Lipids in Health and Disease, 2005; 4: 16-16 (más artículos en esta revista)

NPC1L1 haplotipo se asocia a la variación inter-individual en plasma de las lipoproteínas de baja densidad respuesta a ezetimiba

BioMed Central
A Robert Hegele (hegele@robarts.ca) [1], Justin Guy (hegele@robarts.ca) [1], Mateo R prohibición (mban@robarts.ca) [1], Jian Wang (jwang@robarts.ca) [1]
[1] Grupo de Biología Vascular, Robarts Research Institute, Londres, Ontario, Canadá
[2] Departamento de Medicina de la Schulich School de Medicina y Odontología de la Universidad de Western Ontario, London, Ontario, Canadá

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Resumen
Antecedentes

NPC1L1 codifica una putativa intestinal esterol transportador, que es el probable objetivo de la ezetimiba, un nuevo tipo de fármacos hipolipemiantes. Nos informó anteriormente raras mutaciones no sinónimas en NPC1L1 en un individuo que no tuvo respuesta a las lipoproteínas plasmáticas de ezetimiba. Seguidamente, la hipótesis de que las variantes comunes en NPC1L1 menos extremas que subyacen entre las variaciones individuales en la respuesta del colesterol LDL en plasma a la ezetimiba.

Resultados

En 101 sujetos con dislipidemia, encontramos que NPC1L1 haplotipo se asoció significativamente con la variación inter-individual en la respuesta del colesterol LDL del plasma para el tratamiento con ezetimiba durante 12 semanas. En concreto, alrededor de un tema en ocho carecían de la NPC1L1 haplotipo común 1735C-25342A-27677T y estos temas tuvieron una mayor reducción del colesterol LDL en plasma con ezetimiba de sujetos con al menos una copia de este haplotipo (-35,9 +4,0 versus -23,6 + 1,6 por ciento de reducción, P = 0,0054). Esto fue acompañado de la misma tendencia no significativa de la diferencia entre los haplotipos en la reducción de colesterol total.

Conclusión

Estos resultados preliminares sugieren que la farmacogenética NPC1L1 se asocia a la variación inter-variación individual en la respuesta a la ezetimiba tratamiento.

Antecedentes

Ezetimiba, el primer miembro de una nueva clase de medicamentos, principalmente reduce las concentraciones plasmáticas de lipoproteínas de baja densidad (LDL), mediante el bloqueo de la absorción de esteroles en enterocitos [1]. Ezetimiba probablemente interfiere con la función normal del gen NPC1L1 producto, que parece regir esterol absorción en el intestino delgado [2 - 5]. La media de reducción de colesterol LDL en plasma visto con ezetimiba es de 20 a 25%, y esto ha sido notablemente consistente en los subgrupos de pacientes definido por la edad, el género, la etnia y el uso concomitante de otros agentes de la regulación de los lípidos, como las estatinas drogas [6 - 9] . Pero a pesar de la concordancia en las reducciones de media, hay una amplia gama de la variación inter-individual en la respuesta del colesterol LDL a la ezetimiba. Una posible base genética para esta variación entre individuos fue sugerido por nuestra observación anterior de raro no sinónimos NPC1L1 mutaciones en un no respondedor a ezetimiba [10]. En el curso de esos estudios, hemos identificado varios polimorfismos de nucleótido único (SNP) en NPC1L1 [10]. Estos SNPs han permitido a la evaluación de la variación genética común en NPC1L1, que se sustentan la hipótesis de menos extremas entre las variaciones individuales en la respuesta del colesterol LDL en plasma a la ezetimiba.

Resultados
Datos clínicos y demográficos

Descriptivo de las características clínicas de referencia se muestran en la Tabla 1. Todos los sujetos tenían de referencia y el seguimiento de los perfiles de la lipoproteína de ayuno medido. El seguimiento medio fue de 84 días (12 semanas). Ninguno de los 101 sujetos se retiraron del tratamiento y el cumplimiento fue excelente como juzgados por contar comprimido. No se informaron eventos adversos. La media de las respuestas a la ezetimiba tratamiento se muestran en la Tabla 2. La gama de colesterol LDL respuestas a ezetimiba tratamiento se muestran en la Figura 1. No hubo diferencia en el colesterol LDL significa cambio en las mujeres versus hombres o en temas de ezetimiba en monoterapia frente a los sujetos de ezetimiba con estatinas en combinación con el tratamiento.

Descriptores estudio genético de la muestra

NPC1L1 genotipo frecuencias se muestran en la Tabla 2. Alelo frecuencias fueron: 1) 0,75 y 0,25 por 1735C y 1735G, respectivamente; 2) 0,72 y 0,28 para 25342A y 25342C, respectivamente, y 3) 0,80 y 0,20 por 27677T y 27677C, respectivamente. Pares vinculación desequilibrio coeficientes de correlación para los pares SNP 1735C> G: 25342A> C, 1735C> G: 27677T> C y 25342A> C: 27677T> C fueron 0,24 (P = 0,017), 0,30 (P <0,0001) y 0,44 (P <0,0001), respectivamente. Por lo tanto, fue moderado, pero no fuerte vinculación desequilibrio entre estos pares de SNPs. Máxima probabilidad de haplotipos definiciones y frecuencias se muestran en la Tabla 3. El más común de haplotipos (frecuencia ~ 0,6) se definió como 1735C-25342A-27677T y designado como "haplotipo 2". Por ANOVA, NPC1L1 haplotipos se derrumbó en tres grupos, en base a la presencia o ausencia de haplotipo 2. Así, los participantes en este estudio tiene una de tres posibles diploide resumen haplotipos: 2 / 2, 2 / X o X / X, donde X se refiere a cualquier no-2 haplotipos. Hubo 37, 51 y 13 de los sujetos con los haplotipos de 2 / 2, 2 / X y X / X, respectivamente.

Genéticos asociaciones con las lipoproteínas plasmáticas

ANOVA (Cuadro 4] no mostró diferencias significativas entre la base de referencia las lipoproteínas plasmáticas. Sin embargo, el porcentaje de cambio en el colesterol LDL en ezetimiba de referencia fue significativamente diferente entre los haplotipos (P = 0,02) y el porcentaje de cambio en el colesterol total de la base de referencia de ezetimiba tienden a ser diferentes entre los haplotipos. Las importantes diferencias entre los haplotipos de ANOVA se explorarse más asumiendo un modelo dominante de la presencia de haplotipos de 2, en la que los sujetos con los haplotipos de 2 / 2 o 2 / X fue evaluado como "A" y sujetos con haplotipo X / X fue evaluado como "B". En este modelo, los sujetos con haplotipo X / X tuvo un mayor por ciento de reducción de LDL colesterol en el plasma de la línea de base sobre temas ezetimiba que hizo con los haplotipos de 2 / 2 o 2 / X (-35,9 frente a -23,6 ± 4,0 ± 1,6 por ciento, P = 0,0054). El rango de reducción del colesterol de las LDL en sujetos con haplotipo X / X se -68,2 a -19,6 por ciento. Además, los sujetos con haplotipo X / X tienden a tener un mayor por ciento de reducción de colesterol total en plasma de la línea de base sobre temas ezetimiba que hizo con los haplotipos de 2 / 2 o 2 / X (-22,8 ± 3,4 vs -15,9 ± 1,3 por ciento, P = 0,058 ).

Otro análisis post hoc de cada uno de los SNPs encontró que el 11 homocigotos para el alelo 25342C había un mayor por ciento de reducción de LDL colesterol en el plasma de la línea de base sobre la ezetimiba más que otros sujetos (P = 0,02). Además, los cinco homocigotos para el alelo 27677C había un mayor por ciento de reducción de LDL colesterol en el plasma de la línea de base sobre la ezetimiba más que otros sujetos (P = 0,013).

Discusión

En este mismo análisis preliminar de una pequeña muestra de sujetos con hipercolesterolemia, encontramos que la variación genética en NPC1L1, tal como se define por un período de tres SNP sitio de haplotipos, se asoció significativamente con la variación inter-individual en la respuesta del colesterol LDL en plasma a 12 semanas De tratamiento con ezetimiba 10 mg diarios. En concreto, alrededor de un tema en ocho no tiene el común de NPC1L1 haplotipo 1735C-25342A-27677T (denominadas "haplotipo 2"); estos temas se encontró que tienen una mayor reducción del colesterol LDL en plasma con ezetimiba de sujetos con al menos un Copia del haplotipo 2 (-35,9 ± 4,0 vs -23,6 ± 1,6 por ciento de reducción, P = 0,0054). Esto fue acompañado de la misma tendencia no significativa entre los haplotipos de las diferencias en la reducción de colesterol total. No se observaron diferencias entre los haplotipos en ezetimiba relacionados con los cambios en los triglicéridos plasmáticos o HDL.

Al igual que con muchos estudios de asociación, el presente estudio tiene limitaciones [11], en particular: 1) el pequeño tamaño de la muestra, 2) no se muestra de replicación; 3) no demostró las consecuencias funcionales de la NPC1L1 SNP o haplotipos, 4) no fenotipo intermedio, tales Como la absorción de colesterol, y 5) el potencial de que los resultados positivos se relacionan con la vinculación con el desequilibrio no los marcadores en o cerca de la NPC1L1 locus. Además, no todos los SNPs genotipo en este locus. Sin embargo, los experimentos de detección genómica anterior [10] indicó que el resto de SNPs son poco frecuentes y, por tanto, menos posibilidades de agregar información a los tres SNPs estudiados. La inclusión de estas raras genotipos SNP en el haplotipo extendido tendría subdividir los datos en muy pequeñas de células para el análisis estadístico.

Nuestro estudio confirma la semejanza de la media de colesterol LDL respuesta a la ezetimiba, es decir, un 20 a 25% de reducción, en el estudio de diferentes muestras y toda una serie de características demográficas como el sexo y el tratamiento concomitante con estatinas (6-9). La figura 1 muestra que esto significa coherente de reducción de colesterol LDL se produce en el fondo de relativamente amplia entre variación individual en la respuesta. Nuestros resultados indican además que los sujetos que llevan la NPC1L1 haplotipos más comunes (es decir haplotipo 2), tienen la ezetimiba relacionados con la reducción de colesterol LDL que se encuentra dentro de la espera de 20 a 25% gama. Sin embargo, un pequeño pero importante grupo de sujetos sin haplotipo 2 experimentado una significativa mayor reducción del colesterol LDL, del orden de 35%.

Conclusión

El actual hallazgo de NPC1L1 asociada a las diferencias individuales entre las LDL-colesterol en respuesta a ezetimiba junto con nuestros anteriores missense rara demostración de que las mutaciones en NPC1L1 se asocian con la falta de respuesta a la ezetimiba [10] apoyo una relación entre este gen y el mecanismo de producto De la acción de la ezetimiba. Es evidente que, más mecanicista y los estudios genéticos son necesarios. Pero estos resultados farmacogenéticos, si se confirma, son consistentes con la idea de que la NPC1L1 es el objetivo ezetimiba.

Métodos
A los sujetos de estudio

Entre diciembre de 2003 y mayo de 2004, 101 pacientes con hipercolesterolemia primaria (definida como elevación de colesterol LDL) fueron tratados con ezetimiba 10 mg diarios de acuerdo a las directrices nacionales de la dislipemia [12]. Atributos demográficos básicos de los sujetos de estudio se muestran en la Tabla 1. Alrededor de un tercio de los pacientes no estaban tomando ninguna medicación hipolipemiante y el resto se mantuvieron estables en el tratamiento con estatinas de ≥ 12 semanas de duración antes del inicio de la ezetimiba. Tratamiento concomitante con estatinas incluyeron atorvastatina, simvastatina y rosuvastatina en 30, 28 y 12 pacientes, respectivamente. Todos los temas siempre el consentimiento informado y el estudio fue aprobado por el Panel de Revisión Ética de la Universidad de Ontario Occidental (revisión número 07920E).

Análisis bioquímicos y genéticos

El perfil de la lipoproteína de 12 horas después de un período de ayuno se determinó antes de iniciar el tratamiento ezetimiba y de nuevo después de un seguimiento medio de 12 semanas. Lipoproteína determinaciones se realizaron según el Programa de Ontario Lipoproteína Proficiency normas y colesterol LDL se calculó utilizando la Friedewald-Levy-Fredrickson fórmula [13].

Se extrajo el ADN genómico y tres informativo NPC1L1 SNPs comunes de toda la secuencia de codificación se eligieron genotipo. Alelo-específicas de genotipos se utilizaron los métodos [10]. Para el genotipo del exón 2 SNP 1735C> G (nombre trivial L272L, dbSNP número 2072183), que amplifica un fragmento de 381 pb que contiene el exón 2 usando primers 5 'GCT CAA GGG CTT CCA AGA CA y 5' AGC TTG GAG TCA AGG CTG G . Esto fue seguido por el tratamiento con camarones fosfatasa alcalina (SAP) y ExoI ExoI para eliminar los cebos y no incorporado dNTPs, seguido de la extensión ddNTP (SnaPShot, PE Applied Biosystems, Mississauga, ON) con primers 5 'GGC ATA AGC ATG TGC CAC y AC En un análisis de 3730 Secuenciador de ADN (PE Applied Biosystems, Mississauga, ON). Para el genotipo del intrón 18 SNP 25342A> C, que amplifica un fragmento de 766 pb que contiene intrón 18 usando primers 5 'GCC CAG GAA GGT GGA GTA y GTC 5' TTG CGT TGT AGA CAT ACA CTG TAG. Esto fue seguido por el tratamiento con SAP y ExoI ExoI para eliminar los cebos y no incorporado dNTPs, gel de purificación y de extensión con ddNTP primer 5 'CTG AAC CAC GAC TGG CTC TGA y análisis de fragmentos. Para el genotipo del exón 20 SNP 27677T> C (nombre trivial V1296V), que amplifica el fragmento de 558 pb que contiene el exón 20 usando primers 5 'GAA GCT TGG GCT GTG AAC A y 5' CCA CTA GAG TGG CAG AGG AG. Esto fue seguido por el tratamiento con SAP y ExoI ExoI para eliminar los cebos y no incorporado dNTPs, gel de purificación y ddNTP extensión (SnaPShot, PE Applied Biosystems, Mississauga, ON) con primers 5 'TCT CTC CGC AGG TGA CCG CGT, y los fragmentos de análisis.

Análisis estadístico

Los análisis se realizaron utilizando SAS versión 8.2 (Cary, NC), con un nivel de significación definida como P <0,05. Importancia de la desviación de las frecuencias de SNP genotipo equilibrio de Hardy-Weinberg se evaluó mediante el análisis de Chi cuadrado. Pares vinculación desequilibrio entre NPC1L1 alelos se determinó a través de los coeficientes de correlación que se describen [14]. Tres de sitio máxima probabilidad haplotipos se construyeron utilizando FASE versión 2,0 [15]. Análisis de varianza (ANOVA) fue utilizada para identificar fuentes significativas de la variación cuantitativa de plasma fenotipos con aviones F-valores calculados a partir del tipo III sumas de cuadrados, que es el más apropiado para desequilibrada diseño de los estudios. Las variables dependientes fueron ANOVA en porcentaje de cambio desde la línea base de plasma total, LDL y lipoproteínas de alta densidad (HDL) el colesterol y los triglicéridos. La variable independiente en el ANOVA se NPC1L1 haplotipo, con la edad y el sexo como covariables dentro de cada modelo.

Contribuciones de los autores

Robert A. Hegele: diseño experimental, manuscrito preparación

Justin Guy: la generación de datos y la interpretación, la aprobación manuscrito

Matthew R. prohibición: el análisis de datos, manuscrito aprobación

Jian Wang: análisis de datos, edición, aprobación manuscrito

Agradecimientos

Apoyado por el Jacob J. Wolfe Distinguido de Investigación Médica de Presidencia, la Schulich Edith Vinet Cátedra de investigación de Canadá (Tier I), en la Genética Humana, una carrera de investigador premio de la Fundación del Corazón y los trazos de Ontario, y las subvenciones de funcionamiento de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud , La Fundación del Corazón y los trazos de la provincia de Ontario y de la Investigación y el Desarrollo Challenge Fund (Proyecto # 0507).