Cancer Cell International, 2005; 5: 19-19 (más artículos en esta revista)

U94 altera FN1 y ANGPTL4 inhibe la expresión de genes y la tumorigénesis de la línea celular de cáncer de próstata PC3

BioMed Central
Ekwere T Ifon (eti@georgetown.edu) [1], Alan LY Pang (panga@mail.nih.gov) [2], Warren Johnson (johnsowa@mail.nih.gov) [2], Kathleen Cashman (kac2 @ Georgetown.edu) [1], Sharon Zimmerman (zimmersk@georgetown.edu) [1], Sumitra Muralidhar (sumitra.muralidhar @ hq.med.va.gov) [1], Chan Wai-Yee (chanwy@mail.nih . Gov) [2], John Casey (caseyj@georgetown.edu) [1], Jason Leonard Rosenthal (rosenthl@georgetown.edu) [1]
[1] Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Georgetown Medical Center, 3900 Reservoir Road, NW, Washington, DC 20057, EE.UU.
[2] Laboratorio de Genómica Clínica, NICHD, National Institutes of Health, 9000 Rockville Pike, Bethesda, MD 20892, EE.UU.
[3] Departamento de Pediatría, del Centro Médico de la Universidad de Georgetown, 3800 Reservoir Road, NW, Washington, DC 20057, EE.UU.
[4] Departamento de Biología Celular, Universidad de Georgetown Medical Center, 3800 Reservoir Road, NW, Washington, DC 20057,
[5] Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Georgetown Medical Center, 3800 Reservoir Road, NW, Washington, DC 20057, EE.UU.;

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Resumen
Antecedentes

Insensibilidad de etapas avanzadas de cáncer de próstata a la terapia de ablación de andrógenos es un problema grave en la práctica clínica, ya que se asocia con la progresión agresiva y mal pronóstico. El descubrimiento de fármacos terapéuticos dirigidos los esfuerzos se ven frustrados por la falta de un conocimiento adecuado de la (s) de genes asociados con la tumorigénesis de próstata. Por lo tanto existe la necesidad de proporcionar a los estudios orientados conduce a medidas de intervención. Aquí proponemos que estable expresión de U94, un gen supresor tumoral humanos codificados por herpesvirus 6A (HHV-6A), pueden alterar la expresión de genes y, por tanto, inhibe la tumorigenicity de línea celular PC3. Microarray de perfiles de expresión génica en U94 recombinante PC3 línea celular podría revelar los genes que dilucidar la biología del cáncer de la próstata, y es de esperar identificar posibles dianas terapéuticas.

Resultados

Hemos demostrado que la expresión estable de genes U94 en línea celular PC3 inhibido su enfoque en la formación de la cultura, y la tumorigénesis en ratones desnudos. Además puso de manifiesto la expresión de genes de perfiles dramáticos upregulation de FN 1 (fibronectina, 91 ± 16 veces), y profunda downregulation de ANGPTL 4 (angiopoietin-like-4, 20 ± 4 veces) en U94 recombinante línea celular PC3. Cuantitativo en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR), el análisis puso de manifiesto que el patrón de expresión de FN 1 y ANGPTL 4 mRNA fueron consistentes con los datos de microarrays. Basándose en informes anteriores, las conclusiones de este estudio implican upregulation de FN 1 y downregulation de ANGPTL 4 en la lucha contra la actividad tumoral de U94. Los genes con cáncer de inhibitoria actividades que se incluyen upregulated también SERPINE 2 (serina / inhibidor de la proteasa cisteína 2, 7 ± 1 veces más) y ADAMTS 1 (a disintegrin-like y metalloprotease con motivo thrombospondin tipo 1, 7 ± 2 veces más) . Además, SPUVE 23 (serina proteasa 23) que es pro-tumorigénicos downregulated fue significativamente (10 ± 1 veces).

Conclusión

El dramático upregulation de FN 1 y downregulation de ANGPTL 4 genes en el PC3 línea celular estable expresando U94 implicar sobre regulación de FN 1 y downregulation de ANGPTL 4 en contra de la actividad tumoral U94. Son necesarios más estudios para determinar las funciones de los genes expresados diferencialmente en U94 recombinante PC3 línea celular, y es de esperar que proporcionan lleva a los posibles dianas terapéuticas en el cáncer de próstata.

Antecedentes

El cáncer de próstata es la neoplasia maligna más frecuente en los varones EE.UU.. Se calcula que 29900 víctimas mortales de 230110 nuevos casos se espera en el año de 2004 [1]. Ablación androgénica en la actualidad el pilar en el tratamiento del cáncer de próstata, pero su eficacia está empañado por la recaída de algunas etapas avanzadas de células de cáncer de próstata en un estado de andrógenos refractaria [2, 3]. Etapa avanzada de la progresión del cáncer de próstata es agresivo y por lo general se correlaciona con mal pronóstico [2, 4, 5]. Por lo tanto, la insensibilidad a los andrógenos ablación por etapas avanzadas de cáncer de próstata constituye siempre un problema importante en la terapia clínica. Por lo tanto hay una necesidad urgente para el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas en etapas avanzadas de cáncer de próstata.

El conocimiento de los genes que se asocian con el cáncer de próstata es importante para el diseño de una estrategia terapéutica eficaz. Sin embargo, los conocimientos actuales de la biología molecular del cáncer de próstata no es suficiente para definir etiológico genes [5 - 7]. En consecuencia, las actuales estrategias terapéuticas en el cáncer de próstata son ineficientes [8 - 20], y una terapia eficaz orientada sigue siendo difícil de alcanzar. Esta situación llevó nuestro laboratorio de iniciar los estudios para ofrecer alternativa conduce al desarrollo de eficaces y con objetivos de lucha contra el cáncer de próstata agente (s). En nuestro enfoque, se determinó la actividad de lucha contra tumor de proteínas U94 (U94) en la línea celular de cáncer de próstata, PC3.

U94 bp 1473 es un gen situado en el HD12 fragmento de 6A herpesvirus humano (HHV-6A), la cepa U1102 [21]. U94 codifica una proteína de 490 aminoácidos que no se encuentran en otros herpesviruses [21, 22], y es U94 Expresado en niveles muy bajos [23, 24]. Informes recientes sugieren que el U94 es un gen de latencia, y modula la replicación del ADN viral [23 - 26]. Además, la homología estructural de la U94 a Rep 78/68 de virus adeno-asociado tipo 2 (AAV-2) [21, 27] sugiere que puede haber similitudes funcionales entre estas proteínas. Fuerte en la prueba de similitud funcional entre U94 y Rep 78/68 es la observación de que la replicación U94 complementarse de un AAV-2 mutante que es deficiente en Rep 78/68 [28]. Además, informes recientes muestran que la U94 también inhibe la transcripción de genes [29], que es una función biológica de su homólogo Rep78/68. Sin embargo, U94 puede afectar a la transcripción de genes diferentes a la Rep 78/68, ya U94 se activa el virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) de largo terminal de repetición (LTR) en el promotor de las líneas celulares de fibroblastos [28] e inhibe el VIH-1 LTR en células T Líneas [29], mientras que Rep 78/68 inhibe el VIH-1 LTR promotor en ambas líneas celulares de fibroblastos y líneas de células T [28].

Estudios anteriores demostraron que la transformación U94 reprimidas por oncogenes [22, 29]. Los datos de estos estudios muestran que una línea celular NIH 3T3 estable expresando U94 transformación de genes reprimidos por el oncogen H-ras, en comparación con el de sus padres línea celular NIH 3T3 tratadas en condiciones similares [29]. Fuimos motivados por los resultados de anteriores estudios para determinar el potencial de la lucha contra tumor U94 humanos en la línea de células de tumor de próstata PC3.

En el presente trabajo se informe de que la expresión de la proteína en U94 células PC3 inhibió la formación de focos (Figura 2, Tabla 1], y la tumorigenicity de PC3 línea celular recombinante en athymic nude mice (Figura 3]. Por otra parte, los análisis de expresión génica (Figuras 4 y 5], y QRT-PCR (Tabla 2] revelaron dramática upregulation de FN 1 (~ 91-veces) y profundos downregulation de ANGPTL 4 (~ 20 veces) en 2 separada recombinante de células PC3 Establemente líneas expresando U94. Nuestro estudio también demuestra el patrón de expresión diferencial de genes en otros la presencia de U94. Este es el primer estudio que informe el potencial inhibidor de U94 sobre la tumorigenicity etapas avanzadas de cáncer de próstata línea celular PC3.

Resultados

Anteriormente, hemos demostrado que U94 inhibe la transcripción de genes y también la transformación de oncogenes [22, 29]. Varios informes han implicado el mal funcionamiento del regulador de los factores de transcripción [30 - 38], así como las actividades de los oncogenes [39 - 48] como factores etiológicos en la tumorigénesis de próstata. Por lo tanto queríamos determinar si el U94 puede ejercer actividad inhibitoria sobre la tumorigénesis de la línea celular PC3.

Expresión y localización intracelular de proteínas U94

En primer lugar, quisimos determinar si U94 podría expresarse en línea celular PC3. Estamos transfectadas PC3 línea celular con pBKU94 plásmido, en el que figuraban U94 insertar ADN y un seleccionable geneticin (G418) resistentes a los vectores de casete. PBKCMV vector transfectadas las células PC3 sirvió como control. Inmunoblot análisis, utilizando la U94 de anticuerpos policlonales AB679 como se ilustra en la figura 1, que mostró U94 (56 kDa), la proteína se expresa en la fracción nuclear (carril 3) y no a la fracción citoplásmica (carril 2) de transfectadas establemente línea celular PC3. No se ha detectado inmunoreactividad nuclear en la fracción del vector transfectadas línea celular PC3 (carril 1). La Figura 1 muestra el carril 4 de alto peso molecular Rainbow marcador.

La inhibición de la formación se centran U94 por la expresión de la proteína

Con el fin de supervisar el efecto de U94 sobre la formación de tumor, la investigación que hemos realizado se centran en la formación de PC3 línea celular como un índice de un fenotipo neoplásico. Focus se observó la formación de densos como focos de intenso crecimiento de las células en cultivo, que consiste en que las células de refracción redadas y amontonados uno encima de otro [49]. PC3 tres líneas celulares se utilizaron en este estudio: U94 transfectadas, vector transfectadas cassette, y los padres línea celular PC3. Por cada línea celular, 1 × 10 6 células / 60 mm cultura plato fue sembrado y cultivado a la confluencia. Ámbitos de la formación fue examinado 10 días confluencia. El resultado de este estudio (Tabla 1] mostró una reducción drástica de centrarse en la formación de células que expresan PC3 por U94: el número de focos se redujeron ~ 35 veces y 40 veces en comparación con el control de vectores y transfectadas PC3 líneas celulares de los padres, respectivamente . La Figura 2 muestra focos importantes y generalizados en la cultura de control de vectores y de los padres transfectadas PC3 líneas celulares. La cultura de la línea celular PC3 recombinantes que expresan proteínas U94 mostró muy pocos focos, de tamaño sumamente reducido. Los resultados indican que, U94 puede presentar actividad anti tumorales in vitro.

U94 inhibe la expresión de tumorigenicity de PC3 línea celular en ratones nude athymic

Con el fin de determinar si U94 inhibe la tumorigenicity de PC3 línea celular in vivo, se inocularon 5 × 10 6 células PC3 (U94 células transfectadas como prueba, o vector de cassette como el control de las células transfectadas) por vía subcutánea detrás del cuello, en athymic nude mice. Los animales fueron examinados para la formación de tumor en los días 7, 14, 17, 21, y 28 después de la inoculación. Nuestros resultados mostraron que se ha impedido la formación de tumor en ratones que fueron inoculados con PC3 línea celular estable expresando U94 proteína (Figura 3]. El control de los animales que fueron inoculados con la línea celular PC3 transfectadas con el vector de cassette desarrollado tumores, y el tamaño tumoral aumentó progresivamente con el tiempo, como se muestra en la Figura 3. El análisis estadístico, mediante un análisis de medidas repetidas de la varianza (ANOVA), demostró que el volumen de los tumores en animales de prueba y control fueron significativamente diferentes (P <0,05). Una comparación entre el volumen de los tumores de prueba y control de los ratones, utilizando vinculados en la prueba t de Student para complementar ANOVA, mostró además que el promedio de volumen de los tumores de prueba y control de los animales fueron significativamente diferentes (P <0,05) por cada día en tumor volúmenes fueron determinados. Estos hallazgos demuestran que el U94 significativamente (P <0,05) inhibido tumorigenicity de la línea celular PC3 en athymic nude mice, y corroborar nuestros datos (Figura 2] de centrar la formación de ensayo.

Microarray de perfiles de expresión génica en la línea celular estable PC3 expresando U94

Se realizó microarrays de expresión génica de perfiles en línea celular PC3 recombinante expresando U94 estable para determinar si U94 afectados expresión de genes implicados en la tumorigénesis. Hemos utilizado dos clones de U94 recombinante PC3 líneas celulares como las muestras de ensayo, y la línea celular PC3 transfectadas con el plásmido vector como nuestra referencia. El efecto de U94 sobre la expresión de genes se analizó utilizando dos colores de fluorescencia ensayos comparativos sobre portaobjetos de vidrio, microarrays ~ 6000 que contiene los genes relacionados con el cáncer. Nuestros datos demuestran la expresión diferencial de 78 genes: 31 genes se upregulated (Figura 4], mientras que 47 fueron genes downregulated (Figura 5]. Estos resultados muestran los valores medios de dos clones de U94 recombinante de líneas celulares PC3. En particular, los resultados revelaron microarrays dramática upregulation de FN 1 (91 ± 16 veces), y profunda downregulation de ANGPTL 4 (20 ± 4 veces) en líneas celulares PC3 estable U94 expresando proteínas. Aunque la mayoría de los genes expresados diferencialmente mostró un 2-3 veces el cambio en el nivel de expresión en la presencia de U94, decidió considerar la posibilidad de la realización de más estudios sólo con genes ≥ 6 veces el cambio. Los datos de los microarrays se deposita en la expresión de genes de Omnibus de la NCBI, y está disponible en el sitio Web de NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=ncbisearch.

Cuantitativo PCR en tiempo real

Se realizó QRT-PCR para confirmar los datos de microarrays. En un clon de U94 recombinante línea celular PC3, el QRT-PCR datos (cuadro 2] se observó que los cambios en la expresión de los niveles 1 y FN ANGPTL 4 mRNA fueron 183 ± 27 veces mayor y 76 ± 13 veces la disminución, respectivamente. En el segundo clon de U94 recombinante PC3 línea celular, los cambios correspondientes en los niveles de expresión eran 467 ± 32 veces mayor y 67 ± 5 veces disminución, respectivamente. Las diferencias observadas en el pliegue entre los cambios microarrays y QRT-PCR datos puede deberse, al menos en parte, a diferencias en la sensibilidad de detección de las dos técnicas, así como las sutiles diferencias en las condiciones experimentales y de las condiciones fisiológicas en el microambiente de Las células en cultivo. Sin embargo, la tendencia observada desde QRT-PCR datos es coherente con la tendencia de los datos de microarrays. Además, los resultados de ambas técnicas mostraron elevación de SERPINE 2 y expresiones ADAMTS 1 (Tabla 2 y Figura 4], y downregulation de SPUVE 23 (Cuadro 2 y Gráfico 5]. TGM-2 (transglutaminasa 2) mostraron 8 ± 2 veces disminución de los microarrays, pero no realizar QRT-PCR.

Discusión

En el presente estudio, hemos demostrado por primera vez que inhibe la proteína U94 centrarse tumorigenicity formación y de la línea celular de cáncer de próstata PC3. Este estudio es particularmente interesante porque PC3 línea celular es un derivado de la etapa avanzada de cáncer de próstata y metástasis óseas es insensible a la terapia de ablación de andrógenos. Insensibilidad a la terapia de ablación androgénica se asocia con la progresión agresiva del cáncer, y finalmente mortal en menos de 24 meses [2, 6]. Por lo tanto, la lucha contra la actividad tumoral de U94 en línea celular PC3 es novedoso e interesante, y puede tener una aplicación traslacional.

El impulso para nuestro estudio sobre la lucha contra la actividad tumoral de U94 en línea celular PC3 se dio por resultados anteriores [22, 29] de que la transformación U94 reprimidas por oncogenes. Aparentemente, U94 comparte esta actividad funcional con su homólogo de la Rep 78/68 AAV-2 [24]. Sin embargo, el mecanismo (s) de transformación supresor de la actividad no se entiende. Un informe anterior mostró que la actividad U94 perdido su traducción cuando terminación enlaces se insertan en los codones 25, 125 y 245 de su secuencia de nucleótidos [29]. Este hallazgo implica U94 expresión de la proteína en la lucha contra la actividad tumoral en línea celular recombinante PC3. Por lo tanto se realizó un análisis de inmunoblot y U94 demostrado que la proteína (56 kDa) se expresó, y localizado en el núcleo (Figura 1, carril 3) en la línea celular PC3. U94 nuclear localización de la proteína U94 sugiere que podría ejercer la actividad, probablemente en la expresión génica, en el núcleo de la línea celular PC3. Esta opinión está en consonancia con los resultados anteriores [22, 29] U94 que inhibe la expresión de genes. Un estudio anterior [29] mostró que la U94 reprimidas promotor P97, que controla la expresión de E6 y E7 la transformación de los genes de virus del papiloma humano 16 (VPH-6). Por lo tanto, la sospecha de que el tumor supresor de la actividad de U94 en nuestro estudio fue ejercida por la inhibición de la expresión génica. Es interesante observar que la expresión de la proteína U94 no afecta al patrón de crecimiento de la línea celular NIH 3T3 [29]. Esta observación es apoyada por otro informe [25] que expresan establemente células linfoides U94 tenido la misma morfología y características de crecimiento como los padres línea celular. Así anterior U94 hallazgos sugieren que no es tóxico para las células, y especular que el mismo podría decirse de la línea celular PC3.

En la presente investigación, que examinó el efecto de la estabilidad de la expresión de proteínas U94 centrará en la formación, un fenotipo maligno, por recombinante línea celular PC3. Ámbitos de la formación por PC3 línea celular estable expresando U94 se inhibe drásticamente (~ 30 - a 40 veces) en comparación con la de los padres de control de vectores y líneas celulares transfectadas (Tabla 1]. Como se muestra en la Figura 2, generalizadas y grandes focos se formaron por el control de las líneas celulares PC3, en contraste con los focos de fondo formado por U94 recombinantes. Es posible que los pocos focos observados en el fondo su origen en la transformación espontánea y / o fugas durante la selección clonal. Además, nuestros estudios demostraron que la actividad de lucha contra el cáncer de U94 es sostenible en vivo como el desarrollo de tumores fue significativamente (P <0,05) en ratones inhibió que se trataron con U94 recombinante PC3 línea celular (Figura 3]. Estudios anteriores de próstata malignidad vinculado a las actividades de oncogenes [39 - 48]. Por lo tanto, la inhibición de la formación y se centran tumorigenicity en nuestro estudio apoya la hipótesis de que, probablemente, U94 inhibido oncogénico actividades en el cáncer de próstata línea celular PC3, y, por tanto, expuesto la actividad de lucha contra el cáncer. Nuestros datos de microarrays identificado FN 1, que se elevó de manera espectacular (~ 91-veces) (Figura 4] y ANGPTL 4, que fue profundamente reducido (~ 20 veces) (Figura 5] como genes de interés en este estudio. Sobre regulación de FN 1 en el estudio actual fue realmente inesperado, porque los informes anteriores [22, 29] sugiere que U94 inhibe la expresión de genes. Por el contrario, nuestras conclusiones U94 sugiere que en realidad la expresión de los genes alterados en la línea celular PC3 positiva o negativamente. Aunque no se sabe cómo la expresión génica mediada U94, nuestros datos es interesante porque ANGPTL 4 es pro-angiogénicos [50], y la reducción de expresión pueden afectar negativamente la tumorigénesis. Además, los informes anteriores [51 - 54] implicados elevados FN 1 y / o sus derivados en los paradigmas de inhibición tumoral.

Fibronectina (FN) es un importante componente de la matriz extracelular (ECM), en el que se monta como los polímeros insolubles, y está presente en la sangre como un dímero soluble [55]. Fibronectina 1 (FN 1) es un homólogo del FN, y contiene un dominio de auto-ensamblaje, que induce FN 1-FN 1 polimerización [56 - 58]. Por lo tanto los términos FN 1 y FN se emplean en lo que respecta a la polimerización en el presente informe.

1-FN FN 1 interacción se informa [59, 60] para inducir cambios conformacionales que aumentan la capacidad vinculante de FN 1 al receptor (s). "Creemos que el enorme upregulation FN 1 de la transcripción en presencia de U94 llevado a la traducción y la elevación de la secreción de la proteína producto en las células PC3. El aumento del nivel de la proteína 1 FN, a su vez, aceleró FN 1-FN 1 polimerización [56 - 58]. Sospechamos que poliméricos FN 1 vinculante a la superficie celular PC3 mitigado malignos de señalización [61]. El potencial de malignidad de lucha contra la actividad de FN 1 se pone de manifiesto en un reciente informe [62] que exógenos FN 1 podría revertir el fenotipo transformado. Por lo tanto, la interacción con 1 FN PC3 superficie celular podrían haber contribuido, al menos en parte, a la inhibición de la formación se centran en vitro (Figura 2] y tumorigénesis in vivo (Figura 3].

Firme apoyo a la lucha contra tumor in vivo la actividad de polímeros FN 1 es dada por un informe anterior [53] demuestra que la administración sistémica de poliméricos FN 1 exhibido contra la actividad tumoral en ratones con diversos tipos de tumores. Hay que prestar más apoyo proporcionados por un reciente informe [59] que muestran que anastellin, un componente de FN 1, que es capaz de inducir FN 1-FN 1 polimerización, pantallas anti angiogénicos y anti metastastic propiedades in vivo. Además, el resto de los trabajadores [52] han demostrado que los péptidos FN 1 de ejercer la actividad anti tumoral in vivo. Estos hallazgos proporcionan una explicación racional de la observación en este estudio que las elevadas FN 1 expresión en U94 recombinante PC3 línea celular se asocia a la lucha contra la actividad tumoral. En conjunto, los informes anteriores [52, 53, 59] presentan en apoyo a nuestra opinión de que la unión de polímeros FN 1 al PC3 superficie de las células induce la inhibición de la formación se centran en la cultura y la inhibición en ratones de tumorigenicity. Sin embargo, además de FN 1, nuestros resultados también ANGPTL 4 implicados en la lucha contra la actividad tumoral de U94 en línea celular PC3.

ANGPTL 4 se muestra en una membrana de pollo chorioallantoic ensayo para inducir una fuerte respuesta pro-angiogénicos, independiente del gen VEGF [50]. Dado que la angiogénesis está implicada en el desarrollo vascular, neovascularización y es el sello de la progresión tumoral [63, 64], un inhibidor de la angiogénesis tumoral podría ser de gran impacto terapia. En el presente estudio hemos demostrado que ANGPTL 4 fue profundamente inhibidos (downregulated alrededor de 20 veces) en U94 recombinante línea celular PC3. Por tanto, se espera que downregulation de ANGPTL 4 podría ejercer un efecto negativo en el desarrollo vascular, y por lo tanto inhiben PC3 línea celular tumorigenicity in vivo. Aunque no está claro cómo U94 media la expresión de ANGPTL 4, informes recientes [65 - 67] muestran que la angiogénesis está regulado por señales de ECM. Curiosamente, otros informes [53, 59] sugieren que los anti-angiogénicos de la propiedad poliméricos FN 1 está mediado por la inducción de ECM señales. Por lo tanto, parece que puede haber una relación casual o causal entre la actividad de lucha contra tumor poliméricos FN 1 y la inhibición de la ANGPTL 4 en U94 recombinante línea celular PC3. Desde ANGPTL 4 apoya el desarrollo vascular [50], que especular que ANGPTL 4 no mediar la inhibición de la formación se centran por línea celular PC3 en este estudio.

Además de FN 1 y ANGPTL 4, que también optó por la realización de más estudios un subconjunto de otros genes expresados diferencialmente que> 6 veces. Los genes de esta categoría incluyen SERPINE 2 (elevado ~ 7 veces), ADAMTS 1 (upregulated ~ 7 veces) y SPUVE 23 (downregulated ~ 10 veces). SERPINE 2 codifica una serina inhibidor de proteinasa, y ha sido recientemente implicados en la lucha contra el cáncer Actividad [68]. ADAMTS 1 es un activo asociado con la metaloproteinasas ECM [69]. Es esencial para un desarrollo normal [70], pero también muestra actividad anti-angiogénicos [71]. En consonancia con los informes anteriores [68, 71], los datos del presente estudio sugieren que SERPINE 2 y ADAMST 1 probablemente ejercida contra la actividad tumoral. En estudios anteriores [72, 73] demostró que la expresión de SPUVE 23, una serina proteasa, se asocia con mayor potencial maligno. Por lo tanto proponemos que downregulation de SPUVE 23 en U94 línea celular PC3 recombinante equivale a la lucha contra la actividad tumoral.

En conclusión, los resultados de este estudio han sugerido que la lucha contra tumor U94 exposiciones potenciales en línea celular PC3. La dramática elevación FN 1 de expresión y de la reducción de la expresión ANGPTL 4 en U94 recombinante PC3 línea celular puede interpretarse como evidencia de los mecanismos de lucha contra U94 actividad tumoral. Por lo tanto, los datos de nuestro estudio parecen apoyar la hipótesis de la lucha contra tumor FN 1 ya se ha informado por otros autores [51, 52, 54, 55, 74]. Además, este informe identifica ANGPTL 4 y SPUVE 23 como posibles objetivos terapéuticos en la tumorigénesis de próstata. Cabe esperar nuevos estudios de los microarrays datos reportados en este documento podría dilucidar el complejo de alteraciones genéticas que subyacen en etapas avanzadas de la tumorigénesis de próstata, y de ese modo proporcionar pistas para la definición de estrategias terapéuticas dirigidas a etapas avanzadas de cáncer de próstata.

Materiales y métodos
Células y transfección

PC3 línea celular se adquirió de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y el ADN plásmido U94 se preparó a lo descrito previamente [22, 29]]. Todas las células se cultivaron en la HAM F12 medio (Cell gro / Mediatech, VA, EE.UU.) suplementado con 2 mM glutamina, 100 U de penicilina-estreptomicina por ml (Invitrogen, Gaithersburg, MD, EE.UU.), y el 10% de suero de bovino fetal (FBS , HyClone, Logan, UT, EE.UU.), a 37 ° Cy 5% de CO 2. U94 ADN plásmido fue clonado en el sitio HindIII de pRc-RV vector (Invitrogen, Gaithersburg, MD, EE.UU.) o HindIII / BamHI sitio de pBK-CMV (Stratagene, Cedar Creek, TX, EE.UU.) vector. Ambos pRc-VRS y pBK-CMV vectores contienen una geneticin (G418; Mediatech Inc, Herndon, VA, EE.UU.) seleccionables marcador. U94 secuencia de ADN en las construcciones fue confirmada por secuenciación del ADN. El pBK-U94 construir específicamente se utilizan en los experimentos que obligó fuerte expresión de la proteína U94 immunoblotting por ejemplo, porque los resultados anteriores mostraron que U94 ARNm y proteínas se expresaron en niveles muy bajos [23, 24, 75]. Todos plásmido de ADN fueron preparados por dos bandas de cloruro de cesio gradiente ultracentrifugación. U94 construir (pRc o pBK-U94-U94), plásmido o vector de cassette (pRc-VRS o pBK-CMV) se utiliza para la transfección de células PC3. Por transfections, 5,5 × 10 5 células PC3 se chapada en 60 mm cultura plato, y crecido a lo largo de la noche (50% -70% de confluencia). Transfección fue realizado por el fosfato de calcio basado en ProFection mamíferos método de transfección (Promega, Madison, WI, EE.UU.), de conformidad con el protocolo del fabricante. Transfectadas establemente PC3 células fueron seleccionados con G418 (600 μ g / ml), y la ampliación de establecer U94 recombinante línea celular PC3. Selección clonal se realizó en las colonias sanas G418 resistentes utilizando un cilindro clonal. Con el fin de minimizar la cultura impulsada por cambios genéticos [76], las células transfectadas fueron descartados después de 8 pasajes.

La extracción de proteínas, y análisis de inmunoblot

Nuclear fracción de extracto celular se preparó como se describe anteriormente [77]. Confluente PC3 línea celular (10 7 -1,5 × 10 7 células), expresando U94 estable y resistente a los antibióticos G418 (Cellgro, Herndon, VA, EE.UU.) fue preparado por trypsinization fresca, lavada con MEDM (Cellgro / Mediatech, VA, EE.UU.) , En suspensión en 50 ml MEDM (estériles en el tubo de centrifugación de 50 ml), y se incuba a 37 ° C / 5% CO 2 por 2 horas. Las células fueron centrifugadas a 200 × g durante 5 minutos, y resuspendido en 0,5 ml de buffer fosfato salino (PBS, Biofluids, Rockville, MD, EE.UU.) en microfuge tubo. El pellet de células de otra ronda de centrifugación se resuspendió en 400 μ l de Buffer A (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 0,1 mM EDTA; 0,1 mM EGTA 1; mM TDT; o.5 mM PMSF, 1% v / v aprotinina) . Después de incubación a 40 ° C durante 15 minutos, las células fueron lisadas mediante la adición de 0,6% Nonidet P-40, invirtiendo mixta tubo 10 veces, y los núcleos se obtuvo por centrifugación a 200 × g durante 5 minutos. El sobrenadante se utilizó como fracción citoplásmica. Los núcleos se resuspendió suavemente en el helado de 100 μ l de Buffer B (20 mM HEPES; 0,4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DGTA; 1 mM DDT, 1 mM PMSF, 1% v / v aprotinina, 10% de glicerol) , Utilizando una gran agujero pipeta. Los núcleos lisado se incubó en un agitador rotatorio durante 30 minutos a 4 ° C, y luego se centrifuga a 12000 × g durante 10 minutos. Para alícuotas del sobrenadante claro en microfuge tubos, 0,025 mg / ml leupeptina se añadió antes de almacenamiento a -80 ° C. El control de las líneas celulares: vector transfectadas y resistentes a la G418, y los padres PC3, fueron tratados de manera similar.

Determinación de proteínas en los extractos se realizó mediante kit de ensayo de la proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Después de dodecil sulfato de sodio-electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), proteínas fueron resueltas electroblotted en difluoride polivinilideno (PVDF) membrana. La membrana fue bloqueada en el 5% de leche en solución en un rockero de 30 minutos, y enjuagarse rápidamente en Tris / cloruro de sodio / EDTA / Tween 20 (TNET, 0,2 M Tris pH 7,5, 0,05 M EDTA, 1,0 M NaCl 1; Tween 20%), la solución de lavado. Entonces, la membrana se lavó dos veces en TNET sobre un rockero de 10 minutos, antes de que se probaron con anticuerpos U94 primaria AB679 (antisuero de conejo, en TNET dilución 1:1000; Amersham) en un rockero durante 1 hora. Esto fue seguido de tres lavados de 10 minutos en TNET antes de conejo anti-HRP-etiquetados secundaria de anticuerpos (1:10000 dilución en TNET; Amersham) se añadió y se incubaron durante 1 hora. Tres lavados de 10 minutos en TNET se realizaron sobre un rockero, antes de la detección de proteínas utilizando inmunorreactivas ECL (Amersham, Inglaterra) reactivo.

Ámbitos de la formación de ensayo

Dos clones de U94 transfectadas líneas celulares fueron utilizados para el estudio. Vector transfectadas y padres PC3 líneas celulares se utilizaron como controles. Las células se chapada en 1 × 10 6 células / 75 cm 2 cultura matraz por duplicado y crecido hasta confluencia. Ámbitos de la formación fue detectado por observación visual denso focos de intenso crecimiento de las células, que consiste en que las células de refracción redadas y amontonados uno encima de otro [49]. El número de focos en cada frasco se observó en el 10 º día después de que las células son confluyentes. Promedio cuenta de focos por duplicado frascos fueron determinados para cada tipo de células.

Tumorigenicity ensayo

El tumorigenicity de PC3 línea celular estable expresando U94 fue probado en athymic Ncr nu / nu ratones. El control de los animales fueron tratados con el vector transfectadas línea celular PC3. En todos los casos 5 × 10 6 células fueron inoculados por vía subcutánea detrás del cuello, en athymic nude mice como anteriormente descrito [78]. Los ratones fueron controlados cada 2 o 3 días para la aparición de tumores, y se midió el volumen de los tumores en los días 7, 14, 17, 21 y 28 de post inoculación. El tamaño del tumor fueron evaluados por el volumen de los tumores (longitud x anchura x altura, en cm). En todos los casos se utilizaron células confluentes. Hubo dos experimentos con animales. En el primero (n = 3 por grupo), las entradas de datos se realizaron en los días 0, 7, 17, 21, y 28, mientras que en el segundo (n = 4 por grupo) entradas que se han hecho en los días 0, 7, 14, Y 17 de post inoculación. Se combinaron los datos de los dos experimentos e informar al respecto. El Comité de Bienestar Animal, Universidad de Georgetown, aprobó el protocolo para los estudios de animales.

Total de la extracción y purificación de ARN

Dos clones de PC3 línea celular estable expresando U94 (prueba de las muestras 1 y 2) y la línea celular PC3 transfectadas con el vector de cassette (muestra de referencia) fueron utilizados para el estudio. Las células fueron cultivadas a la confluencia y el ARN total fue extraído por medio de reactivo Trizol (Invitrogen, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante. El ARN fue limpiado utilizando el RNeasy mini columnas ® (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. ARN del contenido y la calidad fue inicialmente determinado por OD y 260 OD 280 mediciones. RNA de muestras OD 260/280 mostrando un ratio mayor que 1,8 se utiliza para la hibridación microarrays y QRT-PCR. Contenido y la integridad del ARN se reassayed por duplicado utilizando el Bioanalyzer 2100 (Agilent, Germantown, MD, EE.UU.).

Microarray análisis

La expresión de genes se realizó con un 6 k humanos cDNA microarray ~ 6000 fabricada con los genes relacionados con el cáncer. Cincuenta microgramos de RNA total de los ensayos y muestras de referencia se transcribe por separado invertirse utilizando el MicroMax ™ Direct cDNA Etiquetado Kit (Perkin Elmer Ciencias de la Vida, Boston, MA, EE.UU.) en Cy3 y Cy5 cDNA marcado objetivos. Cy3 marcado objetivos de muestras de ensayo preparado 1 y 2 se hibridó con Cy5-etiquetados cDNA de la muestra de referencia objetivos separados en microarrays. Un tinte de la memoria de intercambio experimento se realizó con los objetivos de los ensayos cDNA muestra 1 etiquetados con Cy5 cDNA y objetivos de la muestra de referencia, marcadas con Cy3 con el fin de eliminar cualquier sesgo experimental debido a las diferencias en la eficiencia de la incorporación 2 tintes fluorescentes. Así, la hibridación microarrays se llevó a cabo por triplicado. La etiqueta de ensayo y de referencia se combinaron ADNc y purificado utilizando Microcon YM-100 unidades de filtro (Millipore Corp, Bedford, MA, EE.UU.), y co-hibridizada en el microarray a 65 ° C durante 14 horas en la oscuridad. Cada microarrays fue lavado a temperatura ambiente en 45 ml de los respectivos buffer de lavado con la siguiente composición y de la duración específica: 1x SSC / 0,2% SDS durante 5 minutos; 0.5x SSC / 0,01% SDS durante 15 minutos; 0.06x SSC / 0,01% SDS durante 15 minutos; 0.06x SSC durante 15 minutos. El lavado se microarrays hilar a 1000 rpm durante 4 minutos antes de la digitalización a los 5 micrones de resolución utilizando la ScanArray 5000XL (Packard Biosciences, Billerica, MA, EE.UU.). Las señales de los canales de Cy3 y Cy5 en cada microarray se normalizaron antecedentes y resta al total de las señales de todos los lugares por LOWESS método, y se analizaron por ScanArray Express software (Perkin Elmer Ciencias de la Vida, Boston, MA, EE.UU.). Los datos fueron representados como un pliegue del cambio de la intensidad de fluorescencia de un gen de la muestra de prueba versus muestra de referencia. Una relación de la intensidad de fluorescencia U94 / vector transfectadas objetivos ≥ 2 representados sobre regulación de los genes, mientras que ≤ 0,5 representado baja regulación. Valores promedio y desviación estándar de tres experimentos fueron determinados. Los genes que se consideraban expresados diferencialmente sólo si muestran la misma tendencia de cambio en la expresión de cada uno de los tres experimentos. Gene anotación información se basaba en los humanos Unigene Cluster Build # 161 (5 de junio de 2003; NCBI)

Cuantitativo en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR)

Para verificar el patrón de expresión de la diferente expresión de los genes identificados a partir de experimentos de microarrays, QRT-PCR se realizó como se describió anteriormente (79). Igual cantidad de RNA total de ensayo y de referencia líneas celulares fueron tratados con DNasa 1 (Invitrogen, Gaithersburg, MD, EE.UU.), y revertir transcritas hexámeros aleatorios y SuperScript II (Invitrogen, Gaithersburg, MD, EE.UU.) para preparar el primer capítulo de cDNA Muestras para análisis QRT-PCR. La RT producto se diluye 5 veces, y 1 μ l es equivalente a la concentración de 1x. Gene primers específicos (Tabla 3] fueron diseñados por Primer Express Versión 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), de acuerdo con la secuencia de la información proporcionada por el ADNc en el microarray. Los primers se BLASTed en contra de la no redundante y conjuntos de ratón EST NCBI para confirmar especificidad. QRT-PCR se realizó por triplicado utilizando SYBR ® Verde sobre la química I 7900 HTS sistema de detección de secuencias (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante. El ciclo de temperatura para QRT-PCR se estableció de la siguiente forma: 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, 95 ° C, 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto durante 40 ciclos. Un último ciclo de disociación corriendo a 95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 15 segundos y 95 ° C durante 15 segundos fue creada para el seguimiento de la especificidad de la amplificación. La relativa curva estándar se ha utilizado el método de cuantificación de la expresión génica, en la que el C T valores de una serie de cantidades fijas de la muestra de prueba (o muestra de referencia) ADNc (0.01x, 1x y 0.1x como se ha descrito anteriormente) se enfrenta a estos Cantidades de ADNc. El C T valor para un gen en 0.1x concentración en la muestra de referencia (o prueba de la muestra) se ajustó a la curva estándar para obtener los respectivos expresión. A C T menor valor indica un mayor nivel de expresión, y viceversa. Genes que muestran valores C T ≥ 40 se consideraron no expresar. El final de la expresión génica de datos se produjeron después de la normalización a la de 18S del RNA.

Análisis estadístico

A las reiteradas medidas de análisis de la varianza (ANOVA), completado por pareadas la prueba t de Student, se utilizó para evaluar las diferencias en el volumen de los tumores entre U94 tratados de control de vectores y los animales tratados. Un valor de p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. SAS software (v8.2, SAS Institute, Cary, NC, EE.UU.) se utiliza para la ANOVA. Los datos experimentales, en su caso, se representan como media ± desviación estándar.

Contribuciones de los autores

ETI realizó cultivo celular, la biología molecular estudios, inmunoensayos, participó en el análisis estadístico, y redactó el manuscrito; ALYP llevó a cabo la hibridación microarrays y el análisis de datos; WJ realizó el análisis QRT-PCR; SM llevó a cabo el tumorigenicity estudios en ratones; WYC realizado Extracción de RNA, análisis de datos y participó en la coordinación de los estudios; KC y SZ asistida en algunos de los estudios de biología molecular, y JC participó en la coordinación de los estudios; LJR concebido del estudio, y coordinado de los estudios. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

ETI fue apoyada por un Suplemento Minoritarias (CMBB / NCI / NIH) de Servicio de Salud Pública (PHS) conceder CA 78120 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, Bethesda, MD, EE.UU.). Este trabajo fue apoyado en parte por PHS / NIH concesión CA 78120, y un contrato de la Fundación Nacional para la Investigación del Cáncer (Bethesda, MD, EE.UU.) concedido a LJR. Asistencia en el tumorigenicity ensayos fue proporcionada por el Centro de Investigación del Cáncer Lombardi al servicio del cuidado de los animales. Un agradecimiento especial a: Dr Yan A. Su, Departamento de Patología, Loyola University Medical Center, Maywood, IL, EE.UU. portaobjetos de vidrio, para la fabricación de microarrays para NICHD / NIH, y Michael Sheridan, Sc. D., Consultor Epidemiólogo, Inova Health System y Director de Epidemiología y Bioestadística, Departamento de Medicina, Hospital de Inova Fairfax, VA, EE.UU., para realizar el ANOVA.