Cancer Cell International, 2005; 5: 24-24 (más artículos en esta revista)

P53 y Beta-Catenin la actividad durante el tratamiento de estrógeno osteoblastos

BioMed Central
Nalini Chandar (nchand@midwestern.edu) [1], Rasleen Saluja (lavender@imsa.edu) [1], Peter C Lamar (plamar@midwestern.edu) [2], Kevin Kolman () [kkolma@midwestern.edu 1], Walter C Prozialeck (wprozi@midwestern.edu) [2]
[1] Street, Downers Grove, IL 60515, USA
[2] Street, Downers Grove, IL 60515, USA

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Resumen
Antecedentes

Este estudio se realizó para examinar la relación entre el gen supresor tumoral p53 y la proteína de señalización nuclear de beta-catenina en la diferenciación ósea. Cruz hablar entre p53 y la beta-catenina vías se ha demostrado y es importante en la tumorigénesis y daño en el DNA, donde la desregulación de la beta catenina activa p53. En este estudio, hemos utilizado estrógenos como tratamiento de los osteoblastos un paradigma para estudiar la relación entre las dos proteínas en la diferenciación osteoblástica.

Resultados

Estamos expuestos osteoblástica de las células como ROS17/2.8 a 17-beta estradiol (E2), en un ensayo a corto plazo, y estudiado la distribución celular y la expresión de beta-catenina. Se encontraron beta-catenina a ser varias veces hasta regulada siguientes E2 tratamiento. Los niveles de p53 y su actividad funcional reflejado el visto cambios cuantitativos en la beta-catenina. Fosfatasa alcalina, un marcador temprano de la diferenciación osteoblástica, se incrementó de manera similar a la beta-catenina y p53. Con el fin de determinar si existe una relación directa entre la fosfatasa alcalina y la expresión de beta-catenina, hemos utilizado dos enfoques diferentes. En el primer enfoque, el tratamiento con LiCl, que se sabe que activar la beta-catenina, causó un aumento de siete veces en actividad de la fosfatasa alcalina. En el segundo enfoque, transfección transitoria de tipo salvaje beta-catenina en osteoblastos aumento de la fosfatasa alcalina actividad dos veces más de los niveles basales, lo que demuestra que la versión beta catenina expresión puede afectar directamente a la fosfatasa alcalina expresión. Sin embargo aumento de la actividad beta catenina no se asoció con un aumento en su actividad a través de la señalización TCF / LEF mediada la transcripción. Análisis de inmunofluorescencia p53 y beta-catenina localización mostró que E2 primera causado un aumento de la beta-catenina citosólica seguido de la acumulación de beta-catenina en el núcleo. Localización nuclear de p53 se ha detectado en varias células.

Expresión de p53 fue acompañada de la distribución de la beta-catenina en el citoplasma de células y fronteras. Un sub población de células de la tinción con firmeza para ambas proteínas parecen ser apoptosis.

Conclusión

Estos resultados sugieren que la interacción entre p53 y la beta-catenina vías de señalización pueden desempeñar un papel clave en la diferenciación osteoblástica y mantenimiento de la homeostasis tisular.

Introducción

La organización de las células en tejidos y órganos es controlada por los mecanismos moleculares que permiten el control de las células de interactuar con sus células vecinas y de la matriz extracelular. Cell-el reconocimiento y la adhesión de células son esenciales en los procesos de desarrollo, la diferenciación y el mantenimiento de la arquitectura del tejido. El cadherins familia de Ca 2 + dependientes de las células y sus moléculas asociadas, tales como beta-catenina son los principales componentes de la maquinaria de adhesión celular y desempeñan funciones centrales en estos diversos procesos [1]. La trans-cadherins son proteínas de membrana que median Ca 2 + dependiente de células-la adhesión celular. Beta catenina es una proteína multifuncional que se asocia con el dominio intracelular de cadherins. Además de proporcionar un vínculo físico entre las células, adherente ocasiones presentan estas proteínas influyen diversas vías de señalización. Beta-catenina es un componente importante de la Wnt / Wingless vía de señalización y puede actuar como un factor de transcripción en el núcleo de un co que actúa como activador del factor potenciador linfoide (LEF) / TCF familia de proteínas que unen el ADN [2].

El gen supresor tumoral p53 actúa como un guardián del genoma y una pérdida de su función se ve en una mayor variedad de tipos de cáncer [3]. P53 actos por los daños de detección de ADN de la célula y dirigir a la detención o someterse a la apoptosis [1, 3]. De esta manera, p53 se piensa para evitar la excesiva acumulación de las mutaciones que pueden dar lugar a tumores malignos. Sin embargo, las actividades de p53 no puede limitarse a las funciones supresor de tumor. La acumulación de pruebas indica que la función de p53 puede ser crítica durante la diferenciación de los diversos tejidos y órganos [4 - 7]. Defectos en p53-null embriones se ha informado, lo que sugiere que p53 puede tener un papel en la organización de los tejidos durante el desarrollo [8, 9]. Tenemos, en estudios anteriores, demostró una función de p53 en la diferenciación osteoblástica y de expresión de la proteína osteocalcina hueso específico [10]. En estudios con p53 nula y ratones heterocigotos, también hemos demostrado que una disminución de la expresión de p53 interfiere con la capacidad de los osteoblastos para expresar osteocalcina [11]. Durante osteoblástica diferenciación in vitro, la proliferación es seguida de la deposición de la matriz y la mineralización. Fosfatasa alcalina es generalmente considerado como un marcador temprano de la diferenciación osteoblástica, osteocalcina mientras que se considera un marcador tarde. En nuestros estudios con estrógenos, hemos demostrado p53 hasta que se regula su actividad y que se asocia con la detención del ciclo celular y la expresión de marcadores de diferenciación osteoblástica en lugar de la apoptosis [12, 13].

Cruz hablar entre p53 y la beta-catenina vías se ha demostrado y que parece ser especialmente importante en la tumorigénesis y daño en el DNA, donde la desregulación de la beta catenina es conocida para activar p53 [14, 15]. Debido a la importancia de la cadherins y beta-catenina en la diferenciación de los tejidos, quisimos determinar si este tipo de cruz hablar con p53 existe en osteoblastos bajo condiciones fisiológicas. Se observó expresión de la apoptosis varios relacionados con la detención del ciclo celular y proteínas durante el tratamiento a corto plazo de las células óseas con estrógenos [13]. Expresión de varias caspasas han demostrado ser necesarios para la expresión de marcadores óseos durante la diferenciación osteoblástica [16]. El tratamiento con 17-beta estradiol no dio lugar a ninguna apreciable la muerte de las células apoptóticas [12]. En estudios informaron aquí, tratamos de investigar si 17-beta estradiol podría modular la expresión y la distribución subcelular de la beta catenina y la forma en que podría referirse a la expresión de p53.

Resultados
17-beta estradiol (E2) hasta regula la expresión de beta-catenina en las células osteoblásticas osteosarcoma

ROS17/2.8 células que expresan establemente 13 copias de una secuencia de p53 vinculante (ROS-PG13CAT) fusionado a un cloranfenicol acetil transferasa (CAT) de genes se utilizan para estudiar los efectos de los estrógenos endógenos sobre los cambios en la actividad funcional de p53. La unión de p53 endógeno a la PG-13CAT secuencia y la posterior activación de la expresión génica fue estudiada mediante el análisis de la actividad CAT, tal como se describe en estudios anteriores [17]. En todos los demás aspectos, esta línea celular es representante de ROS 17/2.8 células osteoblásticas osteosarcoma una línea que se utiliza ampliamente para estudiar la diferenciación osteoblástica. Estas células fueron tratadas con E2 durante períodos de tiempo distintos, tal como se describe en virtud de los métodos y de la proteína resultante se separó en SDS PAGE y analizada por Western Blot. Como puede verse en la Figura 1A, un aumento de la beta-catenina expresión se produjo dentro de las 6 h de tratamiento y llegaron a un máximo de 16 h de tratamiento E2 seguido de un descenso y un segundo pico durante 48 h después del tratamiento E2. El primer aumento fue menos espectacular que el segundo aumento de la beta-catenina (10 vs 30 veces más).

P53 actividad funcional paralelos cambios en la expresión de beta-catenina en el tratamiento E2

P53 función es la supervisión de la medición de la actividad CAT en ROS-PG-13 células. Como puede verse en la Figura 1B, la activación de la transcripción p53 actividad se incrementó alrededor de 4 veces E2 después de 16 h de tratamiento seguido de un descenso y un aumento correspondiente al cambio visto en la beta-catenina en el intervalo de 48 h (aproximadamente 17 veces). La expresión de p53 es conocido por acompañar a la beta-catenina y la activación También se cree que ser críticos en la regulación de la función beta catenina [15]. La expresión de p53 se mide también por el oeste blot y se encontró que era de alta después de 16 h, y se mantuvo alta hasta las 48 h de tratamiento E2 (no se muestra).

Fosfatasa alcalina, un marcador temprano de la diferenciación ósea se incrementa durante el tratamiento con 17-B-estradiol

Actividad de la fosfatasa alcalina fue medida durante el mismo intervalos de tiempo mediante un ensayo colorimétrico. Si bien el aumento de la fosfatasa alcalina de manera constante con el tratamiento E2, la actividad de la enzima mostró un claro repunte durante el intervalo de 48 h (Figura 1C]. Si bien la inicial inducción de la actividad de la fosfatasa alcalina se produjo con un aumento de la actividad de la beta-catenina, el posterior impulso a su actividad, se observó durante 48 h correspondiente a la gran aumento de la actividad de la beta-catenina.

¿Existe una relación directa entre la beta-catenina expresión y actividad de la fosfatasa alcalina?

Con el fin de determinar si un aumento de la beta-catenina nuclear señalización de la actividad se asocia con una mayor actividad de la fosfatasa alcalina, se utilizó una LiCl tratamiento como un modelo para la activación de la beta-catenina. El tratamiento con LiCl es conocida para inhibir la actividad de GSK, que es fundamental para la fosforilación e inactivación de la beta-catenina función [18]. Immunofluorescent tinción de beta-catenina reveló un aumento transitorio en la expresión de beta-catenina en el núcleo de ROS-PG-13 en 24 h 10 mM LiCl células tratadas pero no en el control de NaCl células tratadas (no se muestra). Proteína lisados de las células tratadas del mismo modo, ya sea con o LiCl NaCl se realizarán las pruebas de la actividad de la fosfatasa alcalina. Como puede verse en la Figura 2, LiCl células tratadas mostraron un aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina 24 h después del tratamiento, en comparación con un menor de 2 veces en la activación de las células tratadas NaCl (Figura 2].

Transitorios sobreexpresión de tipo salvaje beta-catenina en las células ROS-PG13 aumenta actividad de la fosfatasa alcalina, así como la actividad transcripcional p53

Con el fin de determinar si sobre-expresión de la beta-catenina produce efectos similares sobre la fosfatasa alcalina, transfectadas transitoriamente salvaje tipo beta-catenina plásmido en las células PG13-ROS. Control de las células fueron transfectadas con no específicos de ADN. Actividad de la fosfatasa alcalina fue medida en el control, simulacros de transfección y beta-catenina de las células transfectadas 24 h más tarde. Hubo un pequeño pero estadísticamente significativo aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina en células beta catenina transfectadas en comparación con células que no recibieron específicas de ADN (Figura 3A]. El mismo experimento se repitió también con una constitutivamente activa beta-catenina (B-catenina S33Y) y se obtuvieron resultados similares (no se muestra), lo que sugiere que la beta-catenina expresión facilita la expresión de fosfatasa alcalina en osteoblastos de rata.

Proteína lisados de las células transfectadas transitoriamente fueron sometidos a CAT de ensayo para la determinación de p53 funcional de la actividad durante el mismo período de tiempo. P53 actividad fue de 5 veces más altos que en las células de tipo salvaje transfectadas con beta-catenina en comparación con el control de las células (Figura 3B], que muestran que un aumento paralelo en la actividad de p53, no puede estar limitada a las condiciones de daño en el DNA, pero también se produce bajo condiciones fisiológicas.

Subcelulares distribución de la beta-catenina durante el tratamiento

Con el fin de determinar la localización de la beta-catenina en el protocolo de tratamiento, se realizaron análisis de inmunofluorescencia de las células tratadas con estrógenos (Figura 4]. Las células fueron cultivadas a confluency y cambió a un 2% de carbón tratadas medios de comunicación durante 24 h antes de la exposición a la 17-beta estradiol. Al inicio del experimento (0 tiempo), la beta-catenina tinción fue visto sólo en los cruces entre las células adherentes y fue indetectable intracelularmente. 24 h después del tratamiento con 17-beta estradiol, hubo un dramático aumento de la cantidad de beta-catenina en las células, la mayor parte de la beta-catenina parecía estar en el citoplasma y periurbanas nucleares región. Por 48 h fuerte tinción de beta-catenina puede ser detectado en el núcleo de un número significativo de células.

Sin cambios en la beta-catenina actividad transcripcional en el tratamiento E2

Desde que se observó tinción nuclear de beta-catenina, se llevaron a cabo experimentos para determinar si la beta-catenina de señalización a través de TCF / LEF familia de factores de transcripción se activó. Estamos transfectadas transitoriamente el tipo salvaje TCF / LEF elementos de respuesta (TOPFLASH) o la secuencia mutante (FOPFLASH) seguido de tratamiento con E2 tratamiento. Ningún cambio significativo en luciferase actividad E2 se observó durante el tratamiento (Figura 5]. La validez del ensayo se comprueba mediante LiCL tratamientos (Figura 5 insertar). Estos resultados indican que la beta-catenina endógeno de señalización no está activado durante E2 tratamiento a pesar de que la expresión de la beta-catenina se observó en los núcleos de las células tratadas.

P53 expresión durante 17-beta estradiol tratamiento

Los patrones de distribución de p53 también fueron supervisados por inmunomarcación. La tinción de inmunofluorescencia para p53 también mostraron un patrón heterogéneo. La expresión de p53 fue alta en el núcleo de una serie de células aisladas. Entre las células teñidas firmemente que para p53, algunos de ellos fueron apoptóticas y contrarrestar la tinción con reactivo de Hoescht mostró un núcleo picnótico. En otros casos fuerte tinción fue evidente en los núcleos que aguarda morfológicamente normales. P53 la presencia en el núcleo también fue confirmado con Western-Blots citoplasmáticas y nucleares de las fracciones (no se muestra). Su presencia en el núcleo correlacionado con su actividad funcional, medida por el CAT ensayo.

Una mejor comprensión de la relación entre las dos proteínas se puso de manifiesto cuando manchadas de ambas proteínas simultáneamente y de un representante sobre el terreno se muestra en la figura 6. Tres tipos de asociación son evidentes. Fuerte tinción nuclear de p53 fue acompañada de beta-catenina en las células de fronteras (flechas). Cuando ambas proteínas están presentes en el núcleo, la célula apoptótica es generalmente (roto flechas). Cuando la tinción intracelular de beta catenina era fuerte estaba en su mayoría contenidas en el citoplasma cuando p53 decorado el núcleo (cabeza de flecha).

Discusión

En estudios anteriores, hemos demostrado el gen supresor tumoral p53 hasta que se rige por los estrógenos y siendo importante para differentiative funciones en el hueso [12, 13]. En los estudios informó aquí, nos muestran que la beta-catenina expresión es el aumento de los estrógenos durante el tratamiento de los osteoblastos. Este gran aumento de la beta-catenina expresión que hemos observado puede ser el resultado de una relación directa, ya sea aumento de la expresión de genes, o de estabilización de la beta-catenina citosólica. Con respecto a esta última posibilidad es importante señalar que, en otros tipos de células, los estrógenos se ha demostrado que inhiben la actividad de GSK lo que se traduce en la estabilización de la beta-catenina [18].

La asociación de beta catenina con aumentos de la activación de la fosfatasa alcalina expresión es también muy interesante, pero no es completamente nuevo. Esta asociación ha sido recientemente detectado en varios tipos de células de fosfatasa alcalina donde juega un papel importante en el comportamiento diferenciado de la célula [19 - 21]. Estudios recientes han implicado la wnt vía de señalización y de beta-catenina en la regulación de la expresión phosphase alcalina en osteoblastos [21]. Parece que la beta-catenina es capaz de aumentar la fosfatasa alcalina aunque indirectamente, porque no TCF sitios de unión que se han detectado dentro de la fosfatasa alcalina de genes [22].

El papel de p53 en la regulación de la beta-catenina se entiende mejor en condiciones de daño en el DNA y la tumorigénesis [15]. Estabilización de la beta-catenina se ha observado a causa de la estabilización de p53 a través de la inhibición de su degradación [14, 23, 24]. Si bien es posible que la beta-catenina resultados en la estabilización de p53, el consiguiente aumento de p53 no es responsable de la apoptosis, una actividad que está regulada por p53 en el daño del ADN. En cambio, bajo condiciones fisiológicas, p53 aparece para vigilar el medio ambiente tal que un anormal aumento de la beta catenina en el núcleo resultados en la apoptosis, mientras que en otras células de la presencia de p53 en el núcleo impide la acumulación de beta-catenina. Beta catenina, en estas condiciones, parece ser relegado a la membrana plasmática.

En los estudios que aquí se muestra el tratamiento con 17-beta estradiol aumenta la expresión de beta-catenina y su causa en la migración al núcleo. Estrógeno, puede mediar en este sentido por su acción sobre la actividad GSK como se ha visto en otros tejidos [25]. Sin embargo, la beta-catenina en el núcleo de expresión no da lugar a la activación de la señalización a través de su TCF / LEF factor de transcripción sitios de unión. Hay varias razones para que esta observación. Como se ha señalado anteriormente, el nivel de la señalización a través de la vía canónica puede ser baja y por debajo de los límites de detección utilizando TCF / LEF reportero construcciones [26]. También es posible que la beta-catenina no podrá actuar directamente a través de la vía Wnt canónico, pero interferencias con otras vías para generar una respuesta. Se ha demostrado que la beta-catenina señalización no funcionar de manera independiente pero con sinergia la morphogens como BMP-2 para inducir a los primeros fenotipos ósea en células indiferenciadas [21, 22]. De la misma manera, el tratamiento con estrógenos se ha observado para mejorar la unión de la beta-catenina para receptores de estrógenos alfa y beta en el colon humano y células de cáncer de mama [27], y también participar en el transactivation genes de respuesta de los estrógenos. Esto sugiere que la beta-catenina puede funcionar como un mediador de los distintos agentes hueso específico para inducir a principios de hueso fenotipo. En este contexto, es interesante el hecho de que la beta-catenina y LEF1 reprimir la expresión de genes de la osteocalcina, un marcador de la tarde hueso fenotipo [28].

Si bien el papel de los estrógenos en el hueso y de protección agente anabólico está bien establecido, el mecanismo de acción es ahora sólo el entendimiento a nivel molecular [29, 30]. El estrógeno no afecta a los osteoblastos por genotropic mecanismos que van a aumentar el período de vida de los osteoblastos por su acción sobre la membrana plasmática, proteínas de señalización [31]. Antiapoptótico mecanismo de los estrógenos en osteoblastos es transitoria y no está claro si p53 juega un papel en este proceso. De manera similar a los receptores estrogénicos, p53 ha demostrado de obligar a la beta-catenina resultante en su estabilización y activación transcripcional [23]. P53 también es capaz de inhibir la expresión de TCF-4 directamente vinculante para el promotor del gen [32]. Este tipo de regulación puede ser importante para mantener las interacciones célula-célula y prevenir la apoptosis. Estos tipos de señalización cruz pueden ser pertinentes e importantes para la diferenciación osteoblástica en oposición a la proliferación osteoblástica y puede depender de la crítica de medio ambiente celular. P53 se sabe que interactúan con un gran número de proteínas [33], y estas interacciones pueden determinar el resultado final de la celda. P53 la capacidad para detectar el medio ambiente permiten la detención del ciclo celular y la diferenciación en algunas circunstancias y en otros casos la apoptosis. Expresión de la fosfatasa alcalina una diferenciación marcador en el hueso puede ser facilitada por la beta-catenina nuclear actividad. Sin embargo una vez que el aumento de la fosfatasa alcalina es, la actividad de p53 puede resultar fundamental para mantener el comportamiento diferenciado de la célula por asegurarse de beta-catenina se mantiene en la celda en lugar de las fronteras dentro del núcleo. Se requieren estudios adicionales para comprender cómo las interacciones entre los receptores de estrógenos, la beta-catenina, p53 y las proteínas relacionadas con el fin de facilitar el proceso de diferenciación.

Conclusión

Nuestros datos muestran que la actividad de la beta-catenina es modulada de estrógenos durante la diferenciación inducida osteoblástica y su aumento se asocia con un aumento de la fosfatasa alcalina y p53. La localización celular de p53 endógeno y beta-catenina parece ser mutuamente excluyentes durante el tratamiento de estrógenos y refleja el papel de p53 en la regulación del crecimiento y la diferenciación.

Métodos
Establecimiento de líneas celulares

La línea celular ROS 17/2.8, una rata osteosarcoma línea celular, fue proporcionado amablemente por el Dr G. Rodan (Merck, laboratorio de investigación, West Point, PA). Las células fueron cultivadas en medio esencial mínimo con α-F12 con 10% de suero fetal bovino en una atmósfera modificada de 95% de aire y 5% de CO 2 a 37 ° C. Esta línea celular contiene un tipo salvaje de p53 endógeno [17] y pueden ser inducidas a mineralizan en la cultura y expresar los genes asociados con etapas avanzadas de diferenciación. El ROS17/2.8 células fueron transfectadas establemente con el plásmido PG-13-CAT (una especie de regalo del doctor B. Vogelstein, Johns Hopkins University, Baltimore, MD). Este plásmido codifica 13 copias de una secuencia de ADN p53 vinculante fusionado a un gen reportero CAT) [17]. En el presente estudios de las células transfectadas con este plásmido (denominado ROS-PG13) las células se utilizan para supervisar la actividad transcripcional de p53 endógeno.

De cultivos celulares de las condiciones de tratamiento y con 17 β-estradiol

E2 tratamiento de las células fueron expuestas a los medios de comunicación libres de fenol rojo antes y durante el tratamiento con E2. La forma soluble en agua, el 17 β-estradiol (Sigma, St Louis, MO) fue utilizado en la concentración de 10 -11 M. E2 células utilizadas para el tratamiento fueron expuestos a un 2% de carbón tratado con suero que contiene rojo fenol libre de los medios de comunicación 24 horas antes del tratamiento con E2. Para los experimentos que requieren E2 durante más de 24 horas, con los medios de comunicación E2 fresca se mantuvo en las células. A menos que se menciona, todos los experimentos se realizaron utilizando E2 a una concentración final de 10 -11 M. Esta concentración se basa en los resultados obtenidos con nuestros estudios anteriores, en donde hemos visto máxima inducción de p53 en 10 -11 M - 10 -12 M [12]. Las células fueron tratadas durante períodos de tiempo distintos que van desde 0-72 h.

Transitorios Transfections

Para beta-catenina transfections, hemos utilizado HA-β-catenina (WT beta catenina) y β-catenina S33Y (un mutante constitutivamente activa), una especie de regalo del doctor Ben-Ze'ev, Weizmann Institute, Rehovot, Israel. Las células fueron transfectadas con Superfect (Qiagen), en placas de 10 cm de 24-48 h seguida de la lisis de proteínas. La cantidad total de ADN utilizada se mantuvo en pie de igualdad en estos experimentos. Misma cantidad de proteína se utiliza para la medida de la fosfatasa alcalina y de la actividad CAT.

Medición de la actividad CAT

CAT actividad de ROS-PG13 células después del tratamiento se utilizó como medida de la actividad de p53 ADN vinculante y refleja la función de p53 en cualquier momento. Células cosechadas fueron suspendidas en solución salina amortiguadora, y luego un 0,25 M Tris buffer de pH 7,8, perturbado por 3 ciclos de congelamiento-deshielo. Los sobrenadantes fueron recolectados después de la centrifugación y se calienta a 65 ° C durante 10 minutos para inactivar acetylase actividad celular. Se midieron las concentraciones de proteína por el método de Bradford y la igualdad de cantidades de proteína se utilizaron en los ensayos. CAT actividad fue determinada por medio de líquidos scintillation contar, y se midió en un rango lineal de cloranfenicol acetilación de tal manera que la fracción acetilado es proporcional a la actividad real. Todas las mediciones se llevaron a cabo en tres muestras. Otros detalles son los descritos anteriormente.

Medición de la actividad Luciferase

Para reportero ensayos, las células fueron transfectadas con la beta-catenina responda firefly luciferase reportero plásmidos TopFlash (promotor de tipo salvaje) o FopFlash (Mutant promotor) (Upstate biotecnologías) durante 48 h. Tres horas después de transfección, las células reciben 17-beta estradiol a una concentración de 10-11 M de los tiempos indicados. Las células fueron expuestas a LiCl durante 16 horas, lisadas y la misma cantidad de proteína se utilizó para la medición de la actividad luciferase. Todas las mediciones se llevaron a cabo en tres muestras y experimentos se repitieron por lo menos tres veces.

La tinción de inmunofluorescencia

Beta-catenina y p53 se visualizaron indirecta por inmunocitoquímica, utilizando un conejo anti beta catenina (Zymed Laboratories Inc, San Francisco, CA.) O un ratón anti-p53 (1C12) (Tecnología de Señalización Celular, Beverly, MA.) Como el principal Anticuerpos. ROS-PG13 células fueron chapada en coverslips tratadas con E2 y como se ha descrito anteriormente. Las células fueron fijadas en el hielo y el metanol permeabilized fría durante diez minutos. Las células fueron bloqueados con 10% de suero de cabra durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras fueron incubadas durante 1 hora con el anticuerpo primario seguido de un-30 minutos de incubación con una cabra, de conejo anti-TRITC-conjugada o de cabra, anti-ratón-FITC conjugado. Las células fueron vistos con una Nikon Eclipse 400 microscopio de fluorescencia utilizando y 100 × 40 × objetivos. Las imágenes digitales fueron capturados con una cámara digital Spot (instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI), utilizando tiempos de exposición automática y la configuración de ganancia para el brillante campo de las imágenes. De campo oscuro fluorescencia imágenes fueron capturados mediante un ajuste de ganancia de 16 y tiempos de exposición de 3 s de verde y 1 s de rojo y azul. Las imágenes digitales fueron procesados con el Image-Pro Plus paquete de software de análisis de imágenes (medios de comunicación cibernética, Silver Spring, MD).

Controles negativos consistía en que se incubaron las muestras sin anticuerpos primarios. Todos etiquetado experimentos se repitieron al menos tres veces y fueron altamente reproducible.

Immuno Blotting

Proteína lisados se prepararon utilizando el reactivo H-PER (Pierce, Rockford, IL), en combinación con un inhibidor de la proteasa cóctel, Complete Mini (Roche, Mannheim, Alemania). Veinte y cinco microgramos de cada proteína lisado fue sometido a 10% SDS-PAGE, y trasladado a immun membrana PVDF-Blot (Bio-Rad, Hercules, CA). Expresión se determinó a través de conejo anti beta catenina (Tecnología de Señalización Celular, MA) y HRP de cabra anti-conejo conjugada (Zymed Laboratories Inc.CA). Membranas fueron desarrolladas utilizando mayor quimioluminiscencia (Amersham International, Amersham, Bucks, Reino Unido).

Alcalinas Phosphastase

Actividad de la fosfatasa alcalina fue medida mediante un ensayo colorimétrico cuantitativo con para-nitrofenol fosfato como sustrato utilizando un kit disponible comercialmente (Sigma Chemical Company, St Louis, MO).

Los análisis estadísticos

Las diferencias en los medios de los resultados experimentales se analizaron por su significación estadística con la utilizó un modelo lineal combinado con un procedimiento de comparación múltiple (Tukey Kramer prueba de comparaciones múltiples).

Agradecimientos

Esta labor fue apoyada, en parte por la subvención R15 CA098113 a NC de Instituto Nacional del Cáncer y en parte por la subvención R01 ES006478 (PMC) del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental y el Medio Oeste de fondos de la Universidad de Carolina del Norte. Los autores agradecidamente gracias a los Dres. Rodan, Vogelstein y Ben Ze'ev para sus regalos de los reactivos y Vicki Sears por su ayuda con el manuscrito.