relativa (M r) es ~ 75 K, o superior, en función del nivel de glicosilación [23].

Además, alternativamente empalmados mRNAs producir varios truncado dentro de la proteína celular que han isoformas ligando capacidad vinculante, pero son ineficaces en transducing señales [24]. La importancia funcional de todas las isoformas no esta demostrada. Sin embargo, la accesibilidad de la M r 85-95 K biotinylation especies a la superficie, la proteasa y glycosidase (neuraminidasa), sugiere que éstas tienen carácter vinculante y ligando la capacidad de transducción de señales. Por otra parte, el 65-M r 75K contienen proteínas de alta manosa tipo de cadenas laterales que son susceptibles a la endoglycosidase H, y son inmaduros e intracelulares [25 - 27]. La alta masa molecular relativa 165-200K grupo está pensado para ser un dímero de la madurez funcional del receptor [28]. Curiosamente, las especies más pequeñas de proteínas LHCGR (M r 45-51K) se puede detectar en los tejidos o células transfectadas con ADNc [25 - 27, 29].

Missense naturales [30] y la supresión de mutaciones [31] de los humanos los receptores de LH se ha informado de que se asocia con elevados niveles séricos de LH en estos pacientes. Del mismo modo, la concentración de LH que circulan sigue siendo elevada [32, 33] en ratones homocigotos con un gen de supresión de Lhr (Lhr - / -). Además, la falta de expresión de receptores funcionales de citoquinas, debido a mutaciones naturales de los receptores de IFN-γ 1 y 2, se ha vinculado directamente a séricos elevados niveles de IFN-γ en pacientes que sufren de enfermedades infecciosas [34, 35]. Estos informes nos llevó a investigar si el aumento de los niveles séricos de hCG en embarazos DS podría estar vinculada a la expresión de su receptor funcional en las vellosidades coriónicas.

Materiales y métodos
Placentaria tejidos y muestras de vellosidades coriónicas

Este estudio fue aprobado por el comité de ética local de King's College Hospital, Londres, Reino Unido, y se obtuvo el consentimiento escrito de los pacientes antes de la recogida de muestras. Tejido placentario se obtuvo de los pacientes sometidos a la terminación del embarazo, con edad gestacional gama de 7-12 semanas, después del parto vaginal o cesárea. Muestras de vellosidades coriónicas (CVS) se recogió en una cápsula de Petri y materiales que no sean necesarios para el análisis genético fue lavada con Ca +2 / Mg +2 libre de PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se almacena en 500 μ l de ARN Más tarde (Ambion , Huntingdon, UK), que se celebró a las 4 C durante la noche antes de almacenamiento a largo plazo a -20 ° C.

Extracción de RNA y la síntesis de ADNc

Dependiendo de la disponibilidad, hasta 30 mg de CVS fue ampliamente lavados en PBS, homogeneizada en 500 μ l Trizol (Invitrogen) con un tejido de molienda pestle (Anachem, Reino Unido). Posterior extracción de ARN, el tratamiento DNasa I (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.), la síntesis de ADNc se exactamente como se describe anteriormente [36, 37]. En algunos casos, un kit de extracción de RNA Qiagen (Qiagen, West Sussex, UK) y se utilizó ARN se almacenaron a -70 ° C en el agua o etanol.

PCR cuantitativa

PCR cuantitativa se ha realizado mediante el Light Cycler ARN sistema de amplificación en capilares de vidrio y de fluorescencia de hibridación basado en la detección de formato (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania), como se describe [38]. En resumen, los análisis se llevaron a cabo en el dúplex donde tanto la muestra experimental y de un control interno (ACTB y HPRT) estaban a cargo de la misma reacción. Los reporteros Roja LC-640 y LC-705 Roja fueron empleados para generar hibridación sondas para experimentación y de los controles internos y la amplificación de cada cDNA fue grabado por la detección de doble color. Un color indemnización archivo fue creado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics) y fue indemnizado por los ciclos de la PCR en duplex durante cada carrera. En algunos experimentos, el control de reacciones se ejecute al mismo tiempo que las muestras de ensayo, en las mismas condiciones de reacción, pero como solo reacciones. Con el fin de establecer que no hay contaminación cruzada, controles negativos (un completo sin reacción cDNA) se ejecute en cada experimento.

La contaminación cruzada fue evitado por la adición de agua secuencialmente, maestro de la mezcla de reacción (que contiene la enzima, Mg +2 y PCR buffer; Light Cycler Kit de amplificación del ARN, Roche Diagnostics), y de cDNA a un volumen final de 10 μ l. El análisis conjunto a modo de cuantificación incluido desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min seguido de 40 ciclos que consta de los siguientes parámetros para los segmentos 1-3: Objetivo Temp, 95 ° C, 55 ° Cy 72 ° C respectivamente; tiempo de incubación 10 , 7 y 12 seg, respectivamente; Transición tasa de 20 ° C / seg, 20 ° C / seg y 10 ° C / seg, respectivamente, y un único modo de adquisición en el segmento 2. PCR primers, sondas de hibridación y amplificación longitudes se muestran en la Tabla 1. Los datos fueron recogidos automáticamente y filtrada para eliminar los antecedentes por el Light Cycler software que se fija el punto de cruce de todas las diferentes reacciones en contra de la curva estándar. Los datos fueron transferidos a Microsoft Excel para análisis.

Cultivo celular, la extracción de proteína de la placenta y CVS, la electroforesis en gel y Western blots

HEK-293 de la línea celular expresando N-terminal de 362 residuos de aminoácidos humanos LHCGR fue proporcionado amablemente por el profesor Axel Themmen, Universty Erasmus, de Rotterdam, Holanda. El vector de expresión que figura LHR dominio extracelular (ECD, 1-362) fundida a una etiqueta péptido (YPYDVPDYA) de la hemaglutinina 1 (HA1) epítopo de virus de la gripe y la tetraciclina (tet)-promotor inducible. Las células fueron crecido exponencialmente en tet libre de suero bovino fetal antes de la inducción de la noche a la mañana con la tetraciclina como se recomienda.

La extracción de proteínas de cultivos celulares, tejidos con las vellosidades placentarias T-PER (Perbio, Helsinborg, Suecia) y del CVS, tras Trizol lisis se exactamente como se describe anteriormente [36], salvo los 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 fue sustituido por el buffer de 25 MM HEPES OH-, el 8,0. La concentración de proteínas totales en cada extracto se midió por duplicado (Lowry ensayo; BioRad DC sustratos, BioRad, Hemel Hempstead, Reino Unido). Sobre la base de esta estimación, aproximadamente, 10-20 μ g de proteína total fue cargado en cada carril, para cada muestra se CVS 10 μ g por carril. La separación de las proteínas por geles de poliacrilamida-SDS y Western blot fueron descritas [36 - 38]. Ambos caseína 1% y 1% de leche fueron igualmente eficaces en el bloqueo de los agentes de Western blots.

La primaria y secundaria de anticuerpos utilizados fueron los siguientes: control murino IgG (Sigma) a una concentración de 1 μ g / ml, la proteína A-sepharose purificada anti-humano LHCGR anticuerpo monoclonal de ratón (LHR-29) en una concentración de 1 μ g / ml, Anti - β Actina, clon AC-15 (Sigma) y de cabra anti-ratón IgG (H + L) conjugado HRP-(Chemicon International Inc, CA, EE.UU.) en diluciones de 1 en 2000 y 1 en 5000, respectivamente.

Terapia hormonal de ensayos

Paciente de información y formularios de consentimiento se les dio a cada paciente que vino para ecografía en HBRC, King's College Hospital. La sangre venosa (5 + 5 ml) se obtuvieron de los que consintió (en 12-14 semanas de gestación), con y sin anticoagulante. De suero y plasma obtenido por centrifugación (1500 rpm, 10 min a 4 ° C) se alicuotar y almacenados a -20 ° C.

Libre hCG β hCG intacta y se mide a través de la Kryptor Brahms (Brahms AG, Berlín, Alemania) inmunoensayo de acceso aleatorio continuo por un analizador de tiempo resuelto amplificado cryptate método de emisión de fluorescencia. El desempeño de estos métodos se han descrito anteriormente [39, 40].

Densitometría y análisis de datos

Densitometría de autoradiograms se llevó a cabo usando un multi-1D Lane en un programa de Densitometría AlphaImager (1220v5.5, Alpha Innotech Corp San Leandro, CA, EE.UU.), como se describe [36 - 38]. Scan de datos (experimental y control de β-actina) se transfirieron a Microsoft Excel donde la densidad de píxeles de cada carril experimental se normalizó a su correspondiente valor β-actina. Cada experimento se repitió al menos dos veces y media de los valores para cada punto de datos se trazan. Los medios, desviaciones estándar, la varianza (anova) para cada conjunto de datos se calcula utilizando ToolPak de análisis (ATP) de software. Los valores se muestran como media + / - SEM. Un valor para el nivel de significación (P-valor) se calculó utilizando la estadística de Poisson. P <P <0,05 fue considerado significativo. En los experimentos, en donde la expresión del mRNA y los niveles séricos de hormona de la concentración de los datos no se distribuyen normalmente, los valores medianos y el 95% se calcularon los intervalos de confianza y el de Mann-Whitney U no paramétrica a la prueba fue empleada para establecer la significación estadística.

Resultados

El objetivo de este estudio fue examinar la expresión de la placenta LHCGR mRNA y funcional del receptor de la expresión de la proteína con respecto a las concentraciones séricas de hCG en el síndrome de Down embarazos. Para lograr este objetivo, 1152 CVS de los embarazos de alto riesgo fueron recogidos. De estos, 58 fueron el síndrome de Down (SD, la trisomía 21 [T21]), el 22 de Síndrome de Edwards (trisomía 18 [T18]) y 12 fueron el síndrome de Patau (trisomía 13 [T13]) confirmado por bioquímicos, análisis molecular y citogenética. El número de muestras que contenían suficiente tejido para el análisis de RNA fue de 41 para T21, T18 y 14 de 7 para T13.

CGB (hCG β) y LHCGR genes son hyperactivated síndrome de Down en embarazos

La hCG subunidad α se sintetiza en exceso y es común a todos los miembros de esta familia de la hormona, mientras que la subunidad β hCG, que reconoce el receptor afines, que es específico para la hormona. Por lo tanto, a fin de evaluar el coriónica regulación de la hormona, la hCG β expresión de la síntesis de ARNm se midió.

La expresión de β hCG (CGB) mRNA en el CVS cuantitativos se analizaron por PCR en tiempo real (Q-PCR) de amplificación de cDNA. Desde expresión mRNA valores trisómicas embarazos expuestos en un amplio rango de distribución, el intervalo de confianza del 95% y la mediana de los límites de los valores en cada embarazo fueron determinadas condiciones. Este análisis reveló que CGB (hCG β) la expresión de genes en el síndrome de Down CVS fue significativamente mayor (P <0,001) en comparación con la de los controles (Figura 1]. Además, β hCG (CGB) en los niveles de mRNA expresión T18 y T13 embarazos fueron comparables a los de los controles (Figura 1].

La estructura de la de larga duración (FL) LHCGR cDNA humano (exones 1-11), la codificación de la región de dominio extracelular (ECD), región bisagra, transmembrana (TM), y los dominios intracelulares (CIE), de la del receptor, junto con Empalmados alternativamente múltiples isoformas [41 - 43] se muestra en la Fig. 2a. El desarrollo de la primera infancia por sí sola tiene un alto ligando afinidad [44] que, en el TM de la CIE y son necesarias para la transducción de señales [24]. La mayoría de las isoformas exposición deleción del exón 9 y 11 como se observa en ovejas [45], cerdo [21, 27] y [46] de rata. Supresión de secuencias de codificación debido a la alternativa de isoformas de empalme 1-5 mantiene un marco de lectura abierta, pero en el 6 y 7 de isoformas marco turno se introducen como resultado de mutaciones en los codones de parada en el exón 11 y el potencial de producción de los receptores solubles truncado [42, 43 ].

El LHCGR ARNm (exones 1-5) en la expresión DS embarazos fue significativamente mayor (P = 0,0501) en comparación con la de T18, T13 y sin embarazos (Fig. 2b]. La CGB la expresión de genes (Fig. 1] correlacionó positivamente con LHCGR exones 1-5 síntesis de ARNm (coeficiente de correlación, r = 0,61). Estos resultados sugieren que tanto el CGB y LHCGR genes se hyperactivated DS placenta en comparación con los niveles de expresión normal y otros trisómicas (T18 y T13) embarazos. Cabe destacar que el aumento cuantitativo en β hCG (CGB) / LHCGR mRNA producción en el grupo de embarazos T21 (Figs. 1 y 2b] es al menos 3 veces más alta que la observada para el T18 y T13 CVS.

Los resultados descritos anteriormente mostraron un incremento significativo en la transcripción del mRNA LHCGR DS placenta en comparación con la de control de los embarazos. Sin embargo, como se señaló anteriormente, splicing alternativo podría dar lugar a variantes de mRNA que puede no codificar toda la longitud funcional de los receptores. Como una prueba crítica de si el aumento cuantitativo en LHCGR (exones 1-5) en el ARNm DS placenta refleja verdaderamente completos de mRNA del receptor de síntesis, la transcripción de el extremo 3 'del gen (lo que representa el exón 11) se midió por Q - PCR utilizando el mismo conjunto de muestras de cDNA. Los resultados (Fig. 2c] coriónica demostrar que la expresión del exón 11 en el DS es comparable a la de control de los embarazos, lo que indica que una importante población de ARNm en LHCGR DS placenta no contiene partes del exón 11.

En nuevos intentos de medir la longitud completa de las transcripciones LHCGR, hemos probado tres tipos de diseño de primers y sondas para la amplificación de los exones 10-11 por Q-PCR. Ninguno de éstos fue capaz de amplificación de LHCGR específicos de cDNA que β-actina, CGB, IFNGR1, IFNGR2, LIFR y syncytin podrían ampliarse por semicuantitativo, y Q-PCR. El LHCGR exones 7-9 podría ser amplificado por PCR-Q ADNc de la placenta obtenida de los embarazos precoces y tardías. Sin embargo, la intensidad de la señal se redujo en por lo menos 100 veces en comparación con la de los exones 1-5 o el exón 11. Por lo tanto, la cantidad de cDNA en el CVS muestras no fue suficiente para que ya sea semicuantitativo o Q-PCR. Para asegurarse de que la luz de las señales de ciclo, en el exón 11 de amplificación no se deben a la contaminación de ADN, la cantidad equivalente de la DNasa tratados ARNm (no invertir transcrito) correspondiente a experimentales muestras. Amplificación de cDNA sólo se produjo cuando se añadió a la Q-PCR.

Las concentraciones séricas de hCG intacta y β hCG (α y β) son significativamente elevados en 11-14 semanas de gestación en los embarazos con síndrome de Down

De acuerdo con los datos de estudios anteriores [12, 17, 39, 40], los niveles séricos de β hCG en embarazos DS fue significativamente más alto (P <0,01) en comparación con la de sin embarazos. Además, los niveles séricos de hCG β fueron los más bajos en T18 (P <0,01) y se redujo significativamente en T13 (P <0,05) en comparación con el control de muestras de suero (Figura 3a]. Cuando ajustada para la edad gestacional, la media de las concentraciones séricas de hCG en β DS fueron entre 2 y 3,6 veces más altas que las de los embarazos normales (12-14 semanas). Β niveles séricos de hCG una correlación positiva (r = 0,39) con β hCG (CGB) mRNA expresión.

Como se señaló anteriormente, el que circulan las señales de hCG que transduces por su unión a su receptor LHCGR está intacta hCG heterodimer compuesto por dos subunidades α y β. Con el fin de establecer la relación entre el circulante ligando del receptor de hCG y su expresión, que mide el próximo hCG heterodimer concentraciones en suero de los embarazos normales y trisómicas. Este análisis reveló que las concentraciones séricas de hCG en heterodimer DS embarazos (12-14 semanas), fue significativamente superior (P <0,01) en comparación con la de los sueros control (Figura 3b]. La hCG heterodimer concentración en T13 es comparable a los embarazos sin control, pero se redujo significativamente (P <0,01) en los embarazos T18 (Figura 3b].

Estos resultados sugieren que circulan libre y β hCG intacta hetrodimers hCG son abundantes en 11-14 semanas de embarazo en DS. Los datos que se muestra en la Fig. 3b se obtuvieron a partir de un número limitado de muestras de suero de control (n, 18) y DS (n, 24) embarazos predominantemente en 12-14 semanas de gestación. Con el fin de verificar estos datos, la hCG heterodimer concentraciones a las 11, 12, 13 y 14 semanas de embarazo se mide en suero de un gran número de control de los embarazos y DS como parte de los estudios anteriores [39, 40] se compararon. Este análisis reveló que las concentraciones de hCG en heterodimer DS embarazos fueron significativamente más alta que la de los sueros de control en cada punto temporal a prueba (Fig. 3c].

Western blot para establecer la especificidad de los mouse monoclonal anti anticuerpo humano LHR29

LHR29 anticuerpo monoclonal fue originalmente obtenido por la inmunización de ratones con la humana recombinante purificada dominio extracelular del receptor (aminoácidos 75-406) expresada en Escherichia coli. La especificidad de los anticuerpos fue verificado por su capacidad de los receptores de immunoprecipitate recombinante y immunopurify 125 I-hCG complejos de los receptores de las células transfectadas, occidental-blot con el inmunógeno, inmunocitoquímica en células transfectadas con cualquiera de los receptores clonados o un simulacro de vector. Los patrones obtenidos por inmunohistoquímica de testículo humano acompañada de los resultados esperados para un receptor transmembrana específicas de las células de Leydig ([47], y Axel Themmen, comunicación personal). Con el fin de verificar la especificidad antigénica de este anticuerpo, la línea celular HEK 293 expresar LHR desarrollo en la primera infancia (1-362) se ha crecido en presencia y ausencia de tetraciclina. Extraído proteínas se resolvieron a través de un 8% SDS-PAGE, Western borró, y blots se reaccionó con el control del ratón IgG o LHR 29 anticuerpo monoclonal. Con el fin de garantizar que la igualdad de las cantidades de proteínas se transfirieron, el blots fueron teñidas con azul coomassie brillante después de la detección de quimioluminiscencia. Los resultados (Fig. 4 bis, y 4b] LHR29 demostrar que el anticuerpo monoclonal reconoce específicamente por lo menos tres (M r 44-48K) tet-inducible especies de LHCGR expresada in vitro (dos bandas aparecen a emigrar como doublet). Estas tres variantes posiblemente reflejar diferentes niveles de glicosilación. Además, estas especies (M r 44-48K) también son reconocidos por los anticuerpos anti-HA1 en Western blots (Axel Themmen, comunicación personal), que prevé una nueva línea de evidencia de que el anticuerpo de reacción LHR 29 es específico.

Placenta humana expresa por lo menos seis variantes de la proteína LHCGR

Con el fin de examinar la LHCGR proteínas producidas en la placenta humana, los tejidos obtenidos de las vellosidades Semana 7-y 10 Semana de la edad gestacional placenta se extrajeron detergente, no ha reaccionado con el control del ratón IgG específica (no se muestra) y LHR29 en Western blots. Para mayor control del experimento, los extractos de HEK293 (LHR desarrollo en la primera infancia) y también se incorporaron los blots fueron teñidas con azul coomassie después de la detección de quimioluminiscencia. Hemos detectado (Fig. 5a] por lo menos seis grandes LHCGR variantes que van en masa molecular (M r) de 44K-95K (44K, 48K, 52K, 62-68K, 80K y 95K). Estas bandas también fueron detectados por la que se reconoce LHR74 epítopos LHCGR diferente de la de LHR29, pero no cuando es el principal anticuerpo murino IgG (datos no presentados). El Western blot patrones de tejido placentario humano obtenido con LHR29 de anticuerpos son muy similares a las descritas por VuHai-LuuThi et al testículo en la especie porcina [27, 47]. Además, nuestros resultados son plenamente coherentes con los datos más recientes reportados por Bukovsky et al en tejidos humanos [28] independiente, utilizando anticuerpos monoclonales de ratón (anti-LHR mAb clon 3B5), y, en LH inducido por humanos M17 células de neuroblastoma [48] utilizando un Anticuerpos policlonales de conejo (levantado en contra de la N-terminal de péptidos 15-38 secuencia de la rata LH / CG receptor).

Las muestras de vellosidades coriónicas (20-30 mg tejidos) no son suficientes para separar el análisis de ARN y proteínas. Recientemente hemos descrito un método donde el ARN, el ADN y las proteínas pueden ser cuantitativamente recuperado de la misma muestra por Trizol extracción [36]. Los resultados se muestra en la Fig 5b detergente demuestran que la proteína extraída LHCGR variantes de la placenta (Fig. 5a] son idénticos a los observados con Trizol proteínas extraídas de la placenta humana. De hecho, el Trizol-extrajeron las bandas eran algo mayor que el correspondiente detergente extrajeron LHCGR variantes en el análisis de Western blot.

Expresión de alto peso molecular de larga duración LGCGR proteínas se reduce el síndrome de Down en embarazos

Con el fin de comparar la LHCGR ARNm y la expresión de la proteína tanto ARNm y proteínas se extrajeron muestras de la misma Trizol lisado. El LHCGR la expresión de la proteína en el control y genéticamente comprometida CVS fue examinado por Western blot y datos representativos de este tipo de análisis se muestra en la Fig. 6.

El 80-M r 110K LHCGR isoformas son proteínas que se cree es el de larga duración funcional del receptor que se expresa en la superficie de la célula y ha ligando vinculante de transducción de señales y la capacidad [24, 27]. Con el fin de distinguir entre la expresión de larga duración y otros LHCGR isoformas, proteínas normales en trisómicas y CVS fueron separados por electroforesis y ampliado LHCGR variantes se detectó por Western blot (Fig. 6a y 6b]. Un examen visual de la muestra que acaba de que el maduro isofoms (≥ 80 K) fueron menos abundantes en comparación con el DS CVS control de los embarazos. Además, la stoichiometric rendimiento de las variantes (M 44K-52K r) en DS CVS (Fig. 6 bis] parece ser claramente diferente de la de control de CVS (Fig. 6b]. Por comparación directa, el de larga duración funcional isoforma se cuantificó por densitometría de la M r 80K bandas con respecto a β-Actina expresión en cada carril. Cada una de las muestras incluidas en la referencia duplicado (control de los extractos de CVS) fue analizado en por lo menos dos experiencias independientes, y la banda de densidad media se utilizó como medida de expresión de cada muestra. LHCGR expresión de la placenta (M r 80 K) fue más baja en el DS (P <P <0,01), se mantuvo sin cambios en T13 y se redujo ligeramente (P <P <0,06) en T18 CVS en comparación con la de control de los promedios (Fig. 6c]. Heterodimer los niveles séricos de hCG correlacionó negativamente (r = -0,37) con LHCGR M r 80 K en la expresión de la proteína DS embarazos.

Discusión

En este estudio hemos demostrado que a pesar de las altas concentraciones séricas de hCG heterodimer y β hCG en embarazos DS, su autocrina y paracrina efectos en la placenta puede ser severamente afectada por una reducción de la expresión de la hormona del afines funcional de los receptores. La acumulación de altos niveles séricos de hormona de citoquinas o como consecuencia de la falta de señalización mediada por receptores no es sin precedentes [34, 35]. Las concentraciones séricas de IFN-γ son significativamente superiores en los niños que sufren de infección por micobacteria inocua debido a la herencia de la no funcional IFN-γ R1 y 2 receptores [34, 35]. Parcial o total inactivación de los genes LHCGR debido a una mutación somática natural dentro de la secuencia de codificación pueden ser responsables del aumento de las concentraciones séricas de LH en la célula leydig hipoplasia, hipogonadismo masculino, amenorrea primaria y [49, 50].

Existen informes contradictorios sobre la regulación transcripcional de hCG humana α y β mRNA en DS embarazos. Por ejemplo, algunos estudios sugieren que el estado de equilibrio de la síntesis de RNA CGB gen en el síndrome de Down y la edad de gestación coincide con el control de los embarazos son comparables [51], mientras que otros demuestran que la CGB gen se activa [52, 53] o reprimidos [ 54] en las comparaciones de cultivadas in vitro, trofoblasto de la placenta y el control de DS.

El trabajo que aquí se presenta demuestra que cuando la síntesis de ARNm se cuantifica para un gran número de muestras CVS (41), el CGB (hCG β) de genes en la placenta es upregulated DS. Esto sugiere que el conflicto entre los informes anteriores puede deberse al tamaño de la muestra. Además de esto, la edad gestacional de la placenta DS, así como la metodología empleada por los diferentes laboratorios para medir el ARNm (norte de secante y PCR), y para purificar y de cultivo in vitro de citrofoblastos (CT) (discutido por Goshen [55 ]), Podría haber contribuido a los resultados contradictorios. Purificada TC explantes de placentas, tienen una capacidad limitada para diferenciar, en condiciones normales de la tensión de O 2 y exhiben un fenotipo invasivo in vitro [54, 56 - 58]. Purificada TC cultivadas en el 2% de O 2 se someten a un cambio de la tensión en un fenotipo invasivo [59]. En particular, la diferenciación también conduce a la formación de células gigantes multinucleadas en lugar de la polarización de las capas epiteliales ST (la principal fuente de hCG β) con la típica estructura de microvellosidades y extraordinario repertorio de antígenos (Susan Fisher, comunicación personal).

El estado de equilibrio a nivel de transcripción (medido por Q-PCR de los exones 1-5) de la LHCGR gen en DS fue significativamente más alta que la de control de CVS, mientras que, la expresión del receptor en T18 y T13 embarazos no difieren significativamente de la que De la gestación coincide con la edad de control de los embarazos (Fig. 2b]. Sin embargo, una comparación de la expresión del exón 11 del DS control y CVS se indica que una gran proporción de las transcripciones en LHCGR DS CVS no puede ser de larga duración, ya que no contienen partes del exón 11. Esto podría explicar por qué sobre regulación de mRNA LHCGR (exón 1-5) no se correlacionó con la expresión de madurez LHCGR p80 y otros altos M r isoformas que son menos abundantes en la placenta DS (Figs. 2 y 6]. Estos resultados también proporcionan una explicación de informes anteriores LHCGR aumento de los mRNAs de T21 y T18 embarazos en comparación con los controles, donde cDNA común a todas las variantes de empalmados LHCGR mRNAs fue utilizado como una sonda de hibridación in situ sobre la placenta secciones [60]. Curiosamente, semi-cuantitativo mediante amplificación por PCR de la placenta cDNA (LHCGR exones 9-11) y gel de agarosa truncado análisis reveló que los productos fueron muy abundantes en la tarde, frente a los principios, los embarazos (datos no publicados).

Nuestra proteína datos difieren de los de otros [60] que han demostrado un aumento significativo de la proteína LHCGR en T21 y T18 placentas. Sin embargo, esta aparente contradicción se ha reconciliado por considerar que la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido utilizando un anticuerpo policlonal primaria planteadas en contra de la común amino-terminal de 15-38 residuos de la LHCGR péptido [60] se mancha tanto LHCGR maduro y no transducing LHCGR isoformas producidas Empalmados alternativamente LHCGR de mRNAs que han común secuencias N-terminal (Figura 2, y [20, 21, 42, 43]]. Por lo tanto, inmunohistoquímica no sea suficiente para distinguir madura LHCGR de sus isoformas truncado (Fig. 6].

Alternativas promotor uso [20, 61], y empalme diferencial de mRNA para producir diferentes especies de ARNm [21, 41 - 43, 62] y múltiples isoformas de proteínas (Figs. 5 y 6, y [27, 28, 48]] son los Características moleculares de la regulación de los genes LHCGR. Si bien nuestro trabajo implica que podría haber un aumento de la iniciación de la transcripción de genes en LHCGR DS placenta, es necesario trabajar más para determinar si los diferentes promotores son utilizadas en el DS fisiológicamente frente a los embarazos normales. Esto puede ser importante porque en el modelo de ratón transgénico desarrollado por el grupo del Huhtaniemi [61] parece haber un vínculo entre el promotor de la utilización alternativa de empalme y diferenciado en los transgenes. Es interesante observar que la proteína LHCGR múltiples isoformas (Figs. 5 y 6, y [28]] detectados en los extractos de placenta por Western blot se expresan también en la LH inducido por células de neuroblastoma humano [48]. ¿Cuántas de estas isoformas son capaces de secuestrar hCG por ligando vinculantes está actualmente bajo investigación.

La relevancia clínica de este informe se deriva de la importancia de hCG en el establecimiento y mantenimiento de la placenta y el desarrollo fetal en el embarazo humano. Teniendo en cuenta el reciente descubrimiento de una gran función de LH / hCG en la distribución de flujo sanguíneo cerebral [63], neurosteroidogenesis fetal y el desarrollo de las funciones sensoriales y autonómica [64], la reducción de la expresión funcional de la proteína en la placenta LHCGR puede tener largo alcance Consecuencias. De hecho, la activación patológica de las células cerebrales microglial abundantemente expresando LHCGR, se ha relacionado con la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas con un alto circulante LH [48, 65]. Algunos siguen siendo cuestiones pendientes que hay que saber, incluso si la reducción de la expresión funcional de la placenta en LHCGR isoformas descritas aquí refleja una reducción de expresión similar en el cerebro fetal que pudieran afectar el desarrollo sensorial y autonómica en DS bebés, y si la reducción de la expresión funcional LHCGR Se puede atribuir a mutaciones somáticas o de una copia extra del cromosoma 21.

Agradecimientos

Agradecemos a los numerosos pacientes en el King's para explorar esta investigación y la amabilidad de prestar su consentimiento para obtener CVS, el Dr Vanessa Sangala en el King's para proporcionar los tejidos de la placenta muy embarazos precoces, el Dr Axel Themmen de proporcionar LHR expresando línea celular HEK 293 , El Dr Alan Hardy en el King's para proporcionar espacio de laboratorio en la fase inicial de este estudio. Agradecemos el generoso apoyo financiero de la Fundación de Medicina Fetal, Reino Unido.