Malaria Journal, 2005; 4: 37-37 (más artículos en esta revista)

In vitro de sensibilidad a los medicamentos antimaláricos en las zonas fronterizas de Tailandia 1998-2003

BioMed Central
¿Querés Chaijaroenkul (wn_ap39@yahoo.com) [1], Kesara Na Bangchang (nkesaratmu@yahoo.com) [1], Mathirut Mungthin (mathirut@pmk.ac.th) [2], A Stephen Ward (saward @ liverpool. Ac.uk) [3]
[1] Faculty of Allied Health Sciences, Thammasat University, Rangsit, Patumthani 12121, Thailand
[2] Department of Parasitology, Phramongkutklao College of Medicine, Ratchathewi, Bangkok 10400, Thailand
[3] División de Parasitología Molecular y Bioquímica, Liverpool School of Tropical Medicine, Pembroke Place, L35QA Liverpool, Reino Unido

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Resumen
Antecedentes

El Tailandia y Myanmar y Tailandia y Camboya fronteras han sido históricamente vinculada a la aparición y propagación de parásitos Plasmodium falciparum resistentes a los medicamentos antimaláricos. De hecho, las zonas han sido descritas como la acogida resistente a múltiples drogas parásitos. Estas áreas de Tailandia han experimentado cambios significativos en los patrones de exposición a los medicamentos antimaláricos en la última década. Este estudio describe la susceptibilidad in vitro antipalúdicos de 95 patrones de laboratorio adaptadas p. Falciparum aislados, recogidos entre 1998 y 2003.

Métodos

Noventa y cinco p. Falciparum aislamientos se obtuvieron de cinco sitios en Tailandia entre 1998 y 2003. Después de la adaptación al laboratorio de cultivo in vitro, la sensibilidad de estos parásitos a una gama establecida de los medicamentos antimaláricos (cloroquina [CQ], mefloquina [MQ], la quinina [QN] y dihydroartemisinin [DHA]) fue determinado por el isotópica microtest.

Resultados

Mefloquina (MQ), la sensibilidad se mantuvo más pobres de las zonas anteriormente descritas como zonas MQ-resistentes. Sensibilidad a MQ de los parásitos de esta zona es significativamente más bajos que los de las zonas del puerto informó a moderada (p = 0,002), de bajo nivel de resistencia MQ (p = 000001). Es importante destacar que para todos los medicamentos probados, hubo una considerable gama de sensibilidades absoluta parásito. Hubo un débil, pero estadísticamente correlación positiva entre la sensibilidad a la CQ y la sensibilidad a la vez QN y MQ y una correlación positiva entre MQ y QN. En cuanto a la distribución geográfica, los parásitos de la Tailandia y Camboya se tiende a ser menos sensible a todas las drogas ensayadas frente a la frontera entre Tailandia y Myanmar. Sensibilidad a todas las drogas se mantuvo estable durante los 6 años de período de recogida, con excepción de QN.

Conclusión

Este estudio pone de manifiesto el alto grado de variabilidad en la sensibilidad del parásito de drogas en Tailandia. Existen diferencias geográficas en los patrones de resistencia que podrían reflejar diferencias en el uso de drogas en cada zona. En contraste con muchos otros estudios hay débiles, pero estadísticamente significativa, la correlación entre la sensibilidad a la CQ y la sensibilidad a la MQ y QN. Durante los seis años de recogida de muestras, la sensibilidad parece haberse estabilizado a estos fármacos en estos sitios.

Antecedentes

La malaria es todavía un importante problema de salud en Tailandia, sobre todo a lo largo de la Tailandia y Myanmar y Tailandia y Camboya, donde las fronteras resistente a múltiples drogas malaria es altamente prevalente [1]. Resistente a la cloroquina (CQR) parásitos se notificaron los primeros desde finales del decenio de 1950 el sudeste de Asia y America del Sur. Desde esos primeros informes CQR ha extendido por todo el paludismo endémico de los países en el mundo. El Programa de Control de la Malaria del Ministerio de Salud Pública de Tailandia se estableció en 1963. El objetivo del programa de control es supervisar la sensibilidad de Plasmodium falciparum a los medicamentos antimaláricos utilizados actualmente utilizando tanto in vitro como in vivo en pruebas con el objetivo final de proporcionar estrategias eficaces de lucha contra el paludismo y retrasar la aparición de resistencia a los medicamentos [2]. Ambos enfoques a la evaluación de la sensibilidad tienen sus puntos fuertes y débiles [3]. La sensibilidad in vitro de sistema de vigilancia es considerado un sistema apropiado para la evaluación de la sensibilidad sin la absoluta confusión influencias de los factores relacionados con el huésped, como anfitrión de la inmunidad y la farmacocinética de la droga. Los resultados de los ensayos in vitro, por lo tanto, proporcionar una visión más objetiva de drogas inherente sensibilidad que hacer las pruebas in vivo. Sin embargo, en comparación con la prueba in vivo, existen requisitos técnicos que hacen este tipo de análisis de las operaciones más difíciles.

Varios prueba de la sensibilidad in vitro de los sistemas se han desarrollado y aplicado a la vigilancia de la sensibilidad de P. Falciparum en zonas endémicas. Estos incluyen tradicionales de los ensayos in vitro basado en la medición de la efectividad de los medicamentos en el crecimiento y el desarrollo de los parásitos de la malaria, es decir., Schizont maduración o de inhibición del crecimiento [4, 5], la incorporación de precursores radiomarcada [6], la actividad enzimática de los parásitos Lactato deshidrogenasa (pLDH) [7] o histidina ricos en proteínas II (HRP II) [8]. La sensibilidad in vitro de prueba basándose en el nivel micro-técnica recomendada por la Organización Mundial de la Salud [5] mediante el ensayo de inhibición de la maduración schizont se ha aplicado con éxito en algunos altamente resistente a múltiples drogas zonas de Tailandia. Sin embargo, la técnica requiere de inmediato los trabajos de laboratorio en los lugares, donde la disponibilidad de personal calificado no es fácil de obtener. Uno de los enfoques para resolver este problema consiste en recoger muestras de sangre del paciente y realizar la prueba en los laboratorios centrales donde existe personal cualificado. Este enfoque requiere la preservación del parásito muestras a baja temperatura (-196 ° C) en un tanque de nitrógeno líquido y la adaptación de las cepas del parásito a la cultura de corto plazo antes de las pruebas de sensibilidad in vitro. Una ventaja adicional de este enfoque es que permite múltiples evaluación de la susceptibilidad de drogas, el aumento de la confianza en los datos recolectados, en comparación con la cuota única de las drogas análisis de sensibilidad que ofrece la utilización de aislamientos recién recolectados. El principal objetivo de este estudio fue explorar la sensibilidad in vitro de la recientemente recogido y adaptado p. Aislamientos falciparum a la cloroquina, quinina, mefloquina y dihydroartemisinin con el fin de establecer el grado de variabilidad en la sensibilidad, cualquier patrón geográfico y la estabilidad de la sensibilidad durante un período de seis años período de recogida.

Métodos
Parásitos aislados

Este estudio se llevó a cabo entre 1998-2003, p. Falciparum aislamientos se obtuvieron de zonas endémicas de malaria Tailandia (Figura 1], incluida la frontera entre Tailandia y Myanmar regiones (Kanchanaburi, Tak, de Ratchaburi y Ranong), y la frontera entre Tailandia y Camboya (Chantaburi). Aprobación del protocolo de estudio se obtuvo de la Comisión de Ética del Ministerio de Salud Pública de Tailandia. Fresh aislamientos de P. Falciparum se obtuvieron de los pacientes con crisis de la malaria por Plasmodium falciparum sin complicaciones que se presentaron en Mae Sot Hospital General de la Malaria y Clínicas ubicados en las distintas provincias. Los criterios de inclusión incluyeron aquellos que no tenían historia previa de tratamiento antipalúdico en el anterior mes, y con una parasitemia asexual entre 1000 80000 / μ l. Todos dieron su consentimiento informado para el estudio de la participación. De tres a cinco mililitros de sangre se recolectaron en tubos de EDTA de pacientes con un diagnóstico confirmado de poco p. Falciparum malaria. La sangre fresca muestras fueron centrifugadas para eliminar la capa leucocitaria y criopreservados en nitrógeno líquido, siguiendo el método de Rowe [9], antes de ser transportadas al laboratorio.

Los parásitos se mantuvieron en cultivo in vitro utilizando el método de Trager y Jensen [10]. Brevemente, las muestras de sangre infectadas fueron removidos de tanques de almacenamiento de nitrógeno líquido y descongeladas en un 37 ° C baño de agua. Un volumen igual de estéril de cloruro sódico al 3,5% se añadió, y la mezcla fue centrifugada a 1000 × g durante 5 min. El pellet fue lavada tres veces y volvió a suspenderse con RPMI-1640 suplementado con 20% de suero humano y se coloca en 25 ml de cultivo de tejido en el matraz un volumen total de 10 ml que contiene el 5% de RBC suspensión. El frasco fue enjuagarse con una mezcla de gases del 5% de CO 2, 5% O 2 y 90% N 2 y se incuba a 37 ° C. El medio de cultivo se cambió una vez al día; O grupo de los glóbulos rojos se han añadido a mantener el 5% de suspensión celular. Parásito crecimiento fue supervisado por Giemsa-manchados (2% v / v, pH 6,8, 30 min) delgada baciloscopía.

Pruebas de sensibilidad in vitro de P. Falciparum aislamientos

Drogas ensayo se realizó a través de los parásitos en cultivo una vez que la parasitemia de la cultura alcanzado una densidad óptima (0,5% -1% de la parasitemia y el 1,5% de hematocrito). Susceptibilidad in vitro fue probado por la vigilancia [3 H] hipoxantina absorción [6]. Cada fármaco se preparó como solución stock 10 mM y posteriormente diluido en medio RPMI-1640 a la concentración deseada. Las placas (de 96 pozos de las placas de microtitulación) fueron dosificados con los medicamentos antimaláricos en un total de ocho concentraciones final de la siguiente manera: mefloquina (1, 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200 nM), la cloroquina (5, 10, 25, 50, 100, 150, 250, 500 nM), la quinina (10, 25, 50, 100, 150, 250, 500, 1000 nM), y dihydroartemisinin (0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,0, 5,0, 7,5 , 10,0 nM). Diez microlitros de sangre (1% parasitemia, hematocrito 20%) se vació en cada uno de los estériles, así placas, seguido de 100 μ l de solución de drogas en RPMI-1640 sin [3 H] hipoxantina. Las placas fueron incubadas a 37 ° C en una jarra de vela de 24 horas, con pulsos de 5 μ l de [3 H] hipoxantina solución (0,1 mCi / ml), y reincubated por un período adicional de 24 horas. Las placas fueron recolectados utilizando un Tomtec marzo III M semi-automático cosechadora, utilizando un Wallac Impreso Filtermats (Finlandia), secos, y mezclar con 5 ml de líquido scintillation. Cada filtro colchoneta era entonces colocado en un casete y la radiactividad se midió utilizando un 1450 MicroBeta Trilux líquido y luminiscencia scintillation counter (Wallac, Finlandia). La concentración de droga que inhibe el crecimiento del 50% parásito (IC 50) fueron determinados. Informó de los datos representan la media de los resultados de al menos tres drogas independiente de las pruebas de sensibilidad.

Análisis estadístico

La actividad in vitro de los antimaláricos se presenta como la media geométrica de la CI 50 s para todos los aislamientos. La U de Mann-Whitney-Se usó la prueba para determinar si las diferencias observadas en la respuesta in vitro de parásitos geográficamente distinto a los medicamentos antimaláricos fueron significativamente diferentes. El potencial de in vitro de resistencia cruzada se evaluó mediante análisis de regresión lineal estándar. Para todas las pruebas estadísticas el nivel de significación (p) se fijó en 0,05.

Resultados
Susceptibilidad in vitro de P. Falciparum a los medicamentos antipalúdicos

Un total de 95 p. Falciparum aislamientos se obtuvieron de cinco zonas endémicas de malaria Tailandia: Mae-sot Distrito, Tak (27), Ratchaburi (1), Kanchanaburi (37), Ranong (16) y Chantaburi Provincia (14). La sensibilidad in vitro de datos se muestran en la Figura 2A a 2C. La media geométrica de la concentración inhibitoria del 50% (IC 50) y 95% IC fueron 74,3 (45,2-122,2), 162,9 (91,9-288,8), 22,2 (10,8-45,6) y 1,35 (0,73-2,47) para nM CQ, QN, MQ Y DHA, respectivamente. No hubo grandes diferencias en la susceptibilidad de drogas durante los seis años que las muestras fueron colectadas con la excepción de la sensibilidad a la quinina, que fue menor en los colectados en el año 2003 (Cuadro 1].

Susceptibilidad in vitro y la distribución geográfica

Las zonas palúdicas de Tailandia han sido clasificados por el nivel clínico es decir, la sensibilidad de la mefloquina. Alto nivel de resistencia MQ (MQ tasa de curación de 750 mg es de menos de 50%; Tak y Chantaburi provincias), moderado nivel de resistencia MQ (tasa de curación entre 50% y 70%; Kanchanaburi y Ratchaburi provincias) y el bajo nivel de resistencia MQ (tasa de curación Más del 70%, la provincia de Ranong). Estos grupos se mantuvieron en los aislados estudiados in vitro. Curiosamente, los parásitos de la zona menos MQ resistente tiende a demostrar mayor susceptibilidad a los otros fármacos probados.

In vitro de resistencia cruzada

En contraste con anteriores estudios realizados en África y Tailandia aislados [11, 12], existe una correlación positiva significativa entre la sensibilidad in vitro de la susceptibilidad a CQ y MQ (n = 91, Pearson r = 0,075, p = 0,010) y QN (N = 93, Pearson r = 0,134, p <0,0001) (Figura 3]. Del mismo modo existe una correlación positiva significativa entre los valores de CI 50 QN y de la CI 50 valores de la MQ (n = 91, Pearson r = 0,230, p <0,0001). La fuerte correlación entre las actividades de QN MQ y no es de extrañar dada la similitud estructural entre estos dos fármacos, y ha sido observado por varios autores [13, 14]. En cambio, la susceptibilidad a la DHA no se correlacionó con la susceptibilidad a cualquiera de los otros fármacos probados (datos no presentados).

Discusión

En respuesta a las preocupaciones acerca de la situación de la malaria en Tailandia, el gobierno estableció el Programa de Control de la Malaria desde 1963. Este programa ha supervisado y modificado tailandés política de control de la malaria, que se revisó por última vez en 1995. El principal objetivo del programa es seguir la evolución de los parásitos de la malaria resistentes a los medicamentos [2]. La capacidad para aplicar de forma rápida y relativamente barata de ensayo para predecir sensibilidad a los medicamentos de p. Falciparum es de vital importancia, a fin de que la propagación de parásitos resistentes a las drogas pueden ser supervisados y controlados. El primer informe de la resistencia a CQ vinieron de las fronteras de Tailandia a fines del decenio de 1950. Más recientemente, MQ resistencia era la que se desarrollan rápidamente después de su introducción en la práctica clínica. Este problema ha sido subsanado por la introducción y despliegue de la artemisinins en combinación con MQ. La experiencia con CQ ha puesto de manifiesto la utilidad de los ensayos de sensibilidad de drogas en el trazado de la aparición y propagación de la resistencia. Más recientemente herramientas moleculares han encontrado utilidad. Por ejemplo el uso de la K76T mutación en el gen pfcrt como un marcador de susceptibilidad CQ es la más útil marcador molecular de la resistencia a CQ, sin embargo, algunas cepas de parásitos que son sensibles a CQ, además, esta mutación [11, 15] y el uso de Esta estrategia se basa en un conocimiento completo de todas las posibles mutaciones de resistencia. Además, la gran variabilidad en la sensibilidad a drogas como la CQ sugiere que aunque un caso puede ser molecular, el control dominante de la susceptibilidad, otros eventos moleculares deben contribuir a esta variabilidad [16].

Se han realizado muchos estudios en busca de parásitos chemosensitivity en SEAsia. En general, el patrón de sensibilidad muestra la coherencia en toda la región, aunque las respuestas en el parásito de Vietnam parásitos tienden a mostrar mejores respuestas a las drogas [17, 18]. Disminución de la susceptibilidad a la quinina se registró por primera vez a principios de la década de 1980 en los pacientes que viven cerca de la frontera entre Tailandia y Camboya [19, 20]. Los datos presentados en este estudio indican que la p. Falciparum susceptibilidad a la QN es estable o puede haber mejorado ligeramente recientemente. Con respecto a los otros fármacos estudiados contra el parásito sensibilidad apperas haberse estabilizado.

Varios estudios han reportado evidencia de resistencia cruzada entre cierto grupo de la quinoleína que contenía medicamentos contra la enfermedad, es decir, QN, MQ y HF, al mismo tiempo que muestran una relación inversa entre este grupo de las drogas y la sensibilidad a la CQ [14, 21 - 24]. Del mismo modo, en otros estudios, la sensibilidad de P. Falciparum campo aislados a los dos estructuralmente relacionados con las drogas y QN MQ estaba fuertemente correlacionado [13, 14, 25]. Este patrón de resistencia cruzada también se confirmó en este estudio. Por el contrario, un débil, pero estadísticamente significativa, se observó una correlación positiva entre la sensibilidad a la CQ y la sensibilidad, ya sea a MQ o QN. Los mecanismos detrás de esta observación queda por determinar, sino que sugiere que los factores adicionales que deberán estar operativos en estos parásitos en comparación con aquellos que muestran una clara correlación negativa en sus patrones de susceptibilidad. A pesar de una serie de informes mostraron una correlación positiva entre la susceptibilidad in vitro de DHA y quinolinas como la quinina y la mefloquina, esta resistencia cruzada no es evidente en este estudio [11, 12, 25]. En términos de la distribución en Tailandia, parásitos de la Tailandia y Camboya tienden a ser más resistente a todos los fármacos evaluados, frente a los parásitos de la frontera entre Tailandia y Myanmar.

Los datos de la sensibilidad in vitro de parásitos adaptados mostró la visión más clara de los perfiles de drogas, que permite la evaluación de múltiples pruebas de consumo de drogas. El perfil de las drogas en este estudio mostraron que el patrón de resistencia MQ se extendió a la mayoría de las zonas endémicas, especialmente a lo largo de las fronteras. La vieja política de drogas se basa en el nivel de resistencia MQ zonas, que el paludismo por Plasmodium falciparum tratados con dosis única de 750 mg MQ MQ resistencia en la zona baja, mientras que la moderada y alta resistencia MQ zonas fueron tratados con dosis múltiples de 750 mg más MQ 300 mg y 500 mg de artesunato a las 6 horas de intervalo, respectivamente [2]. Desde el hecho de aumentar la resistencia MQ, la política de control de la malaria ha sido revisado, que tienen como objetivo reducir la resistencia MQ. Así, la combinación de derivados de la artemisinina con MQ se ha introducido como tratamiento de primera línea para el tratamiento de drogas no grave falciparum malaria en todo el país. Sin embargo, QN sigue siendo el fármaco de primera línea para el tratamiento de la malaria severa [26].

Conclusión

Este estudio indica una relativa estabilidad en la susceptibilidad del parásito en cuatro instrumentos fundamentales de las drogas en las zonas fronterizas de Tailandia. En particular, la resistencia a la CQ MQ y se mantiene en un nivel alto, aunque hay importantes variaciones. Hay indicios de que QN sensibilidad puede haber aumentado ligeramente y, esto es importante para la quimioterapia de combinación, parásito a la sensibilidad derivado de la artemisinina, el Departamento de Asuntos Humanitarios sigue siendo elevado. Esto respalda la decisión de los tailandeses programa de control de malaria para introducir MQ combinaciones que contienen la artemisinina como primera línea de tratamiento de la malaria para el país.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación Tailandia para la beca de la Real Golden Jubilee (RGJ) Ph.D. Programa para WCMM KN y con el apoyo de Tailandia-Programa de Investigación sobre Enfermedades Tropicales (ID 02-2-LMA-24-047). Queremos dar las gracias Unidad de Investigación de Paludismo, la Universidad de Chulalongkorn, Tailandia por parásitos aislados.