Journal of Carcinogenesis, 2005; 4: 11-11 (más artículos en esta revista)

En el espectador efectos inducidos por los rayos UV inestabilidad genómica: Los antioxidantes inhiben la demora en la mutagénesis inducida por ultravioleta AyB de radiación

BioMed Central
Jostein Dahle (jostein.dahle @ labmed.uio.no) [1], Egil Kvam (egil.kvam @ nesodden.vgs.no) [1], Trond Stokke (trond.stokke @ labmed.uio.no) [1]
[1] Department of Radiation Biology, The Norwegian Radium Hospital, Montebello, 0310 OSLO, Norway

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Resumen
Antecedentes

La inestabilidad genómica es característico de muchos tipos de cáncer humano. Recientemente, se informó de que la radiación ultravioleta induce elevación de las tasas de mutación y de la inestabilidad cromosómica para muchas generaciones de células después de la irradiación ultravioleta. El aumento de las tasas de mutación de las células inestables permiten que la acumulación de aberraciones que posteriormente dar lugar a cáncer. La radiación ultravioleta A, que actúa principalmente por el estrés oxidativo, y la radiación ultravioleta B, que en un principio los actos por la absorción de ADN y en directo los daños al ADN, ambas producidas genomically clones de células inestables. En este estudio, hemos determinado el efecto de los antioxidantes sobre el retraso en la inducción de mutaciones de los rayos ultravioleta. Tardía mutaciones son indicativos de la inestabilidad genómica.

Métodos

Tardía mutaciones en el hipoxantina phosphoribosyl transferasa (hprt) gen se detectó al incubar células en la matanza selectiva de mediano hprt mutantes de 8 días después de la irradiación, seguido de un período de 5 días en medio normal antes de determinar las frecuencias de mutación.

Resultados

La UVB inducido por retraso hprt mutaciones se inhibió por los antioxidantes catalasa, glutatión reducido y superóxido dismutasa, el glutatión reducido, mientras que sólo tuvieron un efecto significativo sobre la UVA retrasado mutaciones inducidas. El tratamiento con antioxidantes sólo había menores efectos sobre la primera mutación frequenies, salvo que la disminución de glutatión reducido UVB inducido principios de la frecuencia de mutación en un 24%. Incubación con glutatión reducido se demostró un incremento significativo de la cantidad intracelular de glutatión reducido.

Conclusión

Los fuertes efectos de estos antioxidantes indican que la inestabilidad genómica, que es inducido por los rayos ultravioleta A fundamentalmente diferentes y la radiación ultravioleta B, es mediado por especies reactivas del oxígeno, incluyendo peróxido de hidrógeno y de los productos. Sin embargo, las células asumir ni catalasa ni SOD, mientras que la incubación con glutatión produjo un aumento de los niveles intracelulares de glutatión. Anteriormente, hemos demostrado que el retraso en las mutaciones inducidas por rayos ultravioleta puede ser inducida a través de un espectador y el efecto que este efecto es 5 veces mayor que la radiación de UVB de la radiación UVA. Por lo tanto, proponemos que los antioxidantes inhiben una inducida por la radiación ultravioleta espectador efecto y que el efecto se transmite a través de la media y por medio de una transferencia interna entre las células, como la brecha de la comunicación intercelular ocasiones, de las radiaciones UVB y sólo por este último mecanismo de la radiación UVA .

Antecedentes

La inestabilidad genómica es una característica distintiva de la carcinogénesis polietápico [1]. La inestabilidad es probable que acelerar la tasa de mutación de las células inestables y les dan ventaja sobre el crecimiento de las células normales. Ha quedado establecido que la radiación ionizante provoca la inestabilidad genómica en células de mamíferos, en forma de un persistente aumento de los diversos tipos de cambios genéticos, como mutaciones, los intercambios de cromátidas hermanas y aberraciones cromosómicas que durar muchos de células generaciones después de la exposición [2]. Los mecanismos de inducción y mantenimiento de la persistencia de estos cambios son en gran medida desconocidos. Sin embargo, es probable que las radiaciones ionizantes inducida por la inestabilidad genómica se mantiene para muchas generaciones de células por factores tales como la persistencia de la inducción de daño del ADN por aumento de los niveles de estrés oxidativo, las mutaciones en las enzimas de reparación del ADN inducidas por la radiación o de regulación de los propenso a errores Mecanismos de reparación del ADN [3].

Las radiaciones ionizantes causas tan sólo una pequeña fracción de los cánceres humanos, y de los tipos y ubicaciones de daño en las células por la radiación ionizante son diferentes de los de otros factores de estrés ambiental o estrés endógeno [4, 5]. Hemos optado por utilizar la inducción de la inestabilidad genómica por ultravioletas A (UVA radiación, 320 - 400 nm) y la radiación ultravioleta B (UVB radiación, 290-320 nm) como nuestro modelo de sistema [6]. Radiación UVB es un carcinógeno completo que es la principal causa de la no-melanoma, cáncer de piel, tales como carcinomas de células escamosas [7]. La radiación UVA se sospecha que juegan un papel en la inducción de la genomically inestable melanoma maligno [8, 9]. Tanto la radiación UVA y UVB inducir inestabilidad genómica en células de mamíferos, en forma de retraso en mutaciones genéticas que se producen 10-20 generaciones de células después de la exposición [6]. La inestabilidad de los clones de células con mutaciones se retrasó también chromosomally inestable.

Radiación UVB actos inicialmente por la absorción de ADN y en la producción directa de los daños de ADN en forma de dímeros de pirimidina y otros photoproducts [10]. En cambio, la radiación UVA actúa principalmente en la presencia de oxígeno y la generación endógena de fotosensibilizadores por especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células expuestas [11]. Así, la radiación UVA induce un tipo de estrés oxidativo que se asemeja endógena por el estrés oxidativo o la inflamación por otras fuentes endógenas [12]. Sin embargo, posteriormente la radiación UVB también provoca estrés oxidativo en cierta medida, especialmente en forma de peróxido de hidrógeno y peróxidos lípidos [13, 14], la radiación UVA y también inducir dímeros de pirimidina [15]. Sin embargo, el tiempo y los espectros de rayos UVA cursos inducida por ROS y daño en el DNA son muy diferentes de las de los UVB [16].

ROS están involucrados en muchos aspectos de la biología, como la aterosclerosis, el envejecimiento, mutagénesis y carcinogénesis [17]. El aumento de los niveles de ROS se han encontrado en genomically inestable clones de células inducida por la radiación ionizante [18], y el antioxidante catalasa ha demostrado inhibir la UVA inducida retrasado la formación de micronúcleos [19]. Antioxidantes reducir la oxidación de biomoléculas por ROS y otros oxidantes y puede ser un factor en la reducción de la incidencia de muchos tipos de cáncer humano, incluido el cáncer de piel, por el alto consumo de té, frutas y hortalizas [20 - 22].

Glutatión reducido (GSH), la catalasa y la superóxido dismutasa (SOD) son antioxidantes solubles en agua [23]. GSH reduce a un amplio espectro de los oxidantes, mientras que catalasa y SOD específicamente reacciona con el H 2 O 2 y superóxido, respectivamente [23]. Catalasa y SOD no son tomadas por las células, pero GSH extracelular puede desglosarse de la membrana plasmática enzima γ-glutamiltransferasa (GGT), que elimina la γ-glutamil fracción, y los productos resultantes pueden ser emprendidas por las células y estimular intracelular GSH síntesis [31]. H 2 O 2 es un oxidante débil y poco reactivo. Sin embargo, se pueden convertir en el altamente reactivo radical hidroxilo a través de la reacción de Fenton hierro catalizado. H 2 O 2 podría ser producido por una serie de diferentes enzimática o no enzimática (SOD, oxidasas, peroxidasas y hydrogenases) procesos [23]. La radiación UV puede activar la flavina contienen NAD (P) H oxidasas, que posteriormente conducen a la producción de H 2 O 2 [24].

Recientemente se demostró que la radiación UV-mutaciones inducidas retraso podría ser inducida a través de un espectador efecto [25]. El espectador efecto fue de 5 veces más altos de la radiación UVB que para los rayos UVA. Los factores mediadores en el espectador efectos son desconocidos, pero las especies de oxígeno reactivo son posibles candidatos. Se postula que los antioxidantes añadido después de la radiación UVA y UVB son inhibidores potentes de la inestabilidad genómica se manifiesta como retraso mutaciones.

Materiales y métodos
Línea celular y condiciones de cultivo

Fibroblastos de hámster chino (células V79) se cultivaron en medio RPMI 1640 (FCA, Austria), complementado con un 10% de FCS (PAA, Austria), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 μ g / ml), L-glutamina (2 MM) y los siguientes antioxidantes (Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.): 1000 UI / ml de un catalasa 20,000 UI / ml de solución madre en PBS, 5 mM GSH de una solución madre de 0,1 M en PBS (pH ajustado a 7,4 ) O de 500 UI / ml SOD de una solución stock de 7500 UI / ml en PBS.

Mediciones de la radiación UV -

La irradiación de las lámparas se mide rutinariamente con un salón PMA 2200 fotómetro (luz solar Co, Filadelfia, PA, EE.UU.) antes de cada tratamiento. Los espectros de la lámpara (Figura 1] y la irradiancia total de las lámparas se mide por una irradiancia-2000 USB calibrada espectrómetro (Avantes, Eerbeek, Holanda), como se describe anteriormente [6].

Irradiación UV-protocolo

Las células fueron sembradas en 25 cm 2 frascos (Nalge Nunc, Naperville, IL, EE.UU.) el día antes de la irradiación. Las células fueron irradiadas desde arriba en la cadena PBS. La lámpara de rayos UVA contiene un 3 kW Hg-Xe luz de la bombilla y de filtros para eliminar la radiación UVB no deseados y la luz visible (Sellamed 3000 lámpara, Sellamed, Gevelsberg, Alemania). La irradiancia de la lámpara de rayos UVA es 436 W / m 2. Los frascos de transmisión 392 W / m 2. La lámpara UVB contiene un banco de seis tubos fluorescing (TL-20W/01RS, Philips, Amsterdam, Holanda). La irradiancia de la lámpara UVB fue de 23,3 W / m 2. Los frascos de transmisión 18,6 W / m 2.

Medición de la supervivencia

Ochocientos células fueron sembradas 18 h antes de la exposición a la radiación UVA y UVB. Los antioxidantes se añadieron inmediatamente después de la irradiación. Las células fueron incubadas durante 6-7 días después de la irradiación de células en medio, lavarse con 9 mg / ml de NaCl, fijada con alcohol absoluto y teñidas con una solución saturada de azul de metileno. Mayores de 50 colonias de células fueron contados manualmente.

Medición de los principios de HPRT mutaciones

Las células fueron irradiadas con radiación UVA o UVB. Los antioxidantes se añadieron inmediatamente después de la irradiación. Las células fueron subcultured el tercer y sexto día después de la irradiación. El día después de los ocho millones de células de una irradiación Se sembró en 4-6 100 mm platos en el medio con 5 μ g / ml 6-thioguanine (6TG) (Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.) y 200 células por triplicado en 60 mm platos Medio sin 6TG. Siete días después de la siembra de las células fueron lavadas, fijadas y teñidas. Las imágenes se obtuvieron de los platos con un scanner y software casero se utiliza para contar las colonias [26]. La frecuencia de mutación, m, (número de células mutantes por millón) se calculó mediante la ecuación 1:

Donde M es el número total de mutantes contados, C es el número total de células de semillas (generalmente 1 millón) y ce es la eficiencia de la clonación.

Medición de la demora en HPRT mutaciones

El procedimiento utilizado para determinar las mutaciones retraso que se ha descrito antes [25]. En breve, sin embargo, fueron irradiados con células de la radiación UVA UVB o radiación. Inmediatamente después de la irradiación fue sustituido por PBS soporte de HAT (0,2 mM hipoxantina, 0,4 μ M aminopterin y 75 μ M timidina) (Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.). Aminopterin (Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU.) bloquea la síntesis de novo de los precursores de ADN, matando las células que carecen de la purina de salvamento vía (HPRT mutantes), mientras que la de tipo salvaje células sobrevivir [27]. Cuatro días después de la irradiación de células subcultured y de nuevo se sembró en medio con HAT. Cuatro días más tarde, las células fueron subcultured de nuevo, pero ahora se incubaron en medio ordinario (sin HAT). Después de cinco días en medio ordinario, un millón de células fueron sembradas en la 3-6 100 mm de platos por medio de la dosis de 5 μ g / ml 6TG y 200 células por triplicado 60 mm platos por dosis en medio sin 6TG. Los antioxidantes se añadieron inmediatamente después de la irradiación y utilizado hasta la siembra en medio con 6TG. Seis días después de la siembra de las células fueron lavadas, fijo, teñir y cuenta como se ha descrito anteriormente. La frecuencia de mutación fue calculado por la ecuación 1. Cabe la posibilidad de que el retraso en HPRT mutantes fueron detectados a principios mutaciones que eran resistentes al tratamiento aminopterin. Sin embargo, cuando los diferentes UV-13 y X inducidas por la radiación HPRT-clones se probaron para el crecimiento en medio HAT, sólo cuatro células en 25 millones de células formadas de plata de las colonias después de 7 días de crecimiento. Así, el ensayo utilizado fue válida para la detección de mutaciones de retraso.

Citometría de flujo

Las células fueron lavadas dos veces con PBS y se incubaron con 50 μ M monochlorobimane (MCB) durante 45 minutos, tal como se describe anteriormente [28]. Posteriormente, las células fueron trypsinsed y manchadas de 1 μ g / ml de yoduro de propidio (PI). Las muestras fueron analizadas en un flujo FACS DIVA cytometer (Becton Dickinson, EE.UU.) equipada con un argón (Spectra Física, EE.UU.) y un láser de criptón (coherente, EE.UU.) sintonizado a 488 nm y UV, respectivamente. Adelante de dispersión (FSC), de dispersión lateral (SSC) y PI fluorescencia (> 630 nm), se midieron en el primer foco (488 nm, 200 mW). La adquisición se ha desencadenado sobre el FSC señal, y la zona de la señal IP se midió y se usa para eliminar las células muertas puerta. MCB fluorescencia (465-505 nm) se entusiasma con 50 mW de luz ultravioleta (351/356 nm) en la segunda láser interceptar.

Estadísticas

Kruskal-Wallis de una vía de análisis de varianza de los rangos se utilizó para la prueba de las diferencias entre los grupos de tratamiento. Rango de Mann Whitney suma de prueba, el método de Dunn y estudiante t-test se utilizaron para la comparación de los dos grupos de tratamiento versus grupos de control. Un nivel de significación de 0,05 fue utilizado a menos que se note.

Resultados

Para investigar el efecto de especies reactivas del oxígeno producido después de la radiación UVA y UVB y el retraso en la primera hprt mutaciones, así como la supervivencia celular, células irradiadas tratadas con tres tipos de antioxidantes. Las células fueron cultivadas en medio de antioxidantes inmediatamente después de la irradiación y hasta la siembra en medio selectivo para la determinación de las frecuencias mutante, y hasta la fijación de la determinación de la supervivencia celular.

La supervivencia de las células después de la radiación UV

Altas frecuencias de mutación fueron ventajosa para obtener una alta sensibilidad del tratamiento antioxidante. Por lo tanto, la dosis de 321 kJ / m 2 de radiación UVA y 8,1 kJ / m 2 de la radiación UVB-fueron seleccionados en el presente estudio. Esta elección se basa en la figura 2 de ref [25], lo que demuestra que la fracción de los principios de hprt mutantes aumenta con la dosis hasta 321 kJ / m 2 para la radiación UVA y hasta 8,1 kJ / m 2 para la radiación UVB, por encima de la cual La fracción mutante llega a una meseta. Por demora en mutaciones, 321 kJ / m 2 de la radiación UVA y 11,3 kJ / m 2 de radiación UVB resultados en el máximo retraso en la frecuencia mutante (Figura 2 de ref [25]]. Estas dosis resultó en alrededor de un 36% la supervivencia celular para la radiación UVA y 33% para la supervivencia celular radiación UVB (Tabla 1]. Las dosis son fisiológicamente relevantes puesto que corresponden a los tiempos de exposición al sol de mediodía en verano de 2-5 horas en Finlandia y de media hora en Italia [29, 30]

La radiación UV clonigénicas disminución de la supervivencia de las células significativamente (t-test, p <0.01), pero ninguno de los antioxidantes aumento de la supervivencia de las células irradiadas V79 significativamente (Tabla 1]. También hubo ninguna diferencia significativa entre el tamaño de las colonias de células que habían sido tratados con antioxidantes o sin tratamiento (datos no presentados). Ambos irradiado y no irradiado células dividen con mayor frecuencia que cada 24 horas [6]. No obstante, la radiación UV como resultado significativamente menor que las colonias de células no irradiado en la medición de la radiación poco después de la supervivencia ( "Células semilla antes de la radiación" de las columnas de la Tabla 1], lo que puede indicar que las células irradiadas creció más lento que el no irradiado por un tiempo después de la radiación . El clonigénicas supervivencia de los rayos UVA y UVB-tratados con células fue disminuido ligeramente en comparación con las células de control 13 días después de la radiación, pero no de forma significativa, lo que sugiere solamente una cantidad limitada de retraso en la muerte celular. Hubo al parecer, ningún efecto del tratamiento sobre HAT clonigénicas supervivencia, ya que no había diferencia significativa entre las células no irradiado semilla antes de la radiación y no irradiado HAT células tratadas sin semillas 13 días después de la radiación. Sin embargo, hubo algunos efectos a largo plazo de los antioxidantes. Para la radiación UVB, catalasa y GSH aumentó significativamente la supervivencia. Para irradiar células SOD y GSH disminuyó significativamente la eficiencia de la clonación, que sugieren que a largo plazo de incubación con SOD y GSH pueden ser tóxicos.

Principios de mutaciones inducidas por la radiación UV -

A principios hprt mutaciones se midieron después de una expresión período de 8 días en medio normal. Ambos 321 kJ / m 2 de la radiación UVA y 8,1 kJ / m 2 de radiación UVB aumentó significativamente el mutante frecuencias por encima de principios de control de frecuencia (Figura 2]. El tratamiento con antioxidantes después de la irradiación sólo había menores efectos sobre la pronta efecto mutagénico de la radiación UVA y UVB (Figura 2]. Sin embargo, redujo significativamente el GSH UVB principios de la frecuencia de mutación inducida en un 24%, lo que sugiere una oxidativo componente para principios de mutaciones inducidas por los rayos UVB. Los antioxidantes parecen aumentar la frecuencia de mutación de fondo. Sin embargo, los cambios no fueron significativos.

Tardía mutaciones inducidas por la radiación UV -

Tardía hprt mutaciones se midieron después de 8 días de HAT medio para eliminar a principios mutaciones, seguido por 5 días en medio normal. Ambos 321 kJ/m2 de la radiación UVA y UVB 8,1 kJ/m2 de radiación aumentó significativamente el retraso mutante frecuencias superiores a la frecuencia de control (Figura 3]. Figura 3A muestra que GSH redujo significativamente la formación de retraso hprt mutaciones después de la radiación UVA en un 74% en comparación con la radiación UVA sola (p <0,05). SOD y catalasa no tiene efecto significativo sobre la demora en la mutagénesis inducida por UVA. Los antioxidantes tienen un efecto mayor sobre el retraso inducido por UVB mutaciones (Fig. 3B): catalasa, SOD y GSH reducido la frecuencia de la mutación en un 85%, 94% y 77%, en comparación con la radiación UVB sola, respectivamente (p <0,05). Ambos catalasa y GSH descomponer el H 2 O 2. Por lo tanto, los resultados sugieren que un aumento persistente en el H 2 O 2 estaba involucrado en la formación de retraso mutaciones.

Medición de nivel intracelular de GSH

El fluorocromo monochlorobimane (MCB) se utilizó para medir si la incubación con GSH podría aumentar los niveles intracelulares de GSH. Las células fueron tratadas con 5 mM GSH durante 4 días, lavada y teñida con 50 μ M MCB, que se han traducido en un aumento significativo de la fluorescencia. La fluorescencia relación entre las células tratadas y no tratadas con células de GSH fue de 2,0 ± 0,4 (media ± DE).

Discusión

Estamos aquí informe que tanto la radiación UVA y UVB inducido retrasado hprt mutaciones en fibroblastos de hámster chino V79. Las mutaciones inducidas por varias generaciones de células después de la radiación UV son una indicación de la inestabilidad genómica. La UVB inducido por retraso hprt se inhibió de mutaciones mediante la adición de los antioxidantes catalasa, superóxido dismutasa y GSH después de la irradiación, mientras que sólo el GSH tenido un efecto significativo en la UVA retrasado mutaciones inducidas. Los fuertes efectos de estos antioxidantes indican que el estrés oxidativo tiene un papel importante en el mantenimiento de aumento de las tasas de mutación mucho después de la exposición a la radiación UV. El aumento de las tasas de mutación de las células inestables permiten que la acumulación de mutaciones que posteriormente dar lugar a cáncer.

Recientemente, se demostró que un grado mucho mayor de espectador participa en efecto inducido por UVB UVA que en la mutagénesis inducida por retraso [25]. UV-retrasado mutaciones inducidas se midieron con el mismo método que en el presente documento, que permite un alto grado de contacto con la célula-célula, y con un método de la clonación en la que retrasó las mutaciones se midieron en cada uno de los clones de células [6]. UVA y UVB-inducida por mutagénesis retraso fue de 4 y 19 veces más altos, respectivamente, cuando se utiliza el método actual, en comparación con el método de la clonación. La diferencia en el grado de espectador mutaciones inducidas retraso entre la radiación UVA y UVB se podría explicar por los resultados actuales. Si se parte del supuesto de que los factores de mediación de la transeúnte retrasado mutaciones inducidas son de larga vida especies reactivas del oxígeno, como H 2 O 2, entonces debe antioxidantes inhiben el efecto espectador. Sólo GSH inhibe UVA retraso en la mutagénesis inducida y GSH, SOD y catalasa inhibido UVB inducido por retraso en la mutagénesis (Fig. 3]. Células probabilidad, a ninguna de GSH, SOD ni catalasa. Sin embargo, el desglose de GSH extracelular puede ser iniciado por la membrana plasmática enzima γ-glutamiltransferasa (GGT), que elimina la γ-glutamil fracción, y los productos resultantes pueden ser emprendidas por las células y estimular la síntesis intracelular de GSH [31]. Esta hipótesis está respaldada por un aumento al doble en monochlorobimane-fluorescencia de las células incubadas con 5 mM GSH durante 4 días, en comparación con el control de las células. Por lo tanto, para inhibir la UVA mutagénesis inducida por el retraso intracelular nivel de antioxidantes tiene que ser mayor y el espectador efecto puede ser tomada como un efecto que se transfiere entre las generaciones de células o brecha a través de los cruces. De hecho, la inhibición de la brecha de la comunicación intercelular ocasiones por dieldrín disminuyó significativamente el retraso en la inducción de mutaciones [25]. Por otra parte, catalasa y SOD, que sólo son eficaces fuera de las células, inhibido UVB mutagénesis inducida retrasado, pero no tan eficaz como el GSH. Por lo tanto, gran parte de la UVB inducido espectador efecto es que se sugiere que sea un efecto que se transfiere a las células vecinas a través de la mediana. Esto puede ser un mecanismo de transeúnte retrasado mutaciones inducidas sólo para los rayos UVB, y que viene además de los relacionados con el espectador efecto entre células o brecha a través de los cruces. En conclusión, el retraso en la inducción de mutaciones pueden dividirse en tres categorías: 1) Directamente mutaciones inducidas retrasado debido a la inestabilidad genómica causado por mutaciones en los genes guardián o cuidador [32], 2) inducida por un espectador efecto de transmisión de generación en generación de las correspondientes Brecha a través de células o uniones, y 3) inducida por un espectador efecto de transmisión a través del medio.

Catalasa descompone el H 2 O 2 con el agua y el oxígeno mientras GSH reduce un espectro más amplio de los oxidantes, incluyendo el H 2 O 2. GSH descompone el H 2 O 2 en una reacción catalizada por la glutatión peroxidasa y reacciona con el H 2 O 2 productos aguas abajo. H 2 O 2 es un oxidante débil y es poco reactiva [23]. Sin embargo, el peróxido de hidrógeno y de sus más reactiva los productos, como los peróxidos lípidos y el radical hidroxilo, pueden actuar como factores clastogénico [33] y, por ende, demora en producir aberraciones cromosómicas y mutaciones. Por lo tanto, la inhibición de la UVB retraso en la mutagénesis inducida por catalasa y GSH puede indicar que el H 2 O 2 se produce en las concentraciones mutagénico en el período del 8 al 13 días después de la irradiación. Esta conclusión está en consonancia con los de informes anteriores que muestran que el peróxido de hidrógeno puede inducir inestabilidad genómica [34, 35]. UVB mutagénesis inducida retrasado también se inhibió por SOD. Se ha demostrado que el superóxido, que se convierte en peróxido de hidrógeno por SOD, puede actuar como un factor clastogénico y cromosoma inducir daño [37]. Así, la superóxido también pueden estar involucrados en UVB inducido por retraso en la mutagénesis. Además, se ha demostrado que a medio V79 células cosechadas de 22 horas después de la exposición ultravioleta C contiene factores que pueden aumentar la frecuencia de mutación de las células [36]. La identificación de tales factores clastogénico es claramente un desafío clave para la investigación de radiación.

Uso de dihidrorodamina 123, que se convierten en fluorescentes cuando oxidadas por ROS, incluyendo el H 2 O 2, genomically inestable clones de células expuestas significativamente elevados niveles de estrés oxidativo en comparación con el V79 de control de las células [38]. De acuerdo, inducida por la radiación ionizante genomically inestable clones también han aumentado significativamente los niveles de estrés oxidativo [39]. Curiosamente, la inducida por la radiación ionizante genomically inestable clones ha elevado número de mitocondrias disfuncionales con el aumento de la producción de ROS, en comparación con las células normales. Por lo tanto, es tentador especular que la radiación UV-inducida por la inestabilidad genómica también se produce a través de daño a la mitocondria y un posterior aumento en el estrés oxidativo. Sin embargo, no hemos sido capaces de detectar la radiación UV-inducida persistente aumento en el estrés oxidativo en el conjunto de la población de células V79 (J. Dahle, resultados no publicados), sólo en genomically inestable clones. Por lo tanto, es posible que sólo una pequeña fracción de las células irradiadas obtiene un aumento en la producción de ROS, y que estas células son las mismas que las células tienen un genoma inestable y se retrasan las mutaciones.

Los antioxidantes catalasa, SOD y GSH disminuyó el UVB inducido por retraso en la frecuencia de mutación significativa, pero casi no tuvo efecto sobre los principios de la frecuencia de mutaciones inducidas por los rayos UVB, con la excepción de un leve pero significativo efecto de los rayos UVB en GSH principios de mutaciones inducidas. La razón de esta discrepancia puede ser las diferencias en los tipos de principios y el retraso inducido por la radiación UV-daño en el DNA. Dímeros de pirimidina, el principal UVB ADN inducidas por lesión, son causadas por la absorción directa de los rayos UVB fotones en el ADN [10]. Por lo tanto, este tipo de daño no puede ser inhibido por antioxidantes añadido después de la irradiación, lo que indica que a principios UVB y el retraso inducido por los daños del ADN son diferentes. Esta hipótesis se ve apoyada por el hallazgo de que los rayos UVB mutaciones inducidas retrasado, pero no principios de mutaciones, se contabilizan por grandes supresiones [40], que son similares a las mutaciones producidas por el estrés oxidativo [41, 42].

Dímero de pirimidina formación, la oxidación de la guanina y supresiones son posibles orígenes de los principios de mutaciones después de la radiación UVA-[15, 40, 43, 44]. El mecanismo de oxidación de la guanina Probablemente, se trata de oxígeno singlete producidos por los rayos UVA-fotosensibilizadores activados [43]. Dímero de pirimidina formación por la radiación UVA se informó después de dosis muy altas y el mecanismo de inducción de ADN pueden implicar daños a través de photosensitization [45]. La absorción de rayos UVA chromophores no han sido identificados. Por lo tanto, debido al corto tiempo de vida de photosensitized reacciones, las primeras daño en el DNA, probablemente, no puede ser inhibida utilizando antioxidantes añadido hasta 5 minutos después de la irradiación. En un estudio de PCR múltiple se demostró que la mayoría de los dos principios de los rayos UVA y el retraso inducido por hprt mutantes exhiben supresión de genes, ya sea total o supresión de algunos de los exones del gen [40]. Demora en la secuencia de mutaciones podría revelar más información sobre los mecanismos de la radiación UV-inducida por la inestabilidad genómica.

Conclusión

En conclusión, los rayos UVB retrasado hprt mutaciones inducidas se inhibió por los antioxidantes que eliminar el H 2 O 2 y el anión superóxido, lo que sugiere que un aumento persistente de estas especies reactivas del oxígeno o productos están involucrados en un espectador inducida por retraso en la formación de mutaciones. Este espectador efecto puede estar mediado a través de los dos y medio a través de la brecha ocasiones la comunicación intercelular o transmitido de la madre a las células hijas desde el CAT y SOD no fueron efectivas dentro de las células, mientras que GSH probablemente fue eficaz tanto dentro como fuera de las células. El mecanismo de rayos UVA inducida retrasado espectador puede implicar mutaciones inducidas por retraso en la formación de mutaciones brecha ocasiones mediada por la comunicación intercelular o transmitido de la madre a las células hijas. UVA y UVB ambos inducir mutaciones retraso -, pero son fundamentalmente diferentes en la forma en que interactúan con las células. Por lo tanto, el estrés oxidativo puede tener también un papel en la inducción de mutaciones inducidas por el retraso en otros tipos de estrés que la radiación ultravioleta.

Abreviaturas

GSH - glutatión

Hprt - hypoxantine phosphoribosyl transferasa

MCB - monochlorobimane

ROS - especies reactivas del oxígeno

SOD - superóxido dismutasa

UVA - ultravioleta A (320 - 400 nm)

UVB - ultravioleta B (290 - 320 nm)

6TG - 6-thioguanine

Contribuciones de los autores

JD concibe el estudio, llevado a cabo el trabajo experimental, realizó el análisis estadístico y escribió el manuscrito. EK y TS participado en el diseño y la coordinación del estudio y con la escritura del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Agradecemos a Bjørn Høvik y Malí Strand Ellefsen de asistencia técnica, y al profesor Setlow RB (Brookhaven National Laboratory) y profesor Rune Blomhoff (Departamento de Nutrición, Facultad de Medicina de la Universidad de Oslo) de valiosos comentarios. Apoyado por el Consejo de Investigación de Noruega (JD).