Un papel para la familia Tec CTI quinasa en la regulación de SEB inducida por la producción de interleucina-2 en vivo a través de c-jun fosforilación

Superantígenos (SAG) son toxinas microbianas de origen bacteriana y viral, con la capacidad de activar el 5-20% de la población de células T, provocando la activación de células T, liberación de citoquinas y shock sistémico [1, 2]. La mayoría SAG compartir simultáneamente la capacidad de obligar a la clase II complejo principal de histocompatibilidad y moléculas de la región variable de los receptores de células T β-cadena, sin necesidad de ser procesados por células presentadoras de antígenos [1, 2]. Así SEB pueden interactuar directamente con las moléculas MHC de clase II en vehículos blindados y activar las células T con el buen TcR V β cadenas. El resultado de esta interacción es a gran escala de toda la estimulación de células T que expresa el buen TCR V β cadena. Un número de estudios han demostrado que los ratones cuando se les desafía con un SAG como la Infección por Enterotoxin B (SEB), la toxicidad masiva de los resultados de la inducción de citoquinas derivadas de T-helper de tipo-1 (T _H 1) el tipo de células, como la IL - 2, IFN-γ, TNF-α y TNF-β [1, 3]. Esta producción de citoquinas es acompañada por la expansión del número de células T reactivas SEB, seguida de la muerte celular y la inducción de la funcional "anergia" [4 - 6].

In order for a T cell to be activated antigen presenting cells (APC) must present antigen, either an antigenic peptide or SAG. In vitro , this interaction with the TcR has been shown to lead to the activation of a number of tyrosine kinases, including La Lck quinasa Src familia, la familia Syk quinasa Zap-70 y la familia Tec quinasa CTI (para revisión ver [7 - 10]]. Esto resulta en la activación de una serie de vías de señalización incluidos los miembros de la familia de las quinasas MAPK, ERK, JNK y p38, seguido por el factor de activación de la transcripción [10]. In vivo, la activación de estas células T conducir a la inducción de la secreción de citoquinas dentro de las horas de exposición SEB [1, 3].

CTI se expresa principalmente en las células T, células NK y las células [11 - 13]. En las células T, es rápidamente activada siguientes TcR crosslinking in vitro [14, 15]. Los ratones que carecen de CTI exposición reducida proliferación y la producción de IL-2 in vitro, y la reducción de la diferenciación de células T in vitro e in vivo, con T _H 2 diferenciación celular preferentemente afectados [15 - 19]. Observó la reducción de la proliferación de las células T CTI null in vitro es dependiente de la IL-2, ya que podría ser rescatado por la adición de IL-2 exógena [20]. Sin embargo, estos animales no son totalmente inmunocomprometidos, con residual de las respuestas contra la LCM, los virus Vaccinia y VS [21]. Hemos probado si CTI nula ratones son susceptibles a SEB inducida por la secreción de IL-2. Mostramos aquí que los ratones que carecen de CTI han reducido mucho la producción de IL-2 y la expansión de células T en respuesta a SEB in vitro e in vivo. También muestran que SEB inducida por la activación de la vía MAPK JNK en células T en respuesta in vivo, y que CTI nula células T eran defectuosas en la activación de esta vía en vivo. Sin embargo, la toxicidad de análisis indicó que tanto el TE y CTI nula animales fueron igualmente afectados por la exposición SEB. Nuestros datos sugieren que se requiere para CTI completo la secreción de IL-2 después de la exposición SEB, y que esto puede ser debido a la regulación de la vía de JNK por CTI in vivo. Sin embargo, la reducción de las señales de las células T no conduce necesariamente a una mejor respuesta fisiológica a la exposición SEB.

Ha sido informado de que las células T de ratones que carecen de CTI exposición muy reducida proliferación en respuesta a los anti-CD3 o TcR anticuerpos in vitro [15, 16, 18]. Por el contrario, estas células T no tiene ningún defecto y, de hecho, tuvieron mayor respuesta proliferativa siguientes anti-CD28/PMA estimulación [20]. Estos datos no ofrecen respuestas claras en cuanto a si CTI presentará un buen objetivo para la inhibición de la SEB inducida por la activación de células T in vivo, y, en particular, en la respuesta de citoquinas observó siguientes SAG exposición. Por lo tanto, primero si CTI nulas las células T pueden responder a estimulación SEB por la proliferación in vitro. Agrupados esplenocitos y células de los ganglios linfáticos WT CTI o nula animales fueron cultivados in vitro en presencia de diversas concentraciones de SEB (5 μ g / ml, 0,5 μ g / ml, 0,05 μ g / ml, 0,005 μ g / ml, y 0,0005 μ g / ml ), Y la proliferación analizados durante un período de 5 días. Se encontró que el WT respondido normalmente por las células proliferantes entre los días 2 y 3, con un máximo de proliferación observado en el día 5 y el 5 μ g / ml dosis de SEB (Fig. 1a]. Análisis de la dosis y la respuesta a los 5 días se indica que el WT células respondió en una manera dependiente de la dosis (Fig. 1b]. Por el contrario, las células de ratones CTI mostró muy poca respuesta, independientemente de la dosis de SEB utilizados para la estimulación (Fig. 1a, b]. Estamos próximos determinado si los mismos resultados se obtuvieron en la población purificada de células T de estos ratones. Células T fueron purificados de MT y CTI nula ratones, y estimulado con diferentes dosis de SEB, en la presencia de vehículos blindados. El análisis de los datos durante los 5 días que se indica en la presencia de la mayor concentración de SEB a prueba (10 μ g / ml), WT células T respondido más enérgicamente que CTI nulas las células T (véase la Fig. 1c]. De hecho, en todas las dosis probadas, nuestro análisis indica que las células T nulas CTI respondió WT menos de las células T en el día 3, 4 y 5 (Fig. 1d-f], mientras que la proliferación era equivalente al PMA y Ionomycin se utilizó para eludir TcR Señales (datos no presentados). Estos datos indican que las células T nulas CTI han reducido significativamente las respuestas a SEB proliferativa in vitro.

La interleucina-2 es una de las citocinas inducidas por la exposición a SEB [22]. CTI se ha demostrado que la regulación de la secreción de IL-2 in vitro de las células T estimuladas anti-CD3/TcR o anticuerpos en respuesta a péptidos de antígenos [15, 18, 23, 24]. Por lo tanto, determina los niveles de IL-2 en sobrenadantes de las células de manera similar estimulado con SEB in vitro (Fig. 2]. Si bien las células T WT respondió a SEB por la secreción de IL-2 dentro de las 24 hrs. De la estimulación en una forma dependiente de dosis (ver Fig. 2 bis de 5 μ g / ml, la dosis), a partir del 0,5 μ g / ml SEB concentración (Fig. 2bi], CTI nula células T hizo muy poco IL-2, y la pequeña cantidad De la IL-2 que se hizo fue sólo a la mayor concentración de SEB a prueba (5 μ g / ml). CTI nula células T constantemente secretado menos IL-2 durante el período de 5 días de duración y rango de dosis (Fig. 2b]. Los datos indican que, como ya se ha informado de TcR o la estimulación antigénica, CTI regula la producción de IL-2 in vitro, en respuesta a la estimulación SEB [15, 18, 23, 24].

Si bien estos datos indican que CTI regula la proliferación de las células T en respuesta a SEB in vitro, es posible que en el contexto de la presentación antigénica y óptima co-estimulantes señales en vivo, CTI nula células T pueden presentar una mejor respuesta. La exposición de los animales a SEB resultados en una expansión de las células T reactivas SEB población con un nivel máximo de alrededor de 2 días post exposición [2, 4]. Con el fin de determinar si la respuesta proliferativa visto reducido con el CTI null in vitro de las células T también fue visto en vivo, estamos expuestos WT y CTI nula animales a SEB y determinó los porcentajes de β8 V V β6 y positiva células CD4 ⁺ en la población por el flujo Citometría después de 2, 4 y 5 días como medida de la expansión de células T. Teniendo células T V β8 TcR cadenas son sensibles a la estimulación SEB mientras que los que soportan V β6 TcR cadenas no son, por lo que analizan estas dos poblaciones de células T. Como se informó anteriormente, en WT animales, que observó un aumento de aproximadamente 4 veces en V β8 células CD4 ⁺ T en el bazo y los ganglios linfáticos siguientes SEB exposición (en comparación con la exposición a PBS, fig 3a, b], mientras que V β6 de células CD4 ⁺ T poblaciones Fueron en gran parte sin cambios (datos no presentados). En cambio, no fue estadística y significativamente menor expansión de CTI null V ⁺ β8 células T CD4 ⁺ SEB después de la exposición, aunque estas células todavía ampliado (Fig. 3a, b] Como se informó anteriormente, los porcentajes de las células T V teniendo β6 no cambian a lo largo del presente Período, ya sea en el CTI WT o nula ratones (datos no presentados y [4]]. Así, la ausencia de CTI resultados en la reducción de la expansión de células T in vivo en respuesta a SEB.

Las células T de ratones CTI nula proliferan menos in vitro e in vivo, y mucho menos secretan IL-2 in vitro, en respuesta a SEB. Por lo tanto, si se determina que también secretan menos IL-2 tras la estimulación in vivo SEB. Grupos de ratones fueron expuestos a SEB iv tiempo y en diversos puntos de su suero se tomó y analizó el contenido de la producción de IL-2. Se encontró que en comparación con la in vitro la producción de IL-2, cuando WT ratones fueron expuestos a SEB in vivo que producen IL-2 dentro de 1 hr., Que alcanzaron un máximo de alrededor de 2 hrs. (Fig. 4]. Además, de conformidad con la estimulación in vitro, CTI ratones deficientes significativamente menos secretan IL-2 en respuesta a SEB in vivo (Fig. 4]. Sobre la base de estos datos se concluye que in vivo la producción de IL-2 se produce antes de lo observado in vitro, y que las células T CTI nula seguir exposición defectos en la producción de IL-2 en respuesta a SEB in vivo, incluso en la existencia de suficientes estimuladoras Las señales en vivo.

La vía MAPK JNK ha demostrado ser esencial para la producción de IL-2 tras la estimulación de las células T por el TcR y CD28 in vitro [25 - 28]. Esta vía conduce a la fosforilación de c-jun y la activación de un AP-1 factor de transcripción complejo que se requiere para la transcripción de IL-2 [28]. Si bien la activación de la vía de JNK conduce a la fosforilación y la activación de c-jun se ha demostrado en las células T después de TcR y CD28 crosslinking in vitro, así como la estimulación por péptido antígeno in vivo, no está claro si el SAG SEB se activa esta vía In vivo [29, 30]. Por lo tanto, si la prueba SEB podría inducir la fosforilación de c-jun en WT células T estimuladas con SEB in vivo. Para ello, hemos adaptado un método inicialmente utilizado por Jenkins y sus colegas para analizar la fosforilación de c-jun in vivo después de la exposición del antígeno. En este protocolo, los ratones fueron expuestos a la SEB, a continuación, las células de los ganglios linfáticos, el bazo y la sangre rápidamente aislados y fijos, y los anticuerpos específicos para fosforilados c-jun utilizada en el análisis de su fosforilación. Además, las células se tiñeron con anticuerpos específicos para β8 V o V β6 para detectar SEB sensible y no sensible células T, respectivamente. Citometría de flujo es empleada para detectar fosforilación de c-jun [30]. Figura 5 demuestra que 1 hr. Intravenosa después de la exposición a la SEB, V ⁺ β8 SEB reactiva las células T en el bazo y los ganglios linfáticos contienen niveles más altos de fosforilados c-jun (cf. Figs. 5a, b iii & iv]. Resultados similares se encontraron en los animales expuestos a SEB ip (datos no presentados). Por el contrario, las células T no reactivas a SEB en la misma los animales, los que lleven β6 V ⁺ TcRs, no tuvieron ningún aumento de fosforilados c-jun (cf. Figs. 5a, b, i y ii]. Esto demuestra que en el mismo animal, sólo las células T que interactúan con y puede ser activado por SEB responder por fosforilación de c-jun, al mismo tiempo, las células T que no son reactivas no son activados, lo que demuestra la especificidad. Del mismo modo, los animales inyectados con PBS no mostró ese cambio en fosforilados c-jun en la SEB ya sea reactiva o no reactiva las poblaciones de células T, lo que indica que este es un evento mediado SEB (Fig. 5a-b]. Otros controles incluidos los reactivos de secundaria solos demuestran la especificidad de la tinción de anticuerpos (datos no presentados).

Estamos próximos determinar si las células T que carecen de CTI podría inducir fosforilación de c-jun en respuesta a la activación SEB in vivo. CTI nula ratones fueron expuestos a la SEB como se ha descrito anteriormente, y la fosforilación de c-jun en determinado V ⁺ β8 población de células T (SEB reactiva) o V ⁺ β6 población de células T (no reactiva) en el mismo animal. Estos experimentos muestran que en la ausencia de CTI, SEB no conduce a la fosforilación de c-jun en cualquiera de la población de células T (Fig. 6a-d]. Así, la ausencia de resultados de CTI en la falta de SEB fosforilación de c-jun, lo que podría afectar a la capacidad de estas células T para producir IL-2. Para determinar si esta falta de c-jun en la fosforilación CTI nulas las células T en respuesta a SEB nonresponsiveness mundial se refleja en estas células, a fin de determinar si estas células son activadas por SEB en efecto, la exposición. Para ello, midieron aumentos en la expresión CD69, una proteína de la superficie celular que es rápidamente expresadas por las células T activadas en una Ras / MAPK forma dependiente [31 - 33]. Similares experimentos se realizaron en el examen de los c-jun fosforilación, excepto que utiliza anticuerpos específicos contra CD69 para determinar si las células reactivas SEB se había activado. Figura 7 demuestra que V ⁺ β8 células T CD4 ^+, pero no β6 V ⁺ células T CD4 ⁺ de ambas WT y CTI nula ratones expuestos aumento de la expresión CD69 SEB 2 horas siguientes a la exposición, lo que indica que en ambos casos, las células T fueron la respuesta a la activación SEB (Fig. 7]. Sin embargo, SEB inducida expresión CD69 en un mayor porcentaje de CD4 ⁺ V ⁺ β8 SEB responder las células T en ratones WT que en ratones nulos CTI (73,5 + / - 12% en WT vs 43.6 + / - 0,5% en CTI null). Sin embargo, no hubo diferencia en la expresión CD69 IFM de las células T en respuesta WT CTI nula respuesta frente a las células T (362,5 _ + / - 6,3 en WT vs 375 + / - 11,3 en CTI null). Además, no hubo diferencias en la expresión de CD25 en WT o nula CTI células T (datos no presentados). Así, la falta de SEB inducida por c-jun en la fosforilación CTI nula células T parece reflejar el papel específico de CTI en la regulación de este evento en respuesta a la exposición SEB in vivo.

La exposición de ratones a SEB y LPS resultados en la toxicidad que culminó con la muerte [1]. Por eso, hemos analizado el efecto de la exposición a la SEB / LPS en ratones CTI nula. Sin embargo, en contraste con los resultados de la secreción de IL-2 y la expansión de células T, los dos animales fueron afectados de manera similar (Tabla 1]. Así, la misma proporción de enfermos se convirtió en ratones tras la exposición a SEB y LPS, lo cual sugiere que a pesar de la ausencia de CTI afecta a la secreción de IL-2 SEB después de la exposición, su ausencia no afecta a la capacidad de SEB para inducir la enfermedad en estos ratones.

Está demostrado que la exposición a SEB resultados en gran escala la producción de citoquinas, que en parte es responsable de los síntomas de la exposición a esta toxina [1, 2, 35]. Células T han demostrado ser en gran medida responsable de esta excesiva producción de citoquinas [35, 36]. Actualidad farmacológicamente sugerencias para bloquear los síntomas de la exposición incluyen SEB células T inhibidores de la transducción de señales, como Perfenidone CsA y, sin embargo, estos agentes tienen efectos secundarios significativos [37, 38]. Aquí presentamos un objetivo prometedor para la inhibición de la producción de IL-2 inducida por la exposición SEB, la tirosina quinasa CTI. Nos muestran que los ratones que carecen de CTI han reducido de manera significativa la expansión de células T y la secreción de IL-2 tras la exposición a SEB in vivo. Además, muestran que la SEB inducida por vía de señalización que conduzca a c-jun fosforilación, la indicación de la vía de activación de JNK, se reduce significativamente en CTI nulas las células T, las células T, aunque estos podrían responder a la activación por SEB upregulating CD69, y no hay Diferencia en la toxicidad global de SEB / LPS en estos ratones en comparación con ratones WT.

Anteriores trabajos realizados in vitro sugieren que CTI es necesaria para la activación mediada por anticuerpos anti-TcR/CD3 del factor de transcripción NFAT, a través de la regulación de la afluencia de calcio en las células T estimuladas TcR [19, 39]. CTI nula exposición de las células T también redujo AP-1 DNA vinculante cuando estimulado la actividad in vitro con anticuerpos anti-CD3 [19]. También se ha demostrado que la activación de JNK se encuentra en la parte de abajo CTI siguientes TcR crosslinking in vitro [23]. Sin embargo, estos experimentos se realizaron in vitro y no está claro que los efectos observados in vitro refleje lo que ocurre in vivo, ya que otras interacciones célula-célula pueden dar cabida a la activación de las vías que no están usando visto in vitro con activación de los anticuerpos. Nuestros datos no obstante, sugieren que de hecho, el CTI se encuentra aguas abajo de la TcR y es necesario para la secreción de IL-2 y c-jun fosforilación in vivo. Corroborar un papel de activación de c-jun en la producción de IL-2, los ratones con una dominante negativa c-jun han reducido mucho la secreción de IL-2 in vitro [28] (ratones que carecen de c-jun mueren durante la embriogénesis [40]]. Del mismo modo, JNK ha sido implicado en la secreción de IL-2 por las células T in vitro [25 - 27]. Nuestros datos prestar su apoyo a esta idea de que la JNK-c-jun vía está involucrada en la producción de IL-2 por las células T in vivo.

Curiosamente, el immunosuppresant CsA ha demostrado inhibir los efectos de la exposición SEB en ratones antes de ser entregado a SEB exposición [36], sin embargo, no inhibe SEB efectos inducidos en el mono al ser entregada al mismo tiempo que SEB [38]. Los efectos de la CsA sobre los síntomas inducidos por SEB ha sugerido que se debe a sus efectos sobre la inhibición de la IL-2 y otras citoquinas producción debido a la inhibición de la activación del factor de transcripción NFAT [36, 41], sin embargo, la CsA también inhibe la activación de la JNK siguientes TcR/CD3 vía CD28 y estimulación [29, 30], a fin de CsA y pretratamiento puede actuar para prevenir la activación de células T temprana de estas vías, por lo tanto, el bloqueo de la producción de citoquinas y la protección de los ratones de los efectos de la exposición posterior SEB.

Los ratones que carecen de CTI exposición reducido las respuestas de células T in vitro, sino que también han reducido los porcentajes de los linfocitos T CD4 ⁺ (alrededor de 60-70% de WT, [16]]. Si bien esto era de esperar a la reducción global de la respuesta de células T in vivo SEB a la exposición, si estas células son capaces de responder a SEB, podríamos esperar una reducción equivalente de la cantidad de IL-2 in vivo secretada en respuesta a SEB. Nosotros también esperamos ver una reducción equivalente de la proliferación in vitro. Sin embargo, in vivo, se observó muy reducida la secreción de IL-2, y la reducción de la expansión de V ⁺ β8 células T CD4 ^+, aunque esto no fue tan dramática como la reducción en la secreción de IL-2. De hecho, se ha observado que SEB expansión de células T inducida por la IL-2 en ratones nulos, lo que indica que la IL-2 no es necesario para la expansión de las células T in vivo después de la exposición SEB. Sin embargo, incluso con la reducción de las respuestas de células T observado en los ratones nulos CTI, que todavía sufren de SEB / LPS indujo toxicidad similar a la observada en los ratones WT. Cabe señalar sin embargo, que C57BL / 6 ratones son mucho menos sensibles a SEB inducir letal shock que Balb / c ratones [34]. Así se observó muy pocas muertes en nuestros experimentos, y CTI pueden proteger a ratones Balb / c mice real de la muerte. En estos momentos de cruce de estos ratones a los ratones Balb / c de antecedentes para determinar si este es el caso.

En conclusión, hemos CTI muestran que se requiere para la producción de IL-2 inducida por SEB in vivo e in vitro. También hemos demostrado que CTI podrá regular las señales principales de producción de IL-2, en parte, mediante la regulación de la fosforilación de c-jun. Sin embargo, los ratones que carecen de CTI exhiben respuestas similares a la toxicidad SEB. Los datos sugieren que la incapacidad de las células T que carecen de CTI para producir IL-2 no se pueden superar por la estimulación SAG, y que perturban la activación de células T vías conducen a la producción de IL-2 no conduce necesariamente a una mejor atención a la toxicidad SEB.

Ratones de tipo salvaje y CTI-ratones deficientes (C57BL / 6 de antecedentes, [16]] entre 8 y 10 semanas fueron utilizadas en todos los experimentos. RAG1 ^{- / -} ratones fueron una especie de regalo del doctor Eric Harvill (Penn State University) y se utiliza de manera similar entre los 6-10 semanas de edad. El Animal Care Institucional y el empleo El Comité de la Universidad Estatal de Pennsylvania aprobó todos los experimentos.

WT y CTI deficiente animales fueron inoculados por vía intraperitoneal (ip) con 50 μ g SEB en PBS (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), y después de 2 días, fueron sacrificados y esplenocitos teñidas con anticuerpos específicos para β8 V (SEB reactiva las células T) o Β6 V (no reactiva las células T) y CD4 directamente conjugado con FITC y PE, respectivamente (BDPharmingen, San Diego, CA). Por otra parte, los ratones fueron inyectados ip con 50 μ g SEB-desangrado y ojo cada 2 días para 5 días. Tras la lisis de los glóbulos rojos, el resto de las células se tiñeron como se describe más arriba para el esplenocitos. Linfocitos fueron identificados por citometría de flujo y con interés por sus características de dispersión lado.

Se utilizó un protocolo informado por Zell et al para determinar el estado de fosforilación de c-jun, como medida de la activación de JNK-c-jun en vía de las células T en respuesta SEB. WT y CTI deficiente animales fueron inoculados ip o por vía intravenosa (iv) con 50 μ g SEB y permitió sobrevivir por un 1 hr. Resultados similares se encontraron con ambas vías de administración. Los animales fueron sacrificados y el bazo, los ganglios linfáticos y la sangre rápidamente aislados, y dounced en 2% paraformaldehido a arreglar rápidamente las células que se describió anteriormente [30]. Las células se tiñeron con anticuerpos frente a la V β8 V β6 directamente o conjugado con PE (BDPharmingen, San Diego, CA), entonces permeabilized con saponina. Las células fueron teñidas con intracelular fosforilados-c-jun con un anticuerpo monoclonal contra fosforilados c-jun (IgG _1, Señalización Celular, Beverly, MA), seguido de biotina conejo anti-ratón IgG ₁ y streptavidina conjugado con FITC. Los controles incluyen reactivos secundaria solo. Upregulation de CD69 por SEB in vivo se realizó con enfoques similares, excepto que las células T no se fija o permeabilized antes de la tinción con PE-conjugadas anti-CD69 anticuerpo monoclonal (BDPharmingen, San Diego, CA). Esto fue seguido de análisis por citometría de flujo, con posterior análisis realizado mediante el WinMDI programa 2.8 (El Scripps Research Institute, La Jolla, CA).

Los ganglios linfáticos y el bazo fueron aisladas de MT y CTI ratones deficientes y mancomunados. Los glóbulos rojos son eliminadas mediante ACK lisis de amortiguación, y las células resuspendido en RPMI completo. Las células fueron luego a la izquierda o no estimulados con diferentes concentraciones de SEB (5 μ g / ml, 0,5 μ g / ml, 0,05 μ g / ml, 0,005 μ g / ml, y 0,0005 μ g / ml) con una concentración de 2 × 10 ⁶ células / ml . Estas células fueron incubadas a 37 ° C durante 5 días y pulsado una vez al día durante 5 días con 0,5 μ Ci tritio, la timidina por así durante 12 hrs. Antes de la cosecha. Células T fueron purificados de MT y CTI nula MiniMACS ratones utilizando columnas de separación (Miltenyi Biotec Inc, Auburn, CA), y chapada a 2 × 10 ⁶ células / ml y estimulado como anteriormente, en presencia de esplenocitos de ratones RAG nula pre - Tratadas con mitomicina C. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Mezclas de linfocitos y WT esplenocitos de ratones deficientes y CTI fueron incubadas con diferentes concentraciones de SEB (5 μ g / ml, 0,5 μ g / ml, 0,05 μ g / ml, 0,005 μ g / ml, y 0,0005 μ g / ml) durante 5 días, tal como se describe más arriba De la proliferación in vitro. Sobrenadantes se muestra una vez al día durante este período y para un análisis de la IL-2 utilizando pruebas ELISA de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (BDPharmingen, San Diego, CA).

WT y CTI deficiente animales fueron inoculados con 50 μ g iv SEB, y suero aislado de la sangre de ratones cardíaca 1, 2, 4, 8, 12 y 24 hrs. SEB puesto de la exposición y se utilizan para llevar a cabo un método de ELISA para determinar los niveles de IL-2. PBS ratones inyectados sirvió como control, y no hubo cambios en la secreción de IL-2 en estos animales.

Los valores se compararon mediante la prueba de la t de estudiantes y consideró significativo si p <0,05.

CTI Interleucina-2 inducible de células T Kinase

IL-2 Interleucina-2

SEB Infección por enterotoxina B

SAG Superantigen

Th1 T-helper 1 células

Th2 T helper-2 cells

Syk Spleen tirosina quinasa

Zap-70 Zeta cadena Asociado de proteínas-70

Lck Lstra células kinasa

MAPK Mitogen proteína quinasa activada

ERK señal extracelular quinasa regulada

JNK c-jun N-terminal quinasa

Células NK Natural Killer

LCM linfocítica Choriomeningitis

VS estomatitis vesicular

Forbol PMA ácido mirístico

PBS Solución salina tamponada con fosfato

NFAT factor nuclear de células T activadas

AP-1 activador de proteínas 1

CsA ciclosporina A

AA diseñado los experimentos. MJR JH y realizó experimentos conducentes a la figura 1. MJR realizado experimentos conducen a las cifras 2, 3, 4, 5, 6, 7. AA AJH y proporcionó apoyo financiero y supervisión. MJR, AJH y AA escribió el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.