Journal of Inflammation (London, England), 2005; 2: 9-9 (más artículos en esta revista)

Proantocianidinas, desde Ribes nigrum hojas, reducir las moléculas de adhesión endoteliales ICAM-1 y VCAM-1

BioMed Central
N Garbacki (N. Garbacki @ ulg.ac.be) [1], M Kinet (kinet_marie@yahoo.fr) [1], B Nusgens (Betty.Nusgens @ ulg.ac.be) [2], D Desmecht ( Daniel.Desmecht @ ulg.ac.be) [3], J Damas (Jacques.Damas @ ulg.ac.be) [1]
[1] Laboratoire de Physiologie humaine, CHU, Tour 3, Université de Liège, Avenue de l'Hôpital, 3, B-4000 Sart Tilman, Belgium
[2] Laboratoire de Biologie des Tissus Conjonctifs, Tour 3, Université de Liège, Avenue de l'Hôpital, 3, B-4000 Sart Tilman, Belgium
[3] Departamento de Morphologie et de Pathologie, Pathologie générale, Faculté de Médecine vétérinaire, Université de Liège, bvd de Colonster, 20, B-4000 Sart Tilman, Bélgica

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Resumen
Antecedentes

Los efectos de proanthocyanidins (PAC), aislado de grosella negra, (Ribes nigrum L.) hojas, en la acumulación de neutrófilos en los procesos inflamatorios fueron investigados in vivo e in vitro.

Métodos

Estudios in vivo se realizaron con carrageenin pleuresía inducida en ratas pre-tratadas con PAC. Exudado volumen y acumulación de PMNs se midieron. Moléculas de adhesión leucocitaria (LFA-1, Mac-1 y VLA-4) en la movilización de granulocitos circulantes fueron analizadas por citometría de flujo y las moléculas de adhesión endoteliales (ICAM-1 y VCAM-1) fueron detectadas por inmunohistoquímica en secciones de pulmón.

In vitro se realizaron estudios sobre las células endoteliales LT2, estimuladas con TNF-α, para evaluar ICAM-1, IL-8 y la expresión de VEGF mRNA PAC a tratamiento.

Conjuntos de datos fueron examinadas por un sólo sentido en el análisis de la varianza (ANOVA) seguido de un Scheffe test post-hoc.

Resultados

Pretratamiento de los animales con la PAC (10, 30 y 60 mg / kg) inhibió la forma dosis-dependiente carrageenin pleuresía inducida en ratas mediante la reducción de la formación de exudado pleural y PMNs infliltration. Moléculas de adhesión leucocitaria movilización no fue reglamentado por el PAC por granulocitos. Inmunohistoquímica en secciones de pulmón mostró una disminución en la producción de moléculas de adhesión endoteliales.

Experimentos in vitro demuestran que las PAC fueron capaces de inhibir significativamente ICAM-1, pero no de IL-8 y la expresión de VEGF mRNA 165. Además, 121 VEGF mRNA expresión es dosis-dependiente mayor.

Conclusión

Este estudio proporciona evidencia de apoyo a la actividad antiinflamatoria de proanthocyanidins está relacionada con una inhibición de la infiltración de leucocitos que puede explicarse, al menos en parte por una baja regulación de las moléculas de adhesión endoteliales, ICAM-1 y VCAM-1 y de que estos compuestos Son capaces de modular las TNF-α inducida por VEGF transcripción.

Introducción

Célula-célula y célula-matriz extracelular interacciones desempeñar un papel central en la migración celular y la activación de leucocitos durante el proceso inflamatorio. Adhesión leucocitaria a las células endoteliales y la contratación de tejido extravascular son acontecimientos fundamentales en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria. Todos los pasos de la contratación en cascada son orquestadas por las moléculas de adhesión celular (CAM) expresado en tanto los leucocitos y las células endoteliales, y diferentes subconjuntos de CAM son responsables de los diferentes pasos en la extravasación de leucocitos [1]. Esto incluye la cascada selectins, las integrinas y los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas. La expresión de estas moléculas de adhesión es inducida por diferentes estímulos incluyendo citocinas como el TNF-α, IL-1 β, quimiocinas como la IL-8, lípidos y péptidos mediadores [2].

ICAM-1 (molécula de adhesión intercelulares-1, también designado como CD54) y VCAM-1 (molécula de adhesión de células vasculares-1, también designado como CD106) son miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas que participan en la adhesión celular. ICAM-1 es que normalmente se encuentran en la superficie de las células endoteliales, pero su expresión puede incrementarse significativamente a la activación de células endoteliales con citocinas o endotoxina. ICAM-1 se une a la integrina miembros de la subfamilia beta-1 como la LFA-1 (asociada a la función de linfocitos antígeno-1, también designado como CD11a/CD18) y Mac-1 (antígeno de macrófagos-1, también designado como CD11b/CD18 ). Adhesión leucocitaria al ICAM-1 se realiza por LFA-1 upregulation y cambio conformacional y por Mac -1 movilización a la superficie de la célula por la fusión de los gránulos de almacenamiento a la membrana celular [3]. VCAM-1, una proteína transmembrana endotelial, es la contra-receptor de la VLA-4 (antígeno muy tardío-4, también designado como α4β1 o CD49d/CD29). Esta última beta-1 integrina media la adhesión de linfocitos, monocitos, eosinófilos y células asesinas naturales activadas a las células endoteliales [4].

VEGF (Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular) y la IL-8 son las dos principales mediadores implicados en los procesos inflamatorios asociados con la angiogénesis [5, 6]. VEGF funciona como un crecimiento del endotelio y factor de supervivencia, sino que también aumenta la permeabilidad endotelial [5], y es de especial interés para la emigración de neutrófilos en el pulmón [7]. Provoca vasodilatación a través de la vía de la sintetasa del óxido nítrico en las células endoteliales [8] y puede activar la migración de los neutrófilos [7, 9, 10]. IL-8 estimula la capacidad de los neutrófilos para invadir los tejidos lesionados. Además de su influencia quimiotaxis, IL-8 también estimula una rápida Mac-1 y LFA-1 en los neutrófilos de expresión que permite la adhesión de estas células al activar las células endoteliales vasculares [11].

Proantocianidinas (PAC) son un grupo de los polifenoles biológicamente activos, sintetizado por muchas plantas. PAC aislados de grosella negra, (Ribes nigrum L.) hojas son monómeros y oligómeros de flavan-3-ol unidades, y el prodelphinidins la procyanidins [12, 13]. Estos compuestos se han notificado a tener propiedades anti-inflamatorias in vivo e in vitro [14 - 17]. Hemos demostrado que previamente PAC disminución de la acumulación de leucocitos circulantes y exudación de plasma durante carrageenin reacción inflamatoria aguda inducida en ratas. Este efecto anti inflamatorio se asoció con una reducción de las citoquinas pro-inflamatorias [18]. El presente estudio se realizó para aprovechar que las anteriores y la búsqueda de investigar los efectos de la PAC sobre las moléculas de adhesión durante los procesos inflamatorios.

Materiales y métodos
Proantocianidinas

Proantocianidinas de Ribes nigrum hojas fueron extraídos y aislados, de acuerdo con un método anteriormente descrito [12]. El vale de muestra (RN 210590) ha sido depositado en el Instituto Farmacéutico de Lieja, Bélgica. En síntesis, se deja en polvo por separado y, a continuación, extraído a temperatura ambiente con acetona (70% v / v en agua). La acetona se eliminó al vacío a 40 ° C. La solución acuosa resultante fue liofilizada. Aislamiento de monómeros y oligómeros se llevó a cabo por MPLC invertido en la fase RP8 con agua-acetona (9:1) para obtener un total proanthocyanidin enriquecido fracción (PAC).

Carrageenin pleuresía inducida en ratas
ICAM-1, IL-8 y VEGF mRNA LT2 expresión en las células endoteliales
Evaluación estadística

Los resultados se ofrecen como media ± error estándar de la media (se quiere decir), de N observaciones. Conjuntos de datos fueron examinadas por un sólo sentido en el análisis de la varianza (ANOVA) seguido de un Scheffe test post-hoc. Un P-valor inferior a 0,05 fue considerado significativo.

Resultados
Carrageenin inducida pleuresía

En el control de ratas, el volumen del exudado recogidas 4 h después de la inyección carrageenin llegó a 0,98 ± 0,06 ml por rata (n = 6) (Figura 1]. Este exudado contenía un gran número de células, en su mayoría (> 95%) de leucocitos polimorfonucleares (PMNs). El número total de leucocitos en el exudado fue 88,53 ± 5,4 × 10 6 por rata (Figura 2]. PAC (10, 30 y 60 mg / kg) redujo significativamente el volumen del exudado en una relación dosis-dependiente (de, respectivamente, 31, 37 y 55%). Por otra parte, la infiltración de PMNs también se inhibió por PAC en una forma dependiente de la dosis (de, respectivamente, 64, 73 y 75%).

Producción de LFA-1, Mac-1 y VLA-4

Con el fin de examinar si PAC afecte la expresión de moléculas de adhesión en los leucocitos durante carrageenin inducida por pleuresía, la expresión de moléculas de tres diferentes: LFA-1 (CD11a/CD18), Mac-1 (CD11b/CD18) y VLA-4 (CD49d / CD29) fue medido por citometría de flujo.

Ninguna de estas moléculas fue significativamente durante modulada carrageenin pleuresía inducida (Figura 3]. La aspirina redujo el nivel de VLA-4, como también hizo PAC en 10 mg / kg (Figura 3C], pero a los 60 mg / kg PAC aumento de la expresión de Mac-1 (Figura 3B] y VLA-4 (Figura 3C].

Inmunohistoquímica localización de ICAM-1 y VCAM-1

El análisis inmunohistoquímico de las secciones de pulmón obtenidos de los animales, tratados con carrageenin sola, reveló tinción positiva para ICAM-1 (Figura 4] y VCAM-1 (Figura 5]. En cambio, la farsa grupo mostró tinción pobres. En el tejido pulmonar antes de la PAC de las ratas tratadas con tinción inmunohistoquímica para ICAM-1 y VCAM-1 era inferior a las de control positivo y desapareció con la dosis más alta probada para alcanzar el nivel de control negativos a los 60 mg / kg.

ICAM-1, VEGF e IL-8 mRNA expresión

PAC se probaron de 5 a 100 μ g / ml en LT2 celdas durante 24 horas y no significativa a las citotóxica para todas las dosis utilizadas. El efecto de la PAC sobre el TNF-α inducida por ICAM-1, VEGF e IL-8 expresión en las células LT2 fue investigado. Basal ICAM-1, IL-8, VEGF 121 y VEGF 165 eran bajos niveles de expresión en las células no (Figura 6]. El tratamiento de las células con TNF-α durante 12 h aumentó significativamente la expresión de ICAM-1, IL-8, VEGF 121 y VEGF 165. El tratamiento de las células con PAC por sí solo no tuvo ningún efecto sobre la expresión basal de ICAM-1, VEGF e IL-8 genes de las células LT2 (datos no presentados). Hubo una inhibición significativa de inducible de expresión de ICAM-1 se observó en una forma dependiente de la dosis en el TNF-α estimula las células (Figura 6A]. PAC no modificar significativamente la IL-8 (Figura 6B] ni VEGF 165 (Figura 6D] en la expresión de TNF-α estimula las células mientras que el aumento de dosis-dependiente de la expresión de VEGF 121 (Figura 6C].

El downregulation efectos de la PAC sobre inducible de expresión de ICAM-1 no fueron resultado de la citotoxicidad, porque no existe una diferencia significativa de la viabilidad, se observó entre los no tratados o tratados con células PAC (hasta 100 μ g / ml), utilizando el ensayo MTT.

Discusión

Nuestros resultados confirman y extienden los datos anteriores [14 - 16, 18] que muestran que proanthocyanidins (PAC) de Ribes nigrum deja reducir carrageenin inducida pleuresía. El volumen del exudado fue dosis-dependiente disminuida por las PAC. En este fluido, PAC disminuyó la IL-1 β, TNF-α, CINC-1 y nitrito / nitrato [18]. Simultáneamente, los niveles de leucocitos, la mayoría de las células polimorfonucleares, se redujeron. El transvasation de leucocitos de la sangre para el exudado inflamatorio requiere de la activación de leucocitos y expresión de moléculas de adhesión en la superficie de las células endoteliales. Hemos examinado ambos procesos. PAC no redujo significativamente la expresión de moléculas de adhesión en la superficie de leucocitos, pero reducido en gran medida la producción de moléculas de adhesión en la superficie de las células endoteliales in vivo inducida durante carrageenin pleuresía.

Tres moléculas de adhesión expresadas por los leucocitos fueron examinados. LFA-1 (CD11a/CD18), no se guarda dentro de los leucocitos, su upregulation más probable es que el resultado de un cambio conformacional que permite a los leucocitos para interactuar con ICAM-1 [3]. Todos los animales tratados con solución salina o carrageenin en la cavidad pleural o PAC mostraron el mismo nivel de expresión LFA-1. Esta falta de diferencia podría depender del hecho de que nuestros anticuerpos no pueden diferenciar silente LFA-1 de ALF-1 activado. Por otra parte, el PAC no redujo Mac-1, un inducible β2-integrina, pero el aumento de su expresión a dosis altas. Aunque las dosis bajas de las PAC reducido VLA-4 de expresión, de dosis más altas de las PAC aumentó su movilización a la membrana. La influencia de la PAC en las moléculas de adhesión de leucocitos es variable y por lo tanto no pueden explicar la reducción de la acumulación de leucocitos en el líquido pleural.

En el tejido pulmonar, nuestros estudios inmunohistoquímicos mostraron una disminución dependiente de la dosis en la expresión de VCAM-1 y la ICAM-1. Estos resultados fueron confirmados por el examen de la producción de ICAM-1 por LT2 células endoteliales in vitro. PAC forma dosis-dependiente la reducción de ICAM-1 mRNA de producción, lo que sugiere que las PAC inhibe la producción de ICAM-1 en el nivel de mRNA. Previamente, se demostró que otros compuestos de la familia proanthocyanidin inhibir la expresión de moléculas de adhesión endoteliales, en pacientes con esclerosis sistémica [21], en los queratinocitos [22] y en HUVEC [23]. En LT2 células endoteliales, el nivel de ICAM-1 mRNA se aumentó de 25 veces por TNF-α. Esta superproducción dependerá de la activación de NF-κ B JNK/AP-1 o de la vía. Resultados anteriores de nuestro laboratorio (datos no presentados) han revelado que las PAC son capaces de inhibir el NF-κ B activación, pero en concentraciones 10 veces superiores a la dosis utilizada para inhibir la ICAM-1 mRNA expresión en las células LT2. Por otra parte, los compuestos de la familia proanthocyanidin se han sugerido para inhibir la activación de JNK-1 y c-JUN [23]. Así, la inhibición de la expresión de moléculas de adhesión por las PAC puede estar relacionado con una interferencia de JNK/c-JUN/AP-1 vía.

La inhibición de la ICAM-1 por la producción de mRNA PAC fue más bien específicas como PAC no redujo la IL-8 mRNA y VEGF mRNA en células LT2. Aunque hemos observado que inhibe in vivo PAC-1 CINC producción durante carrageenin inducida por pleuresía, estos compuestos no afectó la producción de moléculas similares, como la IL-8 por las células endoteliales LT2. Por otra parte, el PAC interactuar con VEGF mRNA expresión in vitro. VEGF funciona como un crecimiento del endotelio y factores de supervivencia y también aumenta la permeabilidad vascular [5]. Puede desempeñar un papel relevante en la migración de neutrófilos. Cinco humanos VEGF mRNA especies codificación isoformas de VEGF, entre ellos, el más abundante 121 y 165 aminoácidos son producidas por splicing alternativo de VEGF mRNA [24]. La supresión de VEGF 121 comienza en el codón 116 de la forma madura de VEGF 165 [24]. PAC no influyó en la expresión de VEGF mRNA 165, pero provocó un aumento de la expresión de VEGF 121. El VEGF es estimulada por la producción de citocinas como la IL-6 [25], IL-1 β [26] y TNF-α [27]. Sobre regulación de VEGF inducible en queratinocitos humanos HaCaT por proanthocyanidin compuestos de la familia también fue observado por Khanna et al. [28, 29], que correlacionó esta propiedad a la actividad redox de estos productos. Proantocianidinas son, de hecho, conoce a la pantalla anti-oxidantes y los radicales libres los basureros propiedades [30 - 34]. Este efecto de VEGF sobre regulación puede tener un papel beneficioso en la regulación y facilitar la cicatrización de heridas.

En conclusión, nuestro estudio ofrece evidencia para apoyar que la actividad antiinflamatoria demostrada por proanthocyanidins hojas de grosella negra se relaciona con la baja regulación de las moléculas de adhesión endoteliales, ICAM-1 y VCAM-1, probablemente a través del factor de transcripción AP-1 reglamento Itinerario. Sería de gran interés en un futuro próximo para determinar el efecto de la PAC y de los compuestos similares en la vía JNK/c-Jun/AP-1 reglamentario. Además, la PAC son capaces de modular la transcripción inducible VEGF. El papel de las PAC en la cicatrización de heridas aún queda por determinar.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

NG PAC llevó a cabo el aislamiento, la inmunohistoquímica, cultivo de células, RT-PCR, análisis estadístico, participó en la experimentación animal, y redactó el manuscrito. MK realizado citometría de flujo y participó en la experimentación animal. BN coordinada de cultivo celular y las técnicas de RT-PCR. DD coordinado y ayudado en inmunohistoquímica. JD participó en la experimentación animal, en el concepto, el diseño y la coordinación del estudio y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.