Cardiovascular Diabetology, 2005; 4: 12-12 (más artículos en esta revista)

Lesión de células endoteliales por los altos de glucosa y heparanase es impedido por la insulina, la heparina y el factor de crecimiento fibroblástico básico

BioMed Central
Juying Han (juyinghan@yahoo.ca) [1], Anil K Mandal (amandal@med-spec.com) [2], Linda M Hiebert (linda.hiebert @ usask.ca) [1]
[1] Departamento de Veterinaria Ciencias Biomédicas de la Universidad de Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, S7N 5B4, Canadá
[2] Department of Medicine, University of Florida, Jacksonville, Florida, 32086, USA

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Resumen
Antecedentes

Incontrolados hiperglucemia es el principal factor de riesgo en el desarrollo de complicaciones vasculares diabéticos. Las células endoteliales son las primeras células blanco de la hiperglucemia. El mecanismo de lesión endotelial por la glucosa alta aún es poco conocido. Heparanase la producción, inducido por la hiperglucemia, y la ulterior degradación del heparán sulfato pueden contribuir a la lesión endotelial. Poco se sabe acerca de la lesión endotelial por heparanase y de los medios posibles de evitar que esta lesión.

Objetivos

Para determinar si altos de glucosa, así como de células endoteliales heparanase causa perjuicio y si la insulina, la heparina y bFGF proteger las células de este daño.

Métodos

Cultivadas de las células endoteliales de aorta porcina fueron tratados con alta glucosa (30 mM) y / o la insulina (1 U / ml) y / o la heparina (0,5 μ g μ g / ml) y / o de base el factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) (1 ng / ml ) Durante siete días. Las células fueron también tratados con heparinase I (0,3 U / ml, el sustituto heparanase in vitro), además de la insulina, la heparina y bFGF durante dos días en medio libre de suero. Células endoteliales lesión fue evaluada por determinar el número de células vivas por la cultura y la lactato deshidrogenasa (LDH) liberación en medio expresado como porcentaje de control.

Resultados

Una disminución significativa en el número de células en vivo y aumento de la LDH en libertad se encontró en las células endoteliales tratadas con alto heparinase I. glucosa o insulina y / o la heparina y / o bFGF impedido que estos cambios y, por lo tanto protegido por la lesión de las células de glucosa alta o heparinase I. La capacidad protectora de la heparina y bFGF solo o en combinación fue más evidente en las células dañadas con heparinase I de la glucosa alta.

Conclusión

Células endoteliales heridos por los altos de glucosa o heparinase me están protegidos por una combinación de la insulina, la heparina y bFGF, aunque la protección de la heparina y / o bFGF fue variable.

Antecedentes

La diabetes mellitus se caracteriza por la hiperglucemia y las complicaciones vasculares y microangiopatía macroangiopathy [1, 2]. Las características distintivas de la microangiopatía diabética retinopatía y nefropatía se llevan a la ceguera y la insuficiencia renal [3, 4]. Macroangiopathy en la diabetes, incluye la enfermedad arterial coronaria, enfermedad vascular periférica, y la enfermedad cerebrovascular, y el resultado de una aceleración del aumento de la aterosclerosis y la trombosis lo que aumenta el riesgo de infarto de miocardio, derrame cerebral y la isquemia [5, 6]. Se informa de que, en virtud de un mejor control de la glucemia un menor número de pacientes desarrollan ojo y / o renal, complicaciones [7].

Desde la lesión inicial de hiperglucemia se produce en los vasos sanguíneos, las células endoteliales (ECs) son consideradas como el primer objetivo. Proteoglicanos heparán sulfato (HSPGs), un importante componente de la CE, se sintetizan por ECs e integradas en la membrana plasmática y la matriz extracelular (ECM) [8, 9]. En el ECM, HSPGs interactuar con fibronectina, laminina, el colágeno y los factores de crecimiento como el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) y ayudar a mantener la integridad vascular [10, 11]. HSPGs con sus negativas y carboxilato cargado de sulfato de residuos, crear una "barrera cargo", que disminuyen la permeabilidad de los tensioactivos aniónicos proteínas plasmáticas [12]. Así, la degradación de HSPGs podría conducir a un aumento de la permeabilidad vascular, disminución de la integridad vascular, y los cambios en la actividad del factor de crecimiento. El agotamiento de heparán sulfato (HS) y / o anormal de glicosaminoglicanos (GAG) metabolismo parece ser un mecanismo central asociado a la diabetes CE lesión. HSPG o SA se redujo en la membrana basal glomerular (GBM) de los pacientes con nefropatía diabética manifiesta que se correlacionaban con el grado de proteinuria [13, 14]. Una disminución similar en el SA se observaron en la íntima de aorta de los pacientes diabéticos [15]. Cuidado de la Piel membrana basal espesor se redujo significativamente en los pacientes con nefropatía diabética en comparación con aquellos sin nefropatía. Además, HSPG síntesis disminuyó en la aorta, el hígado y el epitelio intestinal de las ratas diabéticas, [16 - 18]. Así, en la condición de diabético, los cambios en el metabolismo de HS puede ocurrir en cualquier tejido que sugiere la relación entre el SA anomalías vasculares y complicaciones en los barcos grandes y pequeños.

Heparanase es un endo-β-D-glucuronidase que es transportada HS interchain en sitios específicos. Bajo condiciones fisiológicas normales, heparanase se expresa en las plaquetas, citrofoblastos, mastocitos, neutrófilos, macrófagos, y de la placenta [19]. Heparanase actividad se encontró en la orina de algunos pacientes diabéticos y heparanase proteína se traduce a la vez en la glomerular mesangial y lisados de células epiteliales, pero no en las células intactas [20]. HSPG degradación por heparanase upregulation CE puede contribuir a la lesión de hiperglucemia. Por lo tanto, para determinar si desea heparanase así como altos de glucosa heridos ECs.

La insulina y la heparina sola, o en combinación, impidió que el intercelular lagunas formadas en ECs cultivadas en alta glucosa [21]. Varios estudios anteriores han demostrado que la insulina aumenta el óxido nítrico (NO) en la producción cultivadas ECs y garantiza la función vascular normal [22, 23]. La heparina puede acumular en ECs en una mayor concentración que en el plasma, el aumento de la CE HS superficie, y evitar que los radicales libres ECs de la lesión [24 - 26]. Por lo tanto, postula que la insulina y / o la heparina ECs proteja de la alta glucosa o heparanase lesión.

BFGF tiene una alta afinidad por la heparina y el SA que se requiere para la interacción con su receptor (bFGFR). Sin embargo, el SA en el ECM también limita bFGF liberación en espacios intersticiales [27, 28]. La gran afinidad de la heparina para bFGF y el SA, junto con el potencial de proliferación CE bFGF [29], puede proteger ECs. Estudios anteriores han demostrado que ambos heparanase y plasmina degrada HSPG y disminución de la estabilidad de la bFGF / SA / bFGFR complejo que produce la pérdida de bFGF, que fue corregida por la heparina exógena [30, 31]. Así, la estabilización de bFGF / SA / bFGFR complejo, mediante el suministro de heparina y bFGF, ECs pueden proteger de las lesiones por los altos de glucosa o heparanase.

Por lo tanto, los efectos de nuestro estudio fue determinar si la glucosa alta o inducida heparanase cultivadas CE lesión, y si la administración de suplementos de insulina, la heparina y bFGF proteja ECs de este daño.

Métodos
Cultura de Porcino Células endoteliales de aorta (PAECs)

PAECs se cultivaron de acuerdo con el método de Gotlieb y Spector [32]. Porcino aórtica segmentos fueron lavadas en tres cambios de calcio y magnesio, el fosfato libre Dulbecco-salina tamponada (CMF-DPBS), mientras que el tejido conectivo y la adventicia final piezas fueron recortados. Un extremo de la aorta estaba anclada con dos hemostáticos (garantizar que no hay fugas de abajo o sucursal puntos) y el lumen se enjuagar tres veces con CMF-DPBS y luego llenos de solución de colagenasa (Tipo IV, SIGMA, St Louis, MO, EE.UU. ; De 1 mg / ml en CMF-DPBS a 37 ° C). Después de 6 minutos, el colagenasa solución fue removido y la superficie endotelial se enjuaga suavemente con M199 (GibcoBRL, Life Technologies, Inc, Grand Island, NY, EE.UU.), que contiene un 5% de suero fetal bovino (SFB, GibcoBRL), 50 μ g μ g / ml Penicilina (SIGMA) y 10 μ g μ g / ml estreptomicina (SIGMA). El medio fue removido y en 60 mm de plata de la cultura platos. El volumen fue de 2 ml de medio / plato. Las células fueron incubadas a 37 ° C con 5% CO 2 / 95% de aire en un ambiente humidificado. ECs fueron identificados por su aspecto morfológico de adoquines similares a las células aplanadas y la presencia de factor von Willebrand (vWF), en los cultivos iniciales. No-como las células endoteliales, tales como las células del músculo liso y los fibroblastos, fueron destruidos por los mecánicos de aspiración antes de que el primer paso.

Para subcultura, confluente 60 mm de platos PAECs se lavaron dos veces con el estéril CMF-DPBS, seguida de la exposición a un estéril 0,025% tripsina solución durante dos o tres minutos a temperatura ambiente. Las células fueron entonces resuspendido en 6 ml de medio de cultivo y semillas en 60 mm tres platos (2 ml / cápsula). Confluentes de las culturas en el paso 4, en 35 mm, platos, fueron utilizados en los experimentos.

Reactivos

Reactivos fueron preparados como soluciones de existencias en CMF-DPBS en las siguientes concentraciones: la glucosa (D-Glucosa, Inc BDH Toronto, Canadá) 3M, unfractionated bovina pulmón heparina (151 U USP / mg Farmacéutica Upjohn, Kalamazoo, MI, EE.UU.) 0,1 mg / ml, insulina (Humulina ® N) 100 U / ml. Disponibilidad de soluciones heparinase I (SIGMA) 10 y 1 U / ml y bFGF (SIGMA) 0,1 ng / μ l μ l se prepararon de M199 sin suero.

Célula de Tratamiento

Cell medio se cambió justo antes de la adición de reactivos a 1 ml de medio por plato. Por alto de glucosa, 10 μ l μ l de 3 M de existencias solución se añadió para dar un último añadido concentración de 30 mM. Para heparina, 5 μ l μ l de 0,1 mg / ml de solución madre se añadió para dar una concentración final de 0,5 μ g μ g / ml. Para insulina, 10 μ l μ l de 100 U / ml solución madre se añadió para dar una concentración final de 1 U / ml. Por bFGF, 10 μ l μ l de 0,1 ng / μ l μ l de solución madre se añadió para dar una concentración final de 1 ng / ml. Cell medio se cambió y se agregaron los reactivos fresca cada dos días durante siete días. Las células se cosecharon 48 horas después de la última adición.

Con el fin de determinar las condiciones de cultivo, así como daños en dosis de heparinase I en PAECs, heparinase Formo parte de las culturas a concentraciones de 0,01, 0,05, 0,1, 0,3 y 0,5 U / ml en el medio, que ha sido producido por la adición de 10 μ l μ l de 1 U / ml y de 5, 10, 30 y 50 μ l μ l, de 10 U / ml de heparinase I de 1 ml de medio respectivamente. Las células fueron cultivadas en el medio, ya sea con suero durante seis o diez días, cuando se cambió de células medianas y fresca heparinase I se añadió en días, o en el medio libre de suero durante dos días, añadiendo que una vez heparinase.

Para determinar el efecto de la heparina, insulina y bFGF en la presencia heparinase I, de células medio se cambió a M199 sin suero. Luego de 30 μ l μ l, de 10 U / ml de heparinase I se añadió para dar una concentración final de 0,3 U / ml. Luego, heparina, insulina o bFGF se añadió al medio, tal como se describe más arriba. Las células fueron cosechadas dos días más tarde.

Evaluación de lesiones de células
Análisis Estadístico

Todos los datos se expresaron como media + / - error estándar (SE) de tres platos / grupo. Un utilizó un modelo lineal se utilizó para determinar diferencias significativas entre los grupos. Los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativas.

Resultados
Efecto de la heparina y la insulina en PAECs Heridos por alto de glucosa

PAECs fueron expuestos a altos de glucosa (30 mM) por sí sola, la insulina (1 U / ml) sola, la heparina (0,5 μ g μ g / ml) y la glucosa por sí sola más heparina más insulina durante siete días. PAECs tratados con glucosa alta mostró una disminución significativa en el número de células en vivo y aumento de la liberación de LDH en comparación con el control de las células. En comparación con las células de control, hubo cambios significativos en el número de células en vivo y LDH liberación de insulina en las células tratadas por sí solo, pero no en las células tratadas con heparina sola. Live celda número fue significativamente mayor en la insulina o la heparina sola versus alto de glucosa tratados culturas. La combinación de heparina y la insulina en presencia de elevados de glucosa aumentaron significativamente el número de células en vivo y disminución de la liberación de LDH en comparación con las células lesionadas por los altos de glucosa sola (Figura 1].

Para determinar si la insulina y / o la heparina PAECs proteger de las lesiones de alto de glucosa, PAECs fueron tratados con alta glucosa (30 mM), la glucosa más insulina (1 U / ml), la glucosa más heparina (0,5 μ g μ g / ml), y además de la glucosa Insulina más heparina durante siete días (Figura 2]. Una tendencia hacia una disminución en el número de células en vivo y un aumento significativo de la LDH liberación se observaron en PAECs tratados con glucosa alta en comparación con el control de las culturas. Un aumento significativo en el número de células en vivo y disminución de la LDH liberación se vio en PAECs tratados con glucosa alta y una combinación de la insulina y la heparina en comparación con el tratamiento solo de glucosa alta, similar a los resultados que se muestran en la Figura 1. Un aumento significativo en el número de células en vivo y disminución de la LDH liberación de insulina se observó cuando se añadió a la alta glucosa en las células heridas. Alto de glucosa más heparina culturas tratados mostraron una tendencia hacia un aumento en el número de células en vivo, y una disminución significativa en la liberación de LDH en comparación con el tratamiento solo alto de glucosa (Figura 2].

Efecto de la insulina y / o heparina en PAECs Heridos por alto de glucosa en la Presencia de bFGF

PAECs fueron tratados con alta glucosa (30 mM), además de la glucosa bFGF (1 ng / ml), además de la glucosa bFGF más insulina (1 U / ml), además de la glucosa bFGF más heparina (0,5 μ g μ g / ml) y la glucosa más bFGF más Insulina más heparina durante siete días. Una disminución significativa en el número de células en vivo y aumento de la LDH liberación se muestra en el alto de glucosa en las células tratadas frente a control. Cuando bFGF estuvo presente en la celda del medio, la combinación de la insulina y la heparina tiene un efecto protector sobre las células de alta glucosa lesionado como lo demuestra un aumento significativo en el número de células en vivo y disminución de la liberación de LDH en células tratadas con glucosa más bFGF más insulina más heparina versus Alto de glucosa sola. Además, un aumento significativo en el número de células en vivo y disminución de la LDH liberación se demostró en las células tratadas con insulina más altos de glucosa más bFGF frente a la glucosa sola. Heparina con bFGF o bFGF añadido a los altos de glucosa en las células tratadas mostraron un incremento significativo en el número de células en vivo versus alto de glucosa en el tratamiento solo. Aunque la liberación de LDH fue menor en los más altos de glucosa en la heparina más bFGF y de glucosa más alto bFGF frente a los altos de glucosa en las células tratadas por sí sola, esta diferencia no alcanzó significación. La combinación de insulina más bFGF, y de la insulina más heparina bFGF plus de protección mayor que se bFGF o bFGF más heparina en altas de glucosa tratados culturas, cuando el número de células vivas se consideraron. La combinación de insulina más heparina bFGF plus de protección mayor que se bFGF más heparina cuando se consideró LDH (Figura 3].

Efectos perjudiciales de Heparinase I sobre PAECs

PAECs fueron expuestas a diferentes dosis de heparinase I (0,01, 0,05, 0,1 y 0,3 U / ml) durante seis o diez días en M199 con 5% de suero. Las células se cosecharon 24 horas después de la última adición de heparinase I. No hubo diferencias significativas en el número de células en vivo y en el control de la liberación de LDH en comparación con los cultivos tratados con diferentes dosis de heparinase I. PAECs expuestos a heparinase I (0,05, 0,1, 0,3 Y 0,5 U / ml) durante 48 horas en el suero libre M199 mostró una disminución significativa en la viabilidad celular y aumento de la liberación de LDH en comparación con el grupo control. Cell lesión fue dependientes de la dosis ya que hubo una disminución significativa en la viabilidad celular, con heparinase I 0,5 U / ml frente a 0,05 U / ml (datos no presentados). Las dosis de 0,3 U / ml en el suero me heparinase medios de comunicación libres condiciones fueron escogidos para los siguientes experimentos.

Efecto de la insulina, la heparina y bFGF en Heparinase I inducida por lesiones PAEC

PAECs fueron tratados con heparinase I (0,3 U / ml) y / o la insulina (1 U / ml) y / o la heparina (0,5 μ g μ g / ml) durante 48 horas en el suero libre M199. El tratamiento con heparinase me mostró una disminución significativa en el número de células en vivo y aumento de la liberación de LDH en comparación con el control de las células. Además de la insulina o la heparina para heparinase me células tratadas mostraron un incremento significativo en el número de células en vivo y disminución de la liberación de LDH en comparación con el tratamiento solo me heparinase. Además, la combinación de insulina y heparina mostraron un incremento significativo en el número de células en vivo frente a todos los demás grupos, la LDH, fueron también los más bajos de este grupo (Figura 4].

Para determinar el efecto protector de la insulina y / o la heparina sobre PAECs heridos por heparinase I bFGF cuando estuvo presente en la celda del medio, PAECs fueron tratados con heparinase I, I heparinase más bFGF (1 ng / ml), además de la insulina I heparinase más bFGF, I heparinase más heparina más bFGF y me heparinase más insulina más heparina bFGF más de 48 horas en el suero libre M199. Heparinase he tratado PAECs mostró una disminución significativa en el número de células en vivo y aumento de la LDH en comparación liberación de control de las células. Las células tratadas con heparinase Iy bFGF mostró una disminución significativa en la LDH en libertad, pero no un aumento en el número de células en vivo en comparación con las células tratadas heparinase yo. Un aumento significativo en el número de células en vivo y disminución de la LDH liberación se vio en las culturas más bFGF tratados con insulina, bFGF más heparina y bFGF más insulina más heparina en presencia de heparinase I versus tratamiento heparinase yo solo. Además, en comparación con bFGF, bFGF más insulina más heparina mostraron un incremento significativo en el número de células en vivo en presencia de heparinase I (Figura 5].

Discusión

Complicaciones vasculares son las principales causas de morbilidad y mortalidad en la diabetes mellitus. ECs desempeñar un papel fundamental en la regulación del tono vascular, así como en el mantenimiento de la integridad vascular, la sangre fluidez y la homeostasis. CE lesión es el primer paso que conduzca a anormalidades estructurales irreversibles, seguido de la oclusión microvascular progresivo en el ojo y el riñón, así como la proliferación de íntima en las grandes buques [33 - 35]. La causa exacta de la lesión CE todavía no está claro.

En este estudio, se utilizaron PAECs como un modelo in vitro para el estudio de enfermedades vasculares humanos asociados con lesiones CE, ya que hay una similitud entre los tejidos humanos y porcina [36]. ECs de micro y macro vasculares origen patológico características similares presentes en complicaciones de la diabetes. Así ECs de aorta porcina (macro buque) lesionado por los altos de glucosa podría imitar CE lesiones asociadas a la hiperglucemia en la diabetes no controlada. Alta glucosa en perjuicio nuestro modelo de acuerdo con las observaciones anteriores de ECs crecido en virtud de las situaciones hiperglucémicas disminución de la proliferación y que muestra el potencial fibrinolítico y el aumento de la muerte celular programada [37, 38]. Previamente se le informó de que la vena umbilical humana normal ECs cuando mostró aumento de la proliferación de cultivos de mediano con alta glucosa (30 mM) durante diez a doce días [39], un período más largo en comparación con los siete días de tratamiento en nuestro estudio. Aumento de la proliferación de las células de manera similar cuando umbilical ECs se obtuvieron de mujeres diabéticas embarazadas [40]. PAECs tratados con glucosa alta durante siete días en el presente estudio pueden representar las formas tempranas de la lesión y demostraron una reducción de vivir número de células que indican disminución de la proliferación celular. Algunos existe variación en la respuesta de la glucosa alta ECs a condiciones. Célula de las condiciones tales como la variación entre los animales, sutiles diferencias en el medio, los niveles de CO 2, humedad, y otros factores no identificados pueden ser responsables de esta variación.

El agotamiento y anormalidades en el SA y HSPG se han encontrado en el riñón, la piel y la aorta íntima de los pacientes diabéticos con nefropatía [13 - 15, 41]. La degradación de HSPG pueden desempeñar un papel en la CE conducen a lesiones vasculares complicaciones diabéticas. Heparanase es transportada HS cadenas en sitios específicos y pueden ser responsables de contribuir a la degradación de HSPG CE lesión. Heparanase se ha encontrado en el riñón y la orina de los pacientes diabéticos [20]. Con el fin de determinar si heparanase así como altos de glucosa daños ECs, PAECs fueron tratados con heparinase I.

Varios heparanases se han purificado y caracterizado de las plaquetas, placenta, y de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo las células del tejido conectivo de activar péptido III (CTAP-III), de Hpa I, II y Hpa células CHO heparanases [42]. Heparinase I, de Flacobacterium heparinum (Cytophagia heparinia), la venta en el comercio heparanase, fue elegido por PAEC tratamiento, y es transportada SA [43]. Heparinase yo no causar lesiones PAECs cuando se cultivaron en M199 con suero durante seis a diez días, pero mostró un efecto dosis cuando cultivadas en medio libre de suero durante dos días. Estos hallazgos sugieren que un suero heparanase inhibe la actividad constituyente. Un reciente descubrimiento de células proteína de superficie, SA / heparina de interacción de proteínas (HIP), se mostró heparanase para impedir el acceso a su sustrato SA por competir con el mismo reconocimiento vinculante como en el sitio de HS cadena [44, 45]. Así, en nuestros experimentos, el suero puede contener HIP heparanase de modo que se activa sólo en el medio libre de suero.

Nuestros resultados muestran lesiones de células con altos niveles de glucosa y heparinase I sugieren que el tratamiento puede inducir a la glucosa alta heparanase upregulation que degrada HS causar daño celular. Esta lesión se produce en presencia de suero que contienen HIP que pueden interactuar con heparanase en la superficie de la célula. Esto sugiere que con la glucosa alta, heparanase puede producirse dentro de la célula. Heparanase actividad es el pH óptimo entre 5,0 y 6,5, con mucho menos actividad por encima de pH 7,0 [46]. La glucosa (30 mM) que se añade durante siete días a ECs reduce el pH del medio (medios de color convertirse en amarillo) y puede estimular aún más la actividad heparanase.

Exógenos heparina reduce significativamente la proteinuria en pacientes diabéticos y de los animales [47, 48]. La heparina promueve antioxidante y propiedades de barrera de los vasos sanguíneos, previene la formación de trombosis oclusiva, protege contra el daño oxidativo o proteolíticas, y disminuye la presión arterial [26, 49, 50]. La heparina y el SA, en la estructura química similar, la posesión común de las características fisiológicas y biológicas importantes en la vasculatura. Heparina modifica la síntesis y la estructura de HSPG [51, 52]. En nuestro estudio, además de la heparina para heparinase he tratado ECs aumentado significativamente el número de células en vivo y disminución de la liberación de LDH en comparación con ECs tratados con heparinase yo sola lo que sugiere que la heparina tiene la capacidad de prevenir las lesiones por heparanase celular. Una disminución significativa en la liberación de LDH y una tendencia hacia un aumento en el número de células en vivo (cerca de los niveles de control) visto en el alto de glucosa en las células tratadas con heparina y en comparación con la glucosa alta solos también indican el potencial de la heparina para proteger a los ECs heridos por la glucosa alta.

SA y la heparina tiene gran afinidad por el bFGF y son parte de la bFGF / bFGFR complejo que afecta el crecimiento, la diferenciación y la migración de muchos tipos de células [53]. Así, bFGF función está protegida por HS síntesis y perturbada por su degradación. Nuestros resultados mostraron un incremento significativo en el número de células en vivo y una tendencia hacia una disminución de la LDH en libertad, tanto en las células tratadas con bFGF más alto de glucosa y la glucosa más alto bFGF más heparina en comparación con la glucosa alta solos indicando algunos efectos protectores de bFGF. Sin embargo, el número de células en vivo en los controles es significativamente mayor que la glucosa más alto bFGF indicando bFGF no eliminar por sí sola dosis alta de glucosa en la lesión. Desde el alto de glucosa produce muchas anormalidades metabólicas y bioquímicas a través de varias vías celulares, bFGF función normal puede ser alterado por su interacción con los metabolitos anormales. Estudios anteriores mostraron que en la hiperglucemia, nonenzymatic glicosilación de bFGF disminuido bFGF actividad [54] y podría explicar aquí nuestras observaciones. Además, hemos observado resultados similares cuando ECs fueron dañadas por heparinase I. El efecto protector de bFGF en heparinase I lesión se muestra por una significativa disminución de la LDH liberación y una tendencia hacia un aumento en el número de células en comparación con heparinase I lesión solo. Esta capacidad de protección de bFGF es coherente con lo visto en el alto de glucosa más bFGF tratados ECs.

La unión de la heparina a bFGF depende de la masa molecular, el grado de sulfate disacárido y la composición. Unfractionated bovina pulmón heparina usada aquí es altamente sulfatados y de alto peso molecular, y ya ha sido demostrado para proteger bFGF tríptico de división. Esta capacidad se redujo en desulfation N-y N-acetilación de las especies bovina pulmón heparina [55]. Estudios anteriores también han sugerido que la heparina primero es necesario que se unen a la superficie de la célula para cumplir con la función de heparán sulfato en bFGF receptor de interacciones [56]. Hemos observado que la heparina bovina pulmón une a la superficie de las células endoteliales cultivadas de la especie porcina y, por lo tanto sería capaz de interactuar con bFGF [57].

Cuando la heparina se añadió a ECs tratados con heparinase Iy bFGF, el aumento de número de células en vivo y en libertad LDH disminuyó significativamente en comparación con el tratamiento solo heparinase y me mostró un aumento más pronunciado en células vivas y disminución de la LDH además de que por sí sola lo que sugiere que bFGF y bFGF Unen a la heparina para prevenir la degradación de HSPG por heparinase I. Estos resultados nos causan a especular que la heparina puede ejercer su efecto protector en dos pasos: en primer lugar, la heparina aumenta la síntesis de la CE SA, en segundo lugar, de nueva síntesis HS exógenos bFGF con heparina y la forma BFGF / HS o heparina / bFGFR complejo que permite bFGF desempeñando su papel fisiológico en el crecimiento celular, la diferenciación, proliferación. Además, en el caso de heparanase lesiones, la heparina en el medio puede competir con el SA para heparanase y, en consecuencia, puede impedir la degradación de HS.

La insulina no sólo estimula a las células utilizar la glucosa, sino que también promueve la síntesis de ADN y el crecimiento celular. Este último efecto se apoya en este estudio cuando ECs, tratados con insulina sola, aumentó significativamente el número de células en vivo en comparación con los controles (Figura 1]. Insulina protección de la alta glucosa o heparinase he tratado ECs se muestra en todas las combinaciones de tratamiento, incluida la insulina por sí sola, más heparina insulina, la insulina y la insulina más bFGF más heparina más bFGF. El mecanismo por el que protege la insulina ECs de la glucosa alta de lesiones no es del todo comprendido. Otros vasoprotective acciones de la insulina son su capacidad para aumentar la producción de NO [58], actuar como antioxidante y prevenir la arteriosclerosis, reduciendo el consumo de oxígeno [59]. Nuestro estudio sugiere que la combinación de insulina, la heparina, y bFGF puede tener efectos aditivos con vivir aumentado significativamente el número de células y la disminución de la LDH en comparación con la glucosa alta o heparinase yo solo. Con altos de glucosa en la lesión combinada de los tres tratamientos fueron más efectivos que los bFGF y bFGF más heparina y sugirió una mayor efectividad en comparación con la insulina más bFGF medio cuando se consideraron los niveles de LDH. Con I heparinase lesión combinada tratamientos fueron significativamente más efectivos que el bFGF con una tendencia hacia un aumento de la eficacia con la heparina o la insulina más bFGF vivir cuando se consideró el número de células.

Conclusión

Este estudio demuestra que los dos altos de glucosa y heparinase me causa perjuicio y CE sugiere una relación entre la hiperglucemia y la inducción en heparanase complicaciones de la diabetes. Exógenos heparinase I daños ECs sólo en condiciones libres de suero. El mecanismo de lesión por CE alto de glucosa es un proceso complicado en el que una variedad de anormalidades metabólicas ocurren, y la inducción de heparanase puede ser uno de ellos. El efecto protector de la heparina y bFGF solo o en combinación fue más evidente en heparinase I versus alto de glucosa en la lesión que indica el escaso daño inducido por heparinase I y de la complejidad de la glucosa inducida por la lesión de células. Cell lesiones por heparinase me confirma aún más que la degradación de HSPG en la superficie o la CE ECM contribuye a la vasculopatía diabética coherentes con observaciones anteriores, tanto in vivo e in vitro. Nuestros resultados son los primeros que demuestran los efectos protectores de la heparina y / o la insulina y / o las células de bFGF heridos por los altos de glucosa o heparinase I. interesante, encontramos que los efectos protectores de bFGF en presencia de heparina o de insulina en las células de mediano Fueron más evidentes cuando las células fueron tratadas con heparinase I en comparación con la glucosa alta. Independientemente de la interacción entre la heparina, insulina y bFGF, este estudio demostró que estos tres compuestos en combinación proteger las células de la glucosa alta o heparanase lesión. Estas conclusiones servirán de base para otros estudios en la comprensión y el tratamiento de las complicaciones vasculares diabéticos.

Lista de abreviaturas

BFGF básicos-el factor de crecimiento fibroblástico

BFGFR básicos-receptor del factor de crecimiento fibroblástico

Cho de ovario de hámster chino

CMF-DPBS-calcio y magnesio, libre Dulbecco del buffer fosfato salino -

CTAP-III-péptido de la activación del tejido conectivo III

ECM-matriz extracelular

CE (s) de las células endoteliales (s)

GAG-glucosaminoglicano

GBM-membrana basal glomerular

HIP-HS/heparin-interacting proteinHS-heparán sulfato

HSPG (s)-Heparan sulfato proteoglicanos (s)

LDH-lactato deshidrogenasa

NO-óxido nítrico

PAEC (s) de Porcino de células endoteliales de aorta (s)

SE-error estándar

VWF-Factor von Willebrand

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

JH participó en el diseño del estudio llevado a cabo los experimentos y redactó el manuscrito. AM concibe el estudio y participó en el diseño. LH concibe el estudio, participaron en el diseño y la coordinación y contribuido a la redacción del manuscrito.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por una beca de la Asociación Canadiense de Diabetes en honor a Mildred I. Wright y de fuentes privadas. Estamos en deuda con Ping y Tilly Dr Adrienne Woytowich de asistencia técnica.