Cancer Cell International, 2005; 5: 28-28 (más artículos en esta revista)

Las respuestas de los genes implicados en el control del ciclo celular a diversos productos químicos en el ADN perjudiciales humanos A549 células de adenocarcinoma de pulmón

BioMed Central
Huijun Zhu (h.zhu @ ic.ac.uk) [1], Catherine Smith (Catherine.Smith @ AstraZeneca.com) [1], Charles Ansah (c.ansah @ imperial.ac.uk) [1], Nigel J Gooderham (n.gooderham @ imperial.ac.uk) [1]
[1] Toxicología Molecular (Química Biológica), de la División de Ciencias Biomédicas, Facultad de Ciencias de la Vida, el Imperial College de Londres, Sir Alexander Fleming Edificio Londres, SW7 2AZ, UK

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Resumen
Antecedentes

Muchos agentes contra el cáncer y dañar el ADN son carcinógenos químicos y la exposición a productos químicos, tales resultados en la desregulación de la progresión del ciclo celular. Los mecanismos moleculares de ADN de los daños provocados por la alteración del ciclo celular no se conocen bien. Hemos estudiado los efectos de etopósido (agente contra el cáncer), cryptolepine (CLP, un alcaloide citotóxicos), el benzo [a] pireno (BaP, un cancerígenos hidrocarburos aromáticos policíclicos) y 2-amino-1-metil-6-phenylimidazo [4 ,5-B] piridina (PhIP, un cocido de carne procedente cancerígeno) en la expresión de genes reguladores del ciclo celular para comprender los mecanismos moleculares de la alteración del ciclo celular.

Resultados

A549 células fueron tratadas con DMSO o sustancias químicas durante un máximo de 72 h, y periódicamente la muestra para el análisis del ciclo celular, la expresión de la proteína y ARNm. DMSO células tratadas mostraron un pico dominante en G1 del ciclo celular en todo momento examinados. Etopósido y CLP tanto inducida G2 / M fase de la detención aún la ex alterada la expresión de genes en varias fases de funcionamiento, mientras que esta última es más eficaz en la inhibición de la expresión de genes en la transición G2-M. Ambos CLP inducida por etopósido y una acumulación de la proteína p53 y p53 transcripcional upregulation de genes diana. Ni BaP ni PhIP tenido específica de fases del ciclo celular efecto, sin embargo, que los cambios inducidos distintivo en la expresión génica. BaP upregulated la expresión de la CYP1B1 en 6-24 h y downregulated muchos genes reguladores del ciclo celular en 48-72 h. Por el contrario, PhIP aumento de la expresión de muchos genes reguladores del ciclo celular. Los cambios en la expresión de mRNAs clave fueron confirmadas en el nivel de proteínas.

Conclusión

Nuestros experimentos demuestran que el ADN perjudiciales agentes con diferentes mecanismos de acción inducida por los cambios en el distintivo patrón de expresión de un grupo de genes reguladores del ciclo celular. Sugerimos que el examen de la genómica respuesta a la exposición química proporciona una oportunidad excepcional para comprender los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta celular a sustancias tóxicas.

Antecedentes

Muchos de los productos químicos carcinógenos y agentes terapéuticos interactuar con las células, lo que temporal o permanente crecimiento de las células arresto, la modificación genética o de la muerte de la célula. El efecto final de una sustancia química en las células está determinado en gran medida por la capacidad de la química para obtener respuesta genómica. El reciente lanzamiento de los Institutos Nacionales de Salud NCI Química Genómica Iniciativa [1] anuncia una nueva era de la química de la investigación sobre el genoma. En el presente estudio, hemos utilizado la genómica y la química de expresión fenotípica de comprender los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta celular a la exposición química.

Hemos examinado cuatro productos químicos. Etopósido, un inhibidor de la topoisomerasa II, induce ADN de doble filamento se rompe mediante la promoción de la formación de cleavable DNA-proteína y provoca la detención del ciclo celular en fase S o G2 / M depende de la fase de tipo de células [2, 3]. Cryptolepine (CLP), un alcaloide extraído de la escalada arbusto de África occidental Cryptolepis sanguinolenta, interfiere con la topoisomerasa II e inhibe la síntesis de ADN y es citotóxico para potentemente las células tumorales [4 - 6]. Benzo (a) pireno (BaP), uno de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), derivados de la combustión incompleta de materia orgánica, es un arquetipo procarcinogen. Los estudios epidemiológicos indican una relación positiva entre la exposición al BaP y la aparición de cánceres humanos [7 - 9]. BaP ejerce su genotoxicidad por medio del citocromo P450 metabolismo mediado, es decir, CYP1A1 y CYP1B1, para formar electrófilos que se unen covalentemente al ADN [10, 11]. La expresión de CYP1A1 y CYP1B1 pueden ser inducidas por la activación de los receptores de aril hidrocarburo (AhR), que es un ligando-activado factor de transcripción [12]. Tras la unión a sus ligandos, como las dioxinas y los HAP, AhR translocates a la que nucleuswhere complejos con ARNT para estimular la transcripción de genes a través de transactivation a través de dominios conocidos como potenciador AHR-, dioxinas, o xenobióticos respuesta de los elementos [13, 14] . El citocromo P450 Cyp1 familia, incluida la CYP1B1 y CYP1A1, así como varios de desintoxicación de fase II se encuentran entre los genes regulados por AhR [15, 16]. Los estudios también demuestran que AHR participa en la modulación de la transcripción del programa, al menos en parte, al asociarse con otros factores de transcripción [17, 18]. Esas asociaciones pueden ser responsables de los efectos del ligando-AHR activado en la regulación de la proliferación [19]. 2-Amino-1-metil-6-phenylimidazo [4,5-b] piridina (PhIP), una dieta de derivados de aminas heterocíclicas formado durante la cocción de la carne [20], es un carcinógeno y roedores sospechosos carcinógeno humano. Se sabe que PhIP y otras aminas heterocíclicas se metabolizan principalmente por la CYP1A2, sino también CYP1A1 y CYP1B1 para formar electrófilos que se unen al ADN para formar aductos de ADN [21 - 23].

En el presente estudio hemos utilizado A549 humanos adenocarcinoma de pulmón de células para examinar los celulares y las respuestas a la genómica de ADN elegido los productos químicos reactivos. El epiteliales alveolares tipo II de células derivadas de células A549 han sido ampliamente utilizadas para poner a prueba la citotoxicidad de los agentes terapéuticos y tóxicos del medio ambiente [24]. Estas células expresan receptores de aril hidrocarburo (AhR) [25], proporcionando un modelo útil para el estudio de la regulación génica mediada AhR. El análisis del ciclo celular combinado con cDNA Microarray ensayo nos permitió distinguir los mecanismos moleculares de la alteración del ciclo celular inducida por los diferentes productos químicos y predecir con mayor precisión el destino de las células después de la exposición a sustancias químicas.

Resultados
Efectos de los tratamientos sobre el ciclo celular

Crecimiento de las células estado fue examinado por citometría de flujo y microscopía. Las células tratadas con DMSO, BaP y PhIP, pero no etopósido y CLP, llegó a la confluencia después de las 24 h, tal como se examinó a través del microscopio óptico (datos no presentados). La figura 1 muestra que en todas las muestras tratadas DMSO, un número predominante de las células distribuidas en la fase G1 del ciclo celular. En comparación, el tratamiento con etopósido inducida por un tiempo dependientes disminución en el número de células en fase G1 y una acumulación de células en G2 / M de la fase del ciclo celular. Las células tratadas con CLP gala de un ciclo celular con elevado perfil G2 / M fase pico después de 24 h. En comparación, el BaP y PhIP no tenía persistentes efectos específicos del ciclo celular. A las 72 h, la muestra tratados con etopósido mostraron una cerca de 2-3 veces más en la fase subG1 células, en comparación con las muestras tratadas de manera diferente. En consonancia con la aparición de células subG1, también observaron más células flotando en el etopósido muestra tratados en comparación con los otros tratamientos, a las 72 h, lo que sugiere que etopósido inducida cytoxicity en esta última timepoint.

Los cambios en la expresión de P53 y su objetivo genes en respuesta a los tratamientos químicos

P53 está bien establecida como una de las principales de respuesta al estrés celular y genética [26]. Muchos de los genes p53 transcripcional objetivo participan en el control del ciclo celular. Hemos examinado los niveles de la proteína p53, junto con algunos de sus genes diana transcripcional en respuesta a los diferentes tratamientos químicos (cuadro 1, grupo 1). La Figura 2 muestra un bajo nivel de la proteína p53 en las células tratadas DMSO. La expresión WAF1 y de los niveles de TGF-β mRNA, la proteína de los productos que participan en el G1 / S del ciclo celular transición puesto de control [27, 28], el aumento con el tiempo en células tratadas DMSO (Fig. 3A]. Este patrón de cambio en la expresión de WAF1 y TGF-β indica que la prolongación de la cultura causado la detención del ciclo celular en fase G1, que fue apoyada por la observación de que el número de células en fase G1 se incrementó después de las 24 h en comparación con el que a las 6 horas (Fig, 1]. En efecto, después de 24 h, las células tratadas con DMSO formado un uniforme monocapas. La exposición a etopósido y CLP inducida por una acumulación de p53 a las 6 horas y las 24 h (Fig. 2]. En consonancia con esto, WAF1, TGF-β, BAX, MDM2 todos mostraron una respuesta positiva a los dos agentes dentro de las 24 horas a nivel del mRNA (Fig. 3A, 3B]. Aunque la capacidad de etopósido para inducir la acumulación de p53 fue disminuido en gran medida después de 48 h (Fig. 2], la exposición a la sustancia química es todavía eficaz en la regulación de hasta WAF1 y MDM2 (Fig. 3A, 3B] Western Blot confirmó también que el análisis Exposición a etopósido y CLP upregulated la expresión de las proteínas WAF1, MDM2 BAX y de los miembros de la familia tan pronto como 6 horas (Fig. 2]. La exposición a BaP y PhIP, por otra parte, el aumento de la expresión de BAX a las 24 h (Figs. 2, 3A], pero tuvo poco efectos en cualquiera de los otros objetivos gen p53 durante las 72 h de tratamiento en comparación con el control DMSO (Figs. 2, 3A, 3B], en consonancia con la incapacidad de estos dos productos químicos para inducir la acumulación de la proteína p53 (Fig. 2]. Estos resultados sugieren que la exposición a la vez y etopósido CLP p53 inducida por la activación, mientras que etopósido, PhIP BaP y también puede activar p53-independiente de las vías para regular la expresión de la denominada p53 genes diana en las células A549.

Efectos sobre los genes implicados en G1 / S transición

Aparte de los genes p53 objetivo WAF1 y TGF-β, hemos examinado también la expresión de otros genes implicados en la fase G1-S transición (genes en el grupo 2 en el cuadro 1]. Estos genes no mostraron apreciable respuesta a los tratamientos (datos no presentados), con la excepción de CYCLIN D1, que parece estar upregulated por la exposición a etopósido, CLP y BaP (Fig. 3C]. Los efectos de todos los tratamientos químicos en la expresión de G1 / S transición genes parece ser insuficiente para provocar la detención del ciclo celular en fase G1.

Efectos sobre los genes implicados en G2 / M transición

En DMSO tratados células, la expresión de genes implicados en G2 / M fase de transición (Cuadro 1, grupo 3) fue más baja en 72 h (Fig. 4A], lo que indica un bajo potencial de crecimiento de estas células en esta fase. Etopósido persistentemente inhibe la expresión de todos estos genes. Los efectos sobre CYCLIN A (CCNA2) y CYCLIN B1 (CCNB1) se observó a las 6 h. CLP inhibe la expresión de muchos de estos genes dentro de las 24 h, y todos ellos por 72 h. Curiosamente, la exposición a BaP también inhibe la expresión de la mayoría de estos genes, aunque los efectos no se observaron antes de 48 h. La exposición a PhIP, por otra parte, upregulated algunos de estos genes en el timepoints más tarde, aunque los efectos no son sustanciales. Estos resultados sugieren que etopósido es el agente más eficaz en la inhibición de la progresión del ciclo celular a través de G2 / M fase de transición. El efecto marginal suscitó PhIP indicado por un pequeño estímulo de crecimiento que compiten contra la confluencia relacionados con la inhibición del crecimiento.

Efectos sobre los genes involucrados en la mitosis

La expresión de los genes involucrados en la mitosis (Tabla 1, grupo 4) en las células tratadas con DMSO fue más bajo a las 72 h, lo que sugiere que la tasa de división celular es más bajo en este momento el punto (Fig. 4B]. La exposición a etopósido reprime la expresión de todos estos genes dentro de las 6 h de tratamiento. En comparación, el CLP no mostró tal inhibición hasta 24 h de tratamiento, a pesar de la inhibición fue evidente a las 72 h. La exposición a BaP, una vez más, no tuvo efectos sobre la expresión de estos genes antes de las 24 h, pero inhibe la expresión de todos estos genes después de 48 h de tratamiento. En completo contraste, las células tratadas con PhIP expresaron niveles más altos de estos genes relacionados con la mitosis en el punto 72 h tiempo. Esto sugiere que PhIP bien tenía la posibilidad de retrasar la inhibición del crecimiento iniciado por confluencia o ejercido una leve efecto estimulador del crecimiento.

Efectos sobre los genes implicados en la replicación del ADN inicio

En las células tratadas con DMSO, la expresión de genes implicados en la replicación del ADN inicio (Tabla 1, Grupo 5) es más alta a las 6 horas (Fig. 5A]. Aunque la expresión de la mayoría de estos genes han disminuido dramáticamente a las 24 horas, no había tiempo que dependen de disminuir aún más después. Este patrón de cambio sugiere que el proceso de iniciación de la síntesis de ADN se activa aún cuando el crecimiento de las células ha llegado a la confluencia. La exposición a etopósido, CLP y todos BaP causado efectos inhibidores sobre la expresión de muchos de estos genes, aunque los efectos de BaP se manifiesta sólo después de 48 h. Una vez más, en contraste con los otros tratamientos, PhIP parecía upregulate la expresión de muchos genes en este grupo en los 48 hy 72 h puntos temporales. Estos resultados sugieren que las células fueron tratadas con PhIP más activo en la iniciación de la síntesis de ADN de las células tratadas con DMSO y con los otros tres agentes, una vez más el apoyo a un crecimiento efecto estimulante.

Western Blot se utilizó también para examinar el nivel de expresión de un número de productos genéticos (Fig. 2]. De acuerdo con los datos observados en el nivel de ARNm, los niveles de la proteína ciclina ciclina A y B fueron mucho menores a las 72 h que en cualquier otro tiempo en el punto DMSO células tratadas (Fig. 2]. La exposición a etopósido y CLP disminución de los niveles de ciclina ciclina A y B, de conformidad con sus efectos sobre los niveles de mRNA de estas proteínas. La exposición a BaP, que redujo los niveles de mRNA de la ciclina ciclina A y B, en los puntos finales de tiempo, también redujo los niveles de estas proteínas. Por último, y nuevamente en contraste con los otros tratamientos, a las 72 h de tratamiento PhIP indujo la expresión de la ciclina A, B y ciclina MCM7 proteínas (Fig. 2], en consonancia con un crecimiento efecto estimulatorio. Estos resultados muestran claramente que los cambios en el nivel de ARNm producido cambios en el nivel de proteínas. El aspecto temporal de la expresión de mRNA alterado a la expresión alterada de la proteína depende de la estabilidad de los respectivos mensaje y proteínas.

Efecto sobre CYP1B1

El nivel de expresión CYP1B1 en DMSO células tratadas fue relativamente baja a las 6 horas y 24 h, pero era alrededor de 10 veces más altos que después de 48 h (Fig. 5B]. Comparado con DMSO, inducida por la exposición a BaP un tiempo-dependiente upregulation de CYP1B1 del 6 h a 24 h (Fig. 5B]. La inducción de la CYP1B1 proteína en las células tratadas con A549 BaP durante 24 h fue confirmado por Western blot (Fig. 5C]. La capacidad de BaP para aumentar la expresión de la CYP1B1 es coherente con la percepción general de que este producto químico puede obligar a la AhR, que es el factor transcripcional de la CYP1B1. Hemos confirmado la presencia de la proteína AhR en esta línea celular a pesar de que su expresión no parece que se han visto afectados por la droga tratamientos (datos no presentados). También se examinaron la expresión de otros genes CYP (grupo 6 en el cuadro 1] y no encontró apreciable respuesta a los tratamientos en cualquiera de los puntos de tiempo (datos no presentados).

Discusión

Para adentrarse en los mecanismos a través de los productos químicos que interfieren con la progresión del ciclo celular, que supervisó los cambios del ciclo celular mediante citometría de flujo combinado con el análisis de cDNA microarray de ensayo que utilicen células de los mismos experimentos. Las células tratadas con DMSO durante 6 h mostró bien definido G1 y G2 / M fase de los picos y una buena proporción de células distribuidas en la fase S, indicativo de la condición de proliferación. El G2 / M fase pico fue menor a las 24 horas y no fácilmente discernible a las 48 hy 72 h, lo que indica que el crecimiento de las células ha llegado a la fase estacionaria en esta etapa tardía de la cultura. Un aumento de cytoxicity se detectó en las células tratadas con etopósido durante 72 h. Hemos examinado la naturaleza de la citotoxicidad inducida por etopósido y no encontró la degradación de la PARP y la caspasa-3, bien documentado características de la muerte de las células apoptóticas (datos no presentados).

Aunque la exposición a etopósido parece inducir la detención del ciclo celular en G2 predominantemente / M fase, el análisis de la expresión génica global sugiere que en la dosis utilizada (10 μ M), la química tiene la capacidad de inhibir la progresión del ciclo celular en varias etapas. Es llevado en una acumulación de la proteína p53, que lleva a la sobre regulación transcripcional de genes de sus objetivos. Incluido en estos genes y las metas se Waf1 TGF-β, ambos productos son las proteínas que participan en los puestos de control G1 con WAF1 también están involucrados en G2 / M puesto de control. Además, etopósido inhibe la expresión de muchos otros genes que funcionan en la ejecución de la progresión del ciclo celular a través de la fase S, G2 / M transición y mitosis.

Aunque la exposición al CLP ciclo celular inducido un perfil similar a la inducida por etopósido a las 24 h, se produjo un preferenciales inhibición de la expresión de genes implicados en G2 / M transición. Esto contrasta con etopósido, que fue más eficaz en la inhibición de la expresión de genes que controlan ambas G2 / M fase y mitosis.

BaP y PhIP células tratadas no mostraron evidentes fase efecto específico sobre la progresión del ciclo celular en el período de estudio (72 h). La falta de efecto de los hidrocarburos aromáticos policíclicos cancerígenos en ciclo celular en las células, incluidas las células A549 ha sido reportada por otros, y se describe como stealth carcinogénesis [29]. La exposición a BaP y PhIP tenido poco, en su caso, el efecto sobre la expresión de genes reguladores del ciclo celular en las 6 h y 24 h de tiempo de puntos. Sin embargo, después de un tratamiento prolongado (48 - 72 h), BaP y PhIP inducida alteraciones en la expresión de muchos genes reguladores del ciclo celular. Los efectos que ejercen BaP y PhIP sobre la expresión de genes no se asociaron con cambios dramáticos en el perfil del ciclo celular, lo que puede ser debido a un retraso en la capacidad de los productos químicos para influir en la transcripción en la que las células han alcanzado confluencia.

La acumulación de la proteína p53 se produce a menudo como un indicador de daño en el DNA [30, 31]. Los productos de los genes p53 transcripcional meta se sabe que desempeñan un papel importante en múltiples procesos biológicos celulares, incluyendo el control del ciclo celular puesto de control [32, 33], la síntesis de ADN [34], la reparación de los daños del ADN [26] y de la apoptosis [35]. P53 regula selectivamente la expresión de sus objetivos en respuesta a determinados tratamientos [36]. Además, se ha encontrado que algunos genes p53 objetivo también están regulados en un p53 de forma independiente [37, 38]. Nuestros experimentos en células A549 y puso de manifiesto que etopósido CLP fueron casi igual de efectivo para inducir la acumulación de la proteína p53 en las 6 h de tratamiento, mientras que BaP PhIP y no lo hicieron hasta 72 h. Hemos seleccionado una serie de genes p53 objetivo de determinar si la dinámica de su expresión se vio alterada por los diversos tratamientos químicos aplicados. Se observó que tanto CLP y etopósido mostraron patrones similares de efectos en la expresión de algunos genes p53 objetivo, incluidos Waf1, MDM2 y TGF-β y Bax, aunque los efectos se etopósido más destacado. La capacidad de etopósido y CLP afectar a la expresión de los genes p53 objetivo no se refleja en cambios en la expresión de proteínas de estos productos. Esto se ejemplifica en la observación de que CLP fue más eficaz que el etopósido en upregulating la expresión de la proteína MDM2 a pesar de ser menos eficaz en upregulating la expresión de mRNA en MDM2. Estos resultados sugieren que debe haber diferencias en la regulación post-transcripcional de la expresión de la proteína MDM2 en respuesta a los tratamientos de etopósido y CLP.

MDM2 actúa como un E3 ubiquitin ligase que medie autoubiquitination y ubiquitination de otras proteínas p53 incluidos [39]. El equilibrio entre auto-y sustrato-ubiquitination de MDM2 fisiológicamente es modulada por modificaciones postraduccionales, incluyendo sumoylation y fosforilación. Si SUMO conjuga a la MDM2, E3 ligase su actividad se desplaza hacia p53, mientras que la libre ubiquitination se reduzca al mínimo [40]. El supresor tumoral P19 ARF asocia con MDM2 para inhibir la ubiquitination, la exportación y la posterior degradación de p53 [41, 42]. Dado que MDM2 sumoylation también es estimulado significativamente por Foro Regional de la ASEAN [43], y SUMO ubiquitin modificaciones parecen ser mutuamente antagónicos. El cambio en la condición de la modificación es el estrés de responder, porque la irradiación UV conduce a la pérdida de MDM2 sumoylation [44]. Continuación de los estudios serán necesarios para investigar si CLP y etopósido inducir diferentes modificación de MDM2.

Más interesante, se observó que la proteína p53 se ha reducido mucho en las células tratadas con etopósido durante 48 hy 72 h, en comparación con los tratados con PCL a la vez puntos. Esto sugiere que etopósido y CLP influir en la expresión de p53 por diferentes mecanismos. El hecho de que etopósido sigue siendo eficaz en la modificación de la expresión de los llamados genes diana de p53 en ausencia de la proteína p53 acumulación sugiere que la exposición a etopósido también puede dar lugar a la regulación de los genes p53-a través de mecanismos independientes. BaP y PhIP, ninguno de los cuales efectúa la proteína p53, selectivamente aumento de la expresión de Bax y de su producto proteico a las 24 h, pero tuvo poco efecto sobre otros genes p53 regulado. Una vez más, parece que la exposición a BaP PhIP y puede dar lugar a la regulación de la expresión de BAX a través de un mecanismo independiente de p53. El p53-independiente de la regulación de BAX se ha informado anteriormente [38].

Entre los muchos APP, CYP1A1 y CYP1B1 son las principales enzimas involucradas en el metabolismo de los PAHs procarcinogen a su ADN especies reactivas [45, 46]. Se ha demostrado que las células A549 expresan AhR y ambos CYP1A1 y CYP1B1 [25], y son capaces de activar BaP para formar aductos de ADN [[47] y nuestros datos no publicados]. En el presente estudio se encontró que las células A549 tratados con DMSO expresar constitutivamente más CYP1B1 mRNA que CYP1A1 ARNm (datos no presentados) La expresión de la CYP1B1 aumentado notablemente tras el tratamiento con DMSO durante 48 hy 72 h en comparación con aquellos tratados durante un periodo de tiempo aún DMSO No está pensado para inducir esta enzima. Se ha informado de que la senescencia es un CYP1B1 relacionados con el gen en las células humanas y de ratón en células [48, 49], por lo tanto, el aumento de los fines de la expresión de la CYP1B1 en células tratadas DMSO puede estar relacionado con la confluencia mediada por la inhibición del crecimiento celular. BaP drásticamente el aumento de la expresión de mRNA CYP1B1 en las primeras veces con poco efecto sobre CYP1A1 ARNm (datos no presentados), lo que sugiere que las células A549 en CYP1B1 puede ser la enzima clave en el metabolismo de BaP. La pronta upregulation de CYP1B1 en respuesta a la exposición a BaP fue seguido por downregulation de muchos genes reguladores del ciclo celular, el apoyo a la propuesta de que CYP1B1 proteína puede tener un papel importante en la regulación del ciclo celular. Alternativamente, la downregulation de genes clave para la progresión del ciclo celular inducida por BaP pueden producirse a través de la interacción de AhR con otros factores de transcripción.

Por 72 h, la expresión de los principales genes reguladores del ciclo celular en las células tratadas DMSO fue más bajo (medido en el nivel de ARNm y proteínas), indicando la situación de inhibición del crecimiento. Sin embargo muchos genes, en particular los que participan en la regulación del ciclo celular en mitosis y en la fase de iniciación de la síntesis de ADN, se expresaron PhIP mayor en las células tratadas en esta última hora, lo que implica que las células tratadas con PhIP conservar el potencial de proliferar en la confluencia fase. En la actualidad no está claro si los efectos del PhIP sobre la progresión del ciclo celular se debe a la reactividad de ADN o de un mecanismo epigenético. Sin embargo, nuestros resultados son coincidentes con el informe en que se activa el PhIP MAP quinasa vías en las células MCF-10A [50] y las células MCF7 [51]. La capacidad de PhIP para mejorar las señales de crecimiento celular bajo condiciones de cultivo limitación puede ser importante a sus propiedades cancerígenas.

Conclusión

Estudiar expresión mRNA en concierto con la dinámica celular proporciona una forma eficaz de la comprensión de los mecanismos moleculares de acción de los productos químicos que la interferencia con la progresión del ciclo celular. Hemos demostrado que la exposición a los productos químicos de ADN intercalante etopósido y CLP puede inducir rápidamente las perturbaciones del ciclo celular mediante la inhibición de la expresión de múltiples genes reguladores del ciclo celular, mientras que los químicos carcinógenos BaP y PhIP son insidiosos y pronunciado cambio celular requiere más tratamiento prolongado. Llegamos a la conclusión de que el presente trabajo se ha identificado un grupo de genes que son sensibles a las sustancias químicas elegido y proporciona los datos de apoyo a la propuesta de que la genómica con la manipulación de productos químicos influirá celular resultado y que la naturaleza y los aspectos temporales de la respuesta genómica es predictivo de pronóstico.

Materiales y métodos

Todos los reactivos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Poole, Reino Unido) a menos que se indique otra cosa.

Cultivo de células y tratamientos

El adenocarcinoma de pulmón humanos línea celular A549 (European Collection of Cell Cultures, Wiltshire, UK) se cultivaron en Ham's F12 suplementado con l-glutamina (2 mM), el 10% de suero fetal bovino y 10 μ g / ml de gentamicina (todos de Invitrogen, Paisley, Reino Unido) humidificado en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. Cuando el 70% se llegó a la confluencia, las células fueron tratadas con DMSO (<0,1% v / v), etopósido (10 μ M), el benzo (a) pireno (25 μ M), cryptolepine (2,5 μ M) (regalo de la Dra Addae-Kyeremeh , De la Universidad de Ciencia y Tecnología, Kumasi, Ghana) y PhIP (50 μ M) (comprado de Investigación de Sustancias y Preparados Químicos de Toronto, Canadá), para un máximo de 72 h. Todas las células fueron recolectadas utilizando tripsina 0,1% en solución EDTA.

Citometría de flujo

ADN celular fue determinada por el contenido de yoduro de propidio tinción de citometría de flujo, tal como se describe anteriormente [52].

Western Blot

Cell lisados (10 μ g de proteína) fueron resueltas por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida, en electroblotted nitrocelulosa (0,45 μ m), y bloqueada por incubación en el 5% de leche sin grasa en buffer fosfato salino durante 1 h a temperatura ambiente. La nitrocelulosa se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C, seguido de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano durante 1 h a temperatura ambiente. La detección se logró utilizando kit ECL (Amersham Life Science, UK). Los anticuerpos contra la p53 (sc-6243), Bax (sc-493), ciclina A (sc-751), ciclina B (sc-752) y MCM7 (sc-9966) fueron adquiridos de Santa cruz, (California, EE.UU.) . Anticuerpos contra p21/waf1 (CP74) se adquirió de Neomarkers (Fremont, EE.UU.). Anticuerpos contra MDM2 (OP114) se adquirió de CN Biosciences (Nottingham, Reino Unido).

DNA microarray de ensayo

Total de ARN se prepararon con el RNeasy Mini Kit (Qiagen), de acuerdo a la fabricación de la instrucción. Diez μ g de RNA total se transcribe a invertir usando cDNA-T7 (dT) 24 primer y Super Script doble varados cDNA de síntesis Kit (Invitrogen). Biotina-etiquetados cRNA de cDNA fue sintetizado utilizando ENZO bioArray Alto Rendimiento RNA Transcripción de etiquetado Kit (Enzo Diognostics). El cRNA muestras se hibridó a humanos GeneChip arrays que contienen aproximadamente 12000 genes humanos (Human Genome U95A, Affymetrix). Todos los análisis fueron realizados en la instalación de centrales Affymetrix (Microarray Centro, Hammersmith Hospital, Imperial College, Londres), de conformidad con el protocolo MAIME [53]. La intensidad media de todos los genes en cada chip se ajustó a 1500 para permitir la comparación y el análisis subsiguiente [54].

Gene agrupación

Todos los genes se clasifican de acuerdo con la MAPP archivos de la base de datos de GenMAPP http://www.genmapp.org/ [55]. Debido a una falla en el procesamiento de la muestra, los datos a las 48 h no estaba disponible para el agente CLP.

Real-Time RT-PCR cuantitativa

Total RNA de muestras utilizado para la preparación GeneChip hibridación también se utilizaron como plantillas para tiempo real RT-PCR cuantitativa para confirmar los datos de los microarrays de expresión. Transcripción reversa se realizó a través SuperScriptII (Invitrogen). Para cada muestra de ARN, tres ADNc y un control negativo (no la transcriptasa) fueron sintetizados mediante el uso de 2 μ g ARN de la muestra y el 0,2 μ g / μ l azar hexamer ejemplo, en el volumen total de 20 μ l. RT-PCR se realizó con Applied Biosystems 7900 secuenciador. Primers y sondas fueron adquiridos de Applied Biosystems y diseñados dentro de un exón para cada gen utilizando el programa Primer Express, la versión 1.5 (secuencias están disponibles bajo petición). Cada reacción contenía 200 nM adelante y atrás primers, 200 nM sonda, 5 μ l cDNA plantilla, el 12,5 μ l Taqman mezcla de 2 × (Applied Biosystems) y ddH 2 O qf a 25 μ l. El ciclismo parámetros fueron una primera de 50 ° C durante 2 minutos y 95 ° C 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. Hemos utilizado los cebos y una sonda corresponde a la ama de llaves de genes rRNA s 18 a la que normalizó la expresión de genes de interés. Los datos fueron recuperados de SDS2.0 software (Applied Biosystems) y analizados utilizando el sistema SAS para Windows: Release 8,01 TS nivel 01M0.

Validación de los datos de los microarrays de ADN

Se empleó el PCR en tiempo real para cuantificar 9 de ADN de genes de reparación de los objetivos (Cuadro 2], y utiliza los datos para validar el ensayo de microarrays de ADN. Los resultados de los dos ensayos se compararon y los coeficientes de correlación se presentan en el cuadro 2. Los dos ensayos mostraron buena consistencia con un total de correlación> 0,73.

Abreviaturas

BaP, benzo (a) pireno; DMSO, dimetil sulfóxido; HAP, hidrocarburos aromáticos policíclicos; PhIP, 2-amino-1-metil-6-phenylimidazo [4,5-b] piridina; CLP, Cryptolepine; ETOP, etopósido.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Normas Alimentarias del Reino Unido (T09002).