Cancer Cell International, 2005; 5: 21-21 (más artículos en esta revista)

Características estructurales y funcionales de los análogos contra el péptido Pep27

BioMed Central
Lee Dong Gun (dglee222@knu.ac.kr) [1], Kyung-Soo Hahm (kshahm@chosun.ac.kr) [2], Yoonkyung Park (y_k_park@chosun.ac.kr) [2], Hai - Young Kim (eggto@spin.yonsei.ac.kr) [3], Weontae Lee (wlee@spin.yonsei.ac.kr) [3], Sung-Chul Lim (sclim@chosun.ac.kr) [4] , Youn-Kyung Seo (syk08@hanmail.net) [5], Cheol-Hee Choi (chchoi@chosun.ac.kr) [5]
[1] Escuela de Ciencias de la Vida y Biotecnología de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Kyungpook, 1370 Sankyuk-dong, Puk-ku, 702-701 Taegu, Corea
[2] Centro de Investigación en Materiales Proteinous, Universidad Chosun, 501-759 Gwangju, Corea
[3] Departamento de Bioquímica y HTSD-RMN Laboratorio Nacional de Investigación de la Universidad Yonsei, Seúl, Corea del Sur
[4] Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad Chosun, 501-759 Gwangju, Corea
[5] Centro de Investigación de Células de Resistencia y el Departamento de Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad Chosun, 501-759 Gwangju, Corea

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

Un péptido secretado Pep27 inicia el programa de muerte celular en S. Pneumoniae a través de la transducción de señales. Este estudio se realizó para evaluar la relación entre la estructura y la actividad citotóxica de Pep27 y sus análogos en las células del cáncer.

Resultados

Pep27anal2 caracteriza sustituyendo (2 R → W), (4 E → W), (11 S → W) y (13 Q → W) en Pep27 nativos, exhibió una mayor actividad contra el cáncer y la hidrofobicidad que Pep27 y otros análogos. La CI 50 de Pep27anal2 valores fueron de aproximadamente 10 - 30 μ M en una serie de líneas celulares (AML-2, HL-60, Jurkat, MCF-7 y SNU-601). La microscopía confocal mostraron que Pep27anal2-FITC fue localizado en la membrana plasmática y, a continuación, pasar de la membrana a los compartimentos subcelulares con el inicio de la membrana blebbing. Análisis de citometría de flujo utilizando yoduro de propidio y Annexin V Pep27anal2 reveló también que la apoptosis inducida con daños menores membrana. Microscopía electrónica reveló que Pep27 indujo apoptosis en células Jurkat. La actividad anticancerígena de Pep27anal2 no era ni derogados por pan-inhibidor de caspasas (Z-VAD-fmk), ni los relacionados con la liberación del citocromo c de la mitocondria. La solución 3D de las estructuras de estos dos péptidos Pep27 puesto de manifiesto que ambos forman una bobina conformación azar en el agua, sin embargo, adoptaron estable α-helicoidal conformaciones en soluciones.

Conclusión

Los resultados indican que Pep27anal2 puede penetrar en la membrana plasmática, y luego inducir la apoptosis tanto en caspasa-citocromo c-y de manera independiente. La hidrofobicidad de Pep27anal2 parece desempeñar un papel importante en la permeabilización de la membrana y / o propiedades contra el cáncer. La estructura de relaciones funcionales de estos péptidos también se examinan. Se propone que Pep27anal2 es un posible candidato para agentes terapéuticos contra el cáncer.

Introducción

Recientemente descubiertas péptidos son cada vez más importantes, no sólo como herramientas moleculares para la comprensión de las interacciones proteína-proteína, pero también como compuestos de plomo. Amphipathic péptidos catiónicos, como cecropins, defensinas, y la melitina, inducir la muerte celular en células eucarióticas procariótico y aumentando la permeabilidad de la membrana [1]. Este aumento de la permeabilidad puede conducir a la lisis celular o, en su defecto, puede producir cambios sutiles en la función barrera de la membrana y promover la muerte celular [2]. También se ha demostrado que las actividades contra el cáncer de la riqueza natural y sintética exposición de péptidos catiónicos actividad terapéutica en modelos murinos de tumores humanos [3 - 5].

Se ha propuesto que los procesos que ocurren dentro de las bacterias son necesarias para activar la endógeno suicida enzimas que disuelven la pared celular inducida por antibióticos durante autolisis. Recientemente, Pep27, fue encontrado para iniciar el programa de muerte celular en S. Pneumoniae a través de la transducción de señales desencadenada a través de los dos componentes del sistema (VncR / S) que consiste en una membrana de proteína histidina quinasa (por ejemplo, VncS), y un efector citoplásmico denomina una respuesta regulador (por ejemplo, VncR) [6]. Pep27 se secreta a través de la Vex ABC transportador y se acumula en el medio [6, 7]. Pep27 acumulado es percibido por VncS entonces, la conversión de esta proteína quinasa histidina en una fosfatasa que dephosphorylates fosforilados VncR, permitiendo desrepresión autolíticas de las vías y provocaron la pérdida de viabilidad y la lisis de las células neumocócicas.

El presente estudio fue la identificación de los análogos de la muerte bacteriana péptido señal Pep27 capaz de inhibir el crecimiento de células cancerosas, y para investigar la naturaleza de la relación entre su comportamiento biológico y sus estructuras moleculares.

Materiales y métodos
Cultura

OCI-AML-2 (AML-2) línea celular se obtuvo del Instituto de Cáncer de Ontario (Toronto, Canadá), y Jurkart y HL-60 líneas celulares de la American Type Culture Collection (ATCC, EE.UU.). Estas tres líneas de células se cultivaron a 37 ° C en el 5% de la atmósfera de CO 2 utilizando α-MEM medio (GibcoBRL, Gland Island, NY, EE.UU.), que contiene el 10% de calor-inactivadas suero fetal bovino (SFB, Sigma, ST. Louis, MO, EE.UU.). MCF-7 y NIH/3T3 líneas celulares de ATCC y SNU-601 de la línea celular de células de cáncer Banco de Corea (Seúl, Corea) se cultivaron en las mismas condiciones pero utilizando medio RPMI-1640 (GibcoBRL, Gland Island, NY, EE.UU.) Con 10% de SFB inactivado por calor. Las células se mantienen en suspensión o como monocapas, y subcultured.

Péptido de síntesis

Péptidos fueron sintetizados mediante el uso de un método de la fase sólida usando (basado en) Fmoc (9-fluorenyl-methoxycarbonyl)-química [8]. Rink amida 4-metil benzhydrylamine (MBHA) resina (0,55 mmol / g) se utilizó como apoyo. Acoplamiento de Fmoc-aminoácidos se realizó por DCC (dicyclohexyl-carbodiimide/HOBt (1-hydroxybenzotriazole). Después de la terminación de elongación de la cadena peptídica, la protección final péptido resinas fueron tratados con el reactivo K. El péptido crudo obtenido se lavan repetidas veces con Dietiléter, secos en el vacío, y purificada por invertir la fase (RP) HPLC (LC10A, Shimadzu, Tokio, Japón) en una de 15 m aguas Deltapak C18 columna. La pureza del péptido fue verificada por analítica RP-HPLC utilizando un Ultrasphere C18 columna (4,625 cm, Beckman, Miami, FL, EE.UU.). Purificada se hidrolizada con péptidos 6 N HCl a 110 ° C durante 22 h, y lo secan en el vacío. Los residuos se disuelve en 0,02 N HCl y sometidos a aminoácidos Análisis (8500 A, Hitachi, Tokio, Japón) para determinar la concentración de péptido. Los pesos moleculares de los péptidos sintéticos se determinó por MALDI (matriz de desorción asistida por láser de ionización) espectros de masa, respectivamente (datos no presentados).

Citotoxicidad de prueba

La citotoxicidad in vitro de la Pep27 similares de producción se mide por MTT [3 - (4,5-dimethylthiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro, Sigma, ST. Louis, EE.UU.] de ensayo, tal y como se describe por [9]. IC 50 se determinó semilogarithmic directamente de las curvas de dosis-respuesta. Los experimentos se llevaron a cabo al menos por duplicado.

Actividad hemolítica

Péptido hemolítica se midieron las actividades descritas por [10], mediante la determinación de hemoglobina en libertad por el 4% de las suspensiones de eritrocitos humanos frescos a 414 nm. En pocas palabras, en eritrocitos humanos células fueron centrifugadas y lavados tres veces con solución salina amortiguadora de fosfato (PBS: 35 mM fosfato buffer/0.15 M NaCl, pH 7,0). 100 ml de glóbulos rojos humanos suspendido el 8% (v / v) en PBS fueron inoculados en las placas de 96 pozos. 100 ml de la solución péptido, Pep27 o sus análogos, se añadió a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 h a 37 ° C, y se centrifuga a 150 g durante 5 min. 100 ml alícuotas del sobrenadante obtenidos fueron transferidos a la parte inferior plana de 96 placas microtiter. Hemólisis fue determinada por la medición de absorbancia a 414 nm con un lector de placas ELISA (Emax Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Hemólisis tasas de 0% o 100% se determinaron como de la misma manera con PBS y 0,1% Triton-100, respectivamente. Hemólisis por ciento se calculó mediante la ecuación siguiente: hemólisis% = [(Abs414nm péptido en la solución - Abs414nm en PBS) / (Abs414nm en 0,1% Triton-100 - Abs414nm en PBS)] × 100.

Preparación de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-etiquetados péptido

FITC recién fue disuelta en DMSO a 10 mg / ml, y se añaden a 1 mg / ml de péptido de bicarbonato de sodio 100 mM, pH 9,3 a una concentración final de 1 mg / ml FITC. Después de una incubación de 4 horas en la oscuridad a temperatura ambiente, 1 M etanolamina se añadió a inactivar el FITC residual. La solución fue luego a la izquierda en la oscuridad por un período adicional de 2 horas, y chromatographed secuencialmente en un gel-filtración de la columna seguida de una 120 cm Sephadex G-50 para eliminar columna cribado tinte. El FITC-etiquetados péptido (FITC-Pep27anal2) fue obtenido por HPLC en fase reversa utilizando una columna C18. Conjugación entre FITC y el péptido de interés fue confirmado por SDS-PAGE gel como péptido intensa fluorescencia a la luz ultravioleta.

La microscopía confocal

Jurkat células cultivadas en vaso coverslips noche a la mañana fueron tratados con FITC-etiquetados Pep27anal2 a una concentración de 5 μ g / ml. Las células fueron lavadas con PBS a los 30, 60 y 120 minutos en tratamiento de Pep27anal2 y, a continuación, fija usando el 3,7% formaldehído durante 15 min. Coverslips fueron montados en portaobjetos de vidrio, se entusiasma FITC utilizando un láser de 488 nm-, y las imágenes fueron manipuladas mediante la fabricación de software.

Determinación de la apoptosis y la integridad de membrana

Annexin V vinculantes fue evaluada por citometría de flujo, y la tinción de células se evaluó usando la etiqueta FITC-annexin V (fluorescencia verde), y yoduro de propidio (PI) (negativas de fluorescencia de color rojo) al mismo tiempo. Esta prueba fue capaz de discriminar entre las células intactas (FITC-/PI-), en apoptosis (FITC + / PI-) y células necróticas (FITC + / IP +) (Vermes et al., 1995). Jurkat células (10 5 / ml) fueron expuestos al etopósido (100 μ M), melitina (12,5 μ M) y Pep27anal2 (12,5 μ M y 62,5 μ M) para 4 hr. Las células fueron lavadas con PBS, resuspendido en 400 μ l de buffer vinculante (10 mM Hepes / NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2.5.mM CaCl2), y se incubaron con 10 μ l de annexin V-FITC (MedSystems Diagnóstico, GmbH, Australia ) Durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, las células fueron lavadas con buffer vinculante y expuestos a 1 μ g de PI en un volumen final de 400 μ l. FITC y PI fluorescences se determinaron mediante un flujo cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, FL, EE.UU.)

Microscopía electrónica

Células Jurkat y se cosecharon inmediatamente fijadas en el fosfato de búfer solución con glutaraldehido (pH 7.2) durante 2 horas y luego fija en el 1% de tetróxido de osmio tamponada durante 2 horas a 4 ° C. Después de la transformación a través de una serie de etanol clasificado y óxido de propileno, las células fueron embebidas en Epon. Un semi-delgada (1 μ m), la sección se cortadas y teñidas con azul de toluidina para el examen ultraestructural. Ultra-delgada (60-90 nm), las secciones también se preparan a partir de la Epon bloque anterior utilizando un ultramicrótomo (V-LKB, Suecia), teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo, y se examinaron con arreglo a un Hitachi H-7600 microscopio electrónico (Hitachi, Kyoto, Japón). Apoptosis detección se realiza tomando fotografías (× 1000), de todo el campo de cada uno de ultra-delgada seccionó muestra. El grado de apoptosis (apoptosis índice) se define como el número de células apoptóticas, expresada como porcentaje del total de células.

Preparación de los extractos y la citosólica de citocromo c immunoblotting

Citocromo c immunoblotting se realizó con una ligera modificación de un método descrito previamente [11]. Células Jurkat fueron recolectados por centrifugación a 200 g por 5 min a 4 ° C. Las células fueron lavadas dos veces con helado de PBS, pH 7,4, y se centrifuga a 200 g durante 5 min. El pellet de células obtenido fue resuspendido en 600 μ l de buffer de extracción, que contiene 20 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 10 mM KCl, 250 mM de sacarosa, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1,5 mM de MgCl 2, y 1 mM dithiothreitol 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro.

Después de una incubación de 30 min en hielo, las células fueron homogeneizada (20 golpes), en hilar 14000 g durante 15 min, sobrenadantes fueron separados de la fracción mitocondrial, y ambos fueron almacenadas a -70 ° C, hasta que se precise para la electroforesis en gel. El mitosol fracción se obtuvo mediante la adición de 0,1% SDS. Cincuenta μ g de proteína citosólica extractos y la mitosol extractos fueron cargados en los carriles de un 15% en gel de poliacrilamida-SDS, separados y borrado en una membrana de nitrocelulosa (Amersham, Piscataway, NJ, EE.UU.) a 150 mA noche a la mañana en la transferencia de buffer (20 mM Tris-base, 150 mM glicina, el 20% de metanol). No específicas fue bloqueada por incubando la membrana en el 5% de leche en TBS-T (Tris-salina tamponada y Tween-20, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de NaCl y 0,05% de Tween-20) Durante 3 horas a RT. La membrana se incubó en la lucha contra el citocromo c anticuerpo monoclonal (7H8.2Cl2) solución (1:2000 dilución, BD PharMingen, San Diego, CA, EE.UU.), que contiene 0,5% de leche en TBS-T. Después de la noche a la mañana de incubación con agitación a 4 ° C, la membrana se lavó tres veces con el 0,5% de leche en TBS-T. La secundaria de anticuerpos, una peroxidasa de rábano-junto de anticuerpos anti-ratón (Sigma, ST. Louis, MO, EE.UU.), se incubó en una 1:1000 dilución por 2 horas a RT. La membrana se lavó cuatro veces (5 min) con 5% de leche en TBS-T.

RMN (resonancia magnetica nuclear) espectroscopía

El péptido muestras utilizadas para experimentos de RMN contenía 1,5 mM péptido en el agua / 2, 2, 2-trifluoro-(d 3)-etanol (TFE) mezcla (50:50, v / v) a pH 7,2, que se preparó después de lyophilizing Muestras en una solución acuosa. Espectros RMN se registraron a 15 ° C en un Bruker DRX-500 equipada con un espectrómetro de resonancia sonda triple y una x, y, z-blindado gradiente de campo pulsado bobina. En dos dimensiones (2D) espectros RMN se registraron en la fase sensible al modo de utilizar el tiempo proporcional fase incrementation [12] para la detección de cuadratura en el t 1 dominio. Los experimentos 2D como TOCSY se realizó con un MLEV-17 spin-lock secuencia de pulso con un tiempo de mezcla de 69,7 ms y 2D-NOESY con la mezcla de tiempo de 300 ms. Disolvente represión durante TOCSY y NOESY experimentos se logró mediante una secuencia de pulsos WATERGATE [13] en combinación con un gradiente de campo pulsado pulso. Todos los espectros RMN de 2048 fueron adquiridas con el complejo de t 2 puntos de datos y 256 incrementos en la dimensión t 1, con 32 scans por incremento. Poco a poco el intercambio de protones amida fueron identificados por liofilización de una muestra totalmente protonada en el 50% de H 2 O / 50% TFE, el 50% en redissolution D 2 O / 50% TFE solución, y la adquisición inmediata de una serie de una dimensión y NOESY 2D-NOESY espectros. 3 J HN α constantes de acoplamiento se midió el espectro de la 1D. RMN datos fueron procesados en una Silicon Graphics Indigo de trabajo usando XWINNMR II (Bruker Instruments, Karlsruhe, Alemania) software. Proton cambios químicos se expresaron en relación con la resonancia de metilo sódico 2, 2-dimetil-2-silapentane-5-sulfónico (DSS), usado como patrón interno.

Análisis estadístico

Los datos son expresados como medias ± SEM. Utilizó un modelo lineal y la prueba t de Student se realizaron mediante el paquete estadístico para las Ciencias Sociales (SPSS) para Windows, versión 7.5 (SPSS, Corea). Se consideró significativo el resultado cuando fue p <0,05.

Resultados
Diseño y síntesis de péptidos

El amphipathic características de α-helicoidal péptidos antimicrobianos desempeña un papel importante en contra de las células diana. Además, una serie de parámetros, incluyendo una carga neta positiva, α-helicidad y, en general hidrofobicidad se ha demostrado que los antibióticos modular la actividad de la α-helicoidal amphipathic péptidos antimicrobianos. Investigaciones recientes utilizando amphipathic α-helicoidal modelo péptidos han puesto de manifiesto que la modulación de la hidrófilo-hidrofóbicas saldo de α-helicoidal péptidos antimicrobianos es un factor crucial en el diseño de péptidos con actividad potente antibiótico [14]. En un experimento preliminar, pero no hemos encontrado que ha Pep27 actividad anticancerígena. Por lo tanto, hemos diseñado Pep27 analógica péptidos y evaluados sus efectos contra el cáncer y quimiosensibilizadores. Con el fin de dilucidar la relación entre la hidratación y la hidrofílicos péptidos antibióticos de las regiones con respecto a la actividad de los antibióticos y la citotoxicidad, hemos diseñado y sintetizado algunas Pep27 análogos, sobre la base de la α-rueda helicoidal diagrama de Pep27. En particular, se aumentó Pep27 hidrofobicidad mediante la sustitución de triptófano. Las secuencias de aminoácidos utilizados en el presente estudio se resumen en la Tabla 1. Sintetizado péptidos fueron purificados por RP-HPLC y sus pesos moleculares fueron confirmados por MALDI-MS.

RP-HPLC menudo se ha utilizado experimentalmente para determinar la cuantitativos hidrofóbicas equilibrio hidrófilo-amphipathic de péptidos. Los péptidos están separados por RP-HPLC, de acuerdo a sus interacciones hidrofóbicas con C-18 de la fase estacionaria. Tales interacciones hidrofóbicas puede considerarse comparable a la interacción entre amphipathic péptidos antimicrobianos y los lípidos de membranas plasmáticas bilayer. Con el fin de investigar la posibilidad de una correlación entre el péptido hidrofobicidad y actividades biológicas en las células del cáncer, la hidratación características de los péptidos se investigaron mediante la comparación de sus tiempos de retención en RP-HPLC (Tabla 1]. Como era de esperar, todos los análogos de Pep27 eluyen Pep27 más tardar, y la analógica Pep27anal2 tenido el más largo tiempo de retención.

De las actividades contra el cáncer y sus análogos Pep27

Para evaluar las actividades contra el cáncer de la Pep27 análogos, diferentes concentraciones de estos péptidos se administraron a diversas líneas celulares de cáncer, y entonces se cytotoxicities determinado por MTT ensayo. En este estudio, hemos utilizado tanto anclaje dependen de los productos básicos y las líneas celulares de cáncer de independiente. Entre ellas AML-2 leucemia mieloide aguda línea celular, HL-60 de leucemia aguda promielocítica línea celular, un T Jurkat línea celular de células de leucemia, SNU-601 gástrica y cáncer de línea celular MCF-7 de cáncer de mama línea celular. Pep27 análogo de los péptidos mostró similares actividades contra el cáncer en cinco líneas celulares de cáncer de la prueba. De los análogos de la prueba, Pep27anal2 mostraron más actividad anticancerígena (Fig. 1]. La CI 50 y CI 90 valores de la Pep27anal2 en cinco líneas celulares de cáncer de la prueba fueron 10 - 28 μ M y 35 - 55 μ M, respectivamente (Fig. 1 y Tabla 2]. Desde la sustitución de (2 R → W) y (4 E → W) para formar Pep27anal1 mostraron una menor actividad de Pep27anal2, la sustitución adicional de (11 S → W) y (13 Q → W) en Pep27anal2 se consideraba importante De la actividad contra el cáncer. Por otra parte, los análogos de otros Pep27 sustituido con más de dos tryptophans en diferentes sitios no mostraron más actividad anticancerígena que Pep27anal2 en 5 líneas celulares de prueba. Además, de la Pep27 similares de producción, Pep27anal2 tuvo el mayor hidrofobicidad, sobre la base de su RP-HPLC el tiempo de retención (Tabla 1].

¿Cómo Pep27anal2 mostrar su efecto citotóxico en las células cancerosas?

Con el fin de determinar si procede o no Pep27anal2 pueden causar daño de membrana, una hemólisis RBC se realizó la prueba (Tabla 3]. De los análogos de Pep27, sólo Pep27anal 2 a 12,5 μ M durante 1 h a 37 ° C, hemolysed 18% de los eritrocitos que melitina en la misma concentración inducida por el 100% hemólisis, lo que sugiere que Pep27anal2 membrana puede causar daños como melitina. Dado que el mecanismo de Pep27anal 2 péptidos se cree que se trata de la perturbación de la membrana celular, microscopía confocal utiliza para determinar si Pep27anal2 puede entrar en las células y actuar como una membrana de la toxina. Células Jurkat fueron tratados con Pep27anal2-FITC en una concentración de 12,5 μ M de 30, 60 y 120 min. Después de la incubación las células fueron fijadas con formol 3,7% para los 30 minutos y luego observó bajo un microscopio confocal. La microscopía confocal mostraron células con forma de anillo, lo que sugiere que Pep27anal2-FITC es localizado en la membrana celular sin alterar su integridad y, a continuación, pasa de la membrana intracelularmente con el tiempo (Fig. 2]. Sin embargo, las células Jurkat tratadas con 12,5 μ M Pep27anal2 durante más de 60 min mostró retroceso, y la membrana celular blebbing, lo que sugiere la apoptosis, y que indica que Pep27anal2 puede entrar en las células por un mecanismo desconocido e inducir la apoptosis, mientras que el mantenimiento de la integridad de membrana, dentro de 2 horas de tratamiento.

Determinación de la apoptosis tras el tratamiento con Pep27anal2

Uno de los primeros eventos que ocurren durante la apoptosis es la externalización de fosfatidilserina, un fosfolípido que se limitan normalmente el prospecto interior de la membrana plasmática. Es importante destacar que esta precede a la membrana daños. Además, la externalización de fosfatidilserina puede supervisarse mediante annexin V, un fosfatidilserina específicos de la proteína de unión [15]. Otro importante evento secundario durante la apoptosis es la pérdida de integridad de la membrana plasmática. Intactas las membranas plasmáticas de excluir ciertos tintes, como PI, el más utilizado marcador de la integridad de membrana [16].

En el presente estudio, las células Jurkat fueron tratados con 100 μ M de etopósido, 12,5 μ M de melitina o 12,5 μ M o 63 μ M de Pep27anal2 para 4 hr. La apoptosis y la integridad de membrana luego se determina utilizando annexin V y yoduro de propidio, respectivamente, como se describe en "Materiales y métodos". En la Fig. 4. Las células vivas se limitan a la cuadrante inferior izquierdo. Células muertas aparecen primero en el cuadrante inferior derecho (apoptosis), en donde la muerte se debió a la externalización de PS (detectados con annexin V-FITC). El cuadrante superior derecho muestra la muerte de las células resultantes de la pérdida de integridad de la membrana celular (PI incorporación). Fig. 3 muestra que Pep27anal2 causado un mayor nivel de annexin V-FITC tinción con un poco de aumento de la tinción PI que etopósido, mientras que melitina aumento de la distribución de la tinción PI sin un aumento de annexin V-FITC tinción.

Un electrón examen microscópico reveló que Pep27anal2 indujo apoptosis en células Jurkat, ya que se caracteriza por la condensación del citoplasma, la célula de encogimiento, la pérdida de la membrana plasmática microvellosidades, condensada o núcleos fragmentados, y la formación de vesículas de membrana, como en etopósido (Fig. 4] . Las células tratadas con Pep27anal2 aumento de la apoptosis significativamente (P <0,05) en un momento de forma dependiente. Además, el 62,5 μ M Pep27anal2 la apoptosis inducida por más de 100 μ M de etopósido (Fig. 4].

Pep27anal2 no induce la liberación del citocromo c de la mitocondria al citosol de las células Jurkat

Citocromo c es un bien caracterizado proteína mitocondrial y participa en el metabolismo de la energía celular. El precursor del citocromo c, c apocytochrome, se sintetiza en el citoplasma. Tras la translocación a mitochoindria, el citocromo c es refolded y adquiere una fracción heme, que es necesario para la funcionalidad en la cadena de la respiración mitocondrial. El heme determinada forma de citocromo c se llama holocytochrome c, que puede activar las caspasas responsable de la apoptosis al interactuar con factores de activación de la proteasa cuando se libera en el citosol [17]. Jurkat células (5 × 10 5 / ml) fueron tratados con Pep27anal2 en una concentración de 12,5 μ M de 1 h, 2 h, y 4 h, y en 62,5 μ M durante 4 h. Tras estas incubaciones, el citocromo c de la fracción citosólica, obtenido por centrifugación 14000 g durante 15 min, y en el mitosol, obtenido mediante la adición de 0,1% SDS a la fracción mitocondrial, fue determinada por Western Blot. Pep27anal2 a 62,5 μ M no inducir la liberación del citocromo c de la mitocondria en el citosol dentro de las 4 horas (Fig. 5].

Solución de ambas estructuras Pep27 y Pep27anal2

Completar las tareas de protones por resonancia para Pep27 y Pep27anal2 se obtuvieron utilizando el modelo secuencial de resonancia procedimiento de asignación. Una vez que cada uno de los sistemas de spin había sido clasificado, columna vertebral secuencial de las cesiones de resonancia se terminaron de d α N (i, i +1) NOE conectividades en la 2D-NOESY espectros. Figura 6 resume la secuencia de corto alcance y conectividades NOE observado para Pep27 y Pep27anal2 en TFE / H 2 O (1v/1v). Las observaciones de continuo d NN (i, i +1) contactos, junto con la característica d α N (i, i +3) y d αβ (i, i +3) NOEs apoyamos firmemente la existencia de α-hélices (Fig. 6]. El coeficiente de temperatura de protones amida también apoya la hipótesis de que intramolecular de hidrógeno bonos estabilizar las estructuras de la Pep27 y Pep27anal2 hélices. Este resultado es aún más el apoyo de la base de datos de intercambio de protones amida de ambos péptidos [18], y el pequeño 3 J HN α constantes de acoplamiento Pep27anal2 (Pep27 de que no se puede medir). La RMN estructuras de Pep27 y Pep27anal2 se basó en la experimentación restricciones derivadas de los espectros 2D-NOESY. Un total de 50 distancia geométrica de la geometría de las estructuras sirvió como estructuras a partir de la dinámica de recocido simulado cálculos de los péptidos en TFE / H 2 O solución. Los 20 más bajo de energía estructuras (<SA> k), de 50 recocido simulado estructuras fueron seleccionados para el análisis estructural detallado. Un ajuste óptimo superposición de 20 k <SA> estructuras y al ahorro de energía, reducir al mínimo la estructura media ( ) Se muestra en la Fig. 7. La principal característica estructural de secundaria de Pep27 es una α-hélice que abarca los residuos, His6-Leu15 en TFE / H 2 O (1v/1v), que tiene un Pep27anal2 más estable α-hélice que abarcan Trp 4-Leu15 (Fig. 7] .

Discusión

En este estudio, se determinó la actividad contra el cáncer de Pep27 análogos. Aunque Pep27 no mostró actividad contra el cáncer en concentraciones superiores a 70 μ M, sus análogos se debe a diversos cytotoxicities en una serie de líneas de células de cáncer. De los cinco Pep27 péptidos sintetizados analógicos, tanto Pep27anal2 mostró mayor hidrofobicidad y la actividad contra el cáncer. Nuestros resultados sugieren que las sustituciones de (2 R → W), (4 E → W), (11 S → W), y (13 Q → W) en Pep27 anal2 desempeña un papel importante en su hidrofobicidad y / o actividad anticancerígena. En particular, las dos últimas sustituciones hidrofobicidad o contribuir a la actividad anticancerígena Pep27anal2, en virtud de la menor actividad anticancerígena de Pep27anal1, que contiene (2 R → W) y (4 E → W) sustituciones. Además, con las sustituciones de aminoácidos más hidrofóbico triptófano no siempre se refleja en un mayor hidrofobicidad o una mayor actividad contra el cáncer. Pep27anal2 había una mayor hidrofobicidad que otros análogos, según lo evaluado por RP-HPLC. Un hecho positivo se observó correlación lineal entre la columna y la hidrofobicidad apoprotein tiempo de retención obtenidos por RP-HPLC [19]. Por lo tanto, podría estar implicado que la hidrofobicidad de péptidos, más que el número de aminoácidos hidrofóbico, pueden desempeñar un papel importante en la actividad anticancerígena o el transporte de membrana. Desde péptidos no puede fácilmente entrar en las células, la sustitución de aminoácidos no interferir con la actividad o conjugación con otros péptidos para facilitar la entrada de células péptido ha sido juzgado. Algunos péptidos cortos, que son capaces de atravesar las membranas celulares, y que tiene un nivel bajo de actividad líticas, pueden ser útiles como portadores (vectores) de las moléculas hidrofílicas. Cell penetrante incluyen péptidos pAntp ( 'penetratin'), transportan, MAP (KLAL), Tat (48-60) y VP22. PAntp es una de 60 aminoácidos del polipéptido con una secuencia que se corresponde con la Drosophila antennapedia homeobox gene [20]. Transportan es un péptido de 27 aminoácidos que contiene 12 aminoácidos funcional de la terminal amino del neuropéptido galanin mastoparán y en el carboxilo terminal, que están conectadas por una lisina [21]. MAPA (KLAL péptido) es la base de un modelo amphipathic péptido, KLALKLALKALKAAKLA-NH2 [22]. TAT en proteínas de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1), es capaz de entregar las proteínas biológicamente activas en vivo, y es de gran interés para la proteína terapéutica [23]. Recientemente, la transcripción del VIH-1 (Tat) de proteínas de transducción de dominio (RKKRRQRRR) se ha conjugado en diversos tipos de aminoácidos o proteínas [24 - 26]. De la célula que penetra en péptidos, MAP (KLAL) se encontró que la absorción más rápida, seguida de la transportan, Tat (48-60) y, por último, penetratin [27]. El virus del herpes simple tipo 1 envoltura de proteína VP22 Recientemente se ha demostrado que mediar en el transporte intercelular de proteínas, lo que plantea la posibilidad de que pueda ser útil en un entorno en el mundial de la entrega de proteínas terapéuticas se desea [28, 29].

En el presente estudio, la microscopía confocal mostraron que Pep27anal2 no actúa como una membrana de la toxina como melitina, sino que penetra en las células por un mecanismo desconocido, e induce la apoptosis de células caracterizadas por encogimiento y membrana blebbing. Citometría de flujo se realizó para determinar si Pep27anal2 induce la apoptosis y la membrana de los daños. Annexin V vinculante con la superficie de la célula fue utilizada como indicativo de la apoptosis, en conjunción con un tinte de exclusión de prueba para establecer la integridad de la membrana celular. Annexin V es un Ca 2 + dependientes de fosfolípidos de la proteína de unión con alta afinidad por fosfatidilserina. Sin embargo, la translocación de fosfatidilserina a la superficie celular externa no es exclusivo de la apoptosis, y también se produce durante la necrosis. La diferencia entre estas dos formas de muerte celular es que durante las etapas iniciales de la apoptosis la membrana celular permanece intacta, mientras que en el preciso momento en que se produce la necrosis de la membrana celular pierde su integridad, convirtiéndose en fugas [16]. Pep27anal2 aumento de la annexin V-FITC en la tinción de las células Jurkat, mientras que melitina en la misma concentración de gran aumento de la distribución de yoduro de propidio tinción. Sin embargo, las concentraciones mucho más altas (62,5 μ M), de distribución de Pep27anal2 más annexin V-FITC tinción, mientras que la tinción de yoduro de propidio sólo aumentó ligeramente. Cell-penetrante péptidos en general tienen la capacidad de ganancia de entrada en una celda de energía que dependen de manera [26]. En el presente estudio, la apoptosis inducida por Pep27anal2 no fue influenciado por la pretreating con la ATP depleter azida sódica (datos no presentados), lo que sugiere una energía independiente de transporte y / o la apoptosis mediada por Pep27anal2. Además, la microscopía electrónica reveló que Pep27anal2 inducida por la características morfológicas de la apoptosis en células Jurkat, y mostró condensación citoplásmica, encogimiento de células, la pérdida de la membrana plasmática microvellosidades, condensada o núcleos fragmentados, y la formación de vesículas de membrana. Los más altos índices de apoptosis se observaron para Pep27anal2, y esto fue estadísticamente significativo. La apoptosis en las células in vivo mostraron aumento de la liberación del citocromo c al citosol, lo que sugiere que las mitocondrias pueden intervenir por la liberación de citocromo c [30]. Cuando citocromo c es liberado en el citosol, que se activa caspasas responsable de la apoptosis al interactuar con factores de activación de la proteasa [15]. En el citosol, el citocromo c se une a Apaf-1, que provoca la activación de caspasa-9. Caspasa-9 se cree para propagar la señal de la muerte por disparo otros seis caspasas (caspasas-2, -3, -6, -7, -8 y -10), pero no caspasas-1, -4 y -5 [31 ]. Sin embargo, Pep27anal2 no parece inducir la liberación del citocromo c de las mitocondrias dentro de las 4 h, lo que sugiere que se induce la apoptosis por un citocromo c-mecanismo independiente. Además, la actividad anticancerígena de Pep27anal2 no fue derogado por el pan-inhibidor de caspasas Z-VAD-fmk (datos no presentados), lo que indica que Pep27anal2 la apoptosis inducida por el producto a través de una vía caspasa-independiente. Al igual que Pep27anal2, no se ha informado acerca de la apoptosis inducida en un caspasa-independiente de la moda sin la liberación del citocromo c [32, 33].

Sobre la base de la solución dilucidado estructuras, Pep27 tiene una corta bobina-hélice-bobina integrada de los residuos 6-16. Sin embargo, la Pep27anal2 analógica caracteriza por sustituciones en 2 R → W, 4 E → W, 11 W → S y 13 Q → W se encontró a tener un poco más de tiempo más estable que Pep27 conformación helicoidal. Nuestra actividad biológica datos también mostraron que Pep27anal2 es más potente que Pep27. Esto puede haber sido debido a un aumento de la interacción hidrofóbica por Pep27anal2. Por lo tanto, sugerimos que la estabilidad helicoidal, tiene un papel importante en la actividad biológica de Pep27. En conjunto, nuestros resultados indican que el aumento de la hidrofobicidad de las ayudas Pep27anal2 su penetración de la membrana. Esto es seguido por la inducción de apoptosis, pero que no implique la liberación del citocromo c de la mitocondria. La hidrofobicidad de Pep27anal2 parece desempeñar un papel importante en su capacidad de penetrar en la membrana plasmática y / o en su actividad contra el cáncer. Por lo tanto, creemos que Pep27anal2 es un posible candidato para el diseño de péptidos contra el cáncer.

Abreviaturas

RP, inversión de fase; MALDI, matriz de desorción asistida por láser de ionización; PI, yoduro de propidio; DSS, sodio 2, 2-dimetil-2-silapentane-5-sulfónico; MTT, 3 - (4,5-dimethylthiazol-2 - Il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro; TFE, 2, 2, 2-trifluoro-(d 3)-etanol; PBS, de búfer fosfato salino; TBS, Tris-salina tamponada; SDS, de sulfato de sodio dodesyl

Agradecimientos

Esta labor fue apoyada, en parte, por las subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología, Corea y la de Ciencias e Ingeniería de Corea a través de la Fundación Centro de Investigación de Materiales Proteineous Fenómenos de la vida y función Grupo de Investigación en el programa (01-J-01-LF - B-09), así como el Centro de Investigación de Células Resistente (R13-2003-009), y de la LNR programa de MOST NRDP (M1-0203-00-0020) (WL). Los autores desean agradecer a Su-Hombre Sr Jung por su asistencia técnica de expertos durante el examen microscópico de electrones.