Journal of Translational Medicine, 2005; 3: 28-28 (más artículos en esta revista)

ARN para el éxito de la amplificación de genes de perfiles de análisis

BioMed Central
Ena Wang (ewang@mail.cc.nih.gov) [1]
[1] Immunogenetics Section, Department of Transfusion Medicine, Clinical Center, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20892, USA

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Resumen

El estudio de muestras clínicas suele ser limitado por la cantidad de material disponible para el estudio. Si bien las proteínas no pueden ser multiplicadas en su forma natural, el ADN y el ARN puede ser amplificada de los pequeños y los especímenes utilizados para los análisis de alto rendimiento. Por lo tanto, los estudios genéticos ofrecen la mejor oportunidad para la detección de nuevos conocimientos de la patología humana, cuando se dispone de poco material. Estimaciones precisas del número de copias de ADN en una muestra son necesarias. Sin embargo, la mayoría de los estudios estáticos investigar variables como los antecedentes genéticos o mutaciones de los pacientes dentro de los especímenes patológicos, sin necesidad de evaluar la proporcionalidad de la expresión de los diferentes genes en todo el genoma. La hibridación genómica comparada de las muestras de ADN crudo representa una excepción a esta regla ya que la amplificación genómica o la supresión se compara entre los distintos especímenes directamente. Para el análisis de la expresión de genes, sin embargo, es fundamental para estimar con precisión la expresión proporcional de los distintos ARN transcripciones desde tales proporciones gobernar directamente a través de la modulación de células función de la expresión de la proteína. Además, la comparación de estimaciones de relativa ARN expresión en diferentes momentos a lo retratan la respuesta de las células a los estímulos ambientales, indirectamente, informar sobre eventos biológicos más amplios que afectan a un determinado tejido en condiciones fisiológicas o patológicas. Esta reacción cognitiva de las células es similar a la detección de patrones electroencefalográficos que informar sobre el estado del cerebro en respuesta a estímulos externos. Como nuestra necesidad de entender la fisiopatología humana a nivel mundial aumenta, el desarrollo y el perfeccionamiento de las tecnologías de alta fidelidad ARN mensajero de amplificación se han convertido en el foco de interés creciente durante la última década. La necesidad de aumentar la abundancia de ARN se ha cumplido, no sólo para la amplificación de genes específicos, pero, lo que es más importante a nivel mundial para transcriptome amplia, imparcial amplificación. Ahora gen específico, imparcial transcriptome gran amplificación con precisión mantiene la proporcionalidad entre todas las especies de ARN dentro de una determinada muestra. Esto permite la utilización de material clínico obtenido con métodos mínimamente invasivos como el aspirado de aguja fina (PAAF) o citológico de lavado de alto rendimiento para los estudios de genómica funcional. Esta revisión ofrece un completo y actualizado de discusión de la literatura en el tema y analiza críticamente los principales enfoques, los escollos y proporciona sugerencias prácticas para el éxito de la amplificación imparcial de toda transcriptome en muestras clínicas.

Introducción

La cuantificación de la expresión génica es una herramienta poderosa para el entendimiento mundial de la biología subyacente complejas condiciones fisiopatológicas. Los avances en el análisis de perfiles de genes usando oligo o cDNA microarray sistemas basados en descubierto genes de importancia crítica en el desarrollo de la enfermedad, la progresión, y la respuesta al tratamiento [1 - 12]. Si bien la expresión de un único o un número limitado de genes pueden ser fácilmente estimados usando cantidad mínima del total o de ARN mensajero (ARNm) de las muestras experimental o clínica, de perfiles de genes requiere gran cantidad de RNA que sólo puede ser generada a partir de la amplificación del ARN mundial cuando Utilizando a menudo limitada cantidad de material clínico. Convencionalmente, al menos, 50 - 100 μ g de ARN total (T-ARN) o 2 - 5 μ g poli (A) + RNA son generalmente necesarios para el análisis de los estudios mundiales de transcripción aunque los esfuerzos por aumentar la intensidad de la señal y la incorporación fluorocromo han reducido la cantidad de RNA total Necesarios para el análisis conjunto de 1-5 ug [13]. Grandes cantidades de ARN no son por lo general obtener a partir de muestras clínicas. Así pues, que se refiere a los esfuerzos experimentales que las líneas de células cultivadas o tejidos agrupados de modelos experimentales, mientras que sólo se utilizan de vez en cuando que se puede obtener de gran escisión biopsias [14]. Sin embargo, la mayoría de los especímenes biológicos obtenidos directamente ex vivo para fines de diagnóstico o pronóstico o para el seguimiento del tratamiento clínico son demasiado escasos para producir suficiente ARN de alto rendimiento para el análisis de la expresión génica. Biopsias de aguja o punzón ofrecer la oportunidad de serie muestra lesiones durante el tratamiento o para tomar muestras de la lesión para identificar predictores de los resultados del tratamiento mediante la observación de la suerte de la lesión en la izquierda. Además, la sencillez del procedimiento de almacenamiento asociado a la recolección de pequeñas muestras que se pueden realizar en la cama lado proporciona una calidad superior de ARN con un mínimo de degradación [15]. Por último, la hipoxia que se ajusta a la ligadura de tumor-alimentación de los buques antes de la escisión que se evita con estos métodos mínimamente invasiva, por lo tanto, la obtención de un verdadero resumen de la información de la transcripción del programa en vivo. Estas técnicas de muestreo mínimamente invasiva rendimiento general pocos microgramos de RNA total y la mayoría de las veces incluso menos [15, 16]. Del mismo modo, nasal y de seno y cervical lavages cepillo biopsias, normalmente utilizadas para el diagnóstico patológico, generar suficiente material muy por debajo del límite de detección de la mayoría de los ensayos. Adquisición de subconjuntos de células fluorescentes o por la clasificación magnetico o láser micro-captura de disección (LCM) para una imagen más precisa de cada célula en un proceso patológico generar aún menos material, en la mayoría de los casos, del total de nanogramos ARN [17 - 20].

Se han realizado esfuerzos para ampliar la utilización de los microarrays de ADNc utilizando dos estrategias principales: la intensificación de la señal de fluorescencia [13, 21 - 24] o amplificar ARN. Señal intensificación enfoques han reducido el requisito de la ARN unos pliegues, pero no puede ampliar la utilización de los microarrays a niveles sub-microgramos. Amplificación del ARN, a su vez, ha adquirido una popularidad extrema amplificación basada en la eficiencia, la linealidad y la reproducibilidad de la reducción de la cantidad total de ARN necesaria para el análisis de microarray de nanogramos sin introducir sesgos importantes. Métodos destinados a la amplificación de poli (A)-ARN [25] a través de la transcripción in vitro (IVT) [26] o de amplificación de cDNA a través de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) [27] han reducido el material necesario para la aplicación cDNA microarray y prorrogó el Espectro de las muestras clínicas que se pueden estudiar. Nanogramos de RNA total se han amplificado en microgramos de puro ARNm para el cribado de toda la transcriptome sin perder la proporcionalidad de la expresión génica está representada por el material de origen. Curiosamente, los avances más importantes fueron hechas por Eberwine Asistentes cuyo principal objetivo era no utilizar material clínico para estudios de alto rendimiento, sino más bien para amplificar suficiente material de las células individuales de cada gen o unos análisis [28, 29]. Su revolucionaria aportación, sin embargo, ha proporcionado una sorprendente oportunidad de explorar la función del genoma humano ex vivo exponencialmente y ha abierto las fronteras de la investigación clínica. Las modificaciones, optimizaciones y validaciones de la tecnología del ARN de amplificación basada en el trabajo pionero de Eberwine Asistentes todavía están estudiando.

En este capítulo, vamos a sintetizar los esfuerzos para optimizar la amplificación del ARN y describir en detalle los procedimientos actuales de amplificación que se han validado y aplicado a cDNA microarray análisis.

Recogida de material de aislamiento y ARN

Las muestras utilizadas para el aislamiento y la amplificación del ARN debe ser siempre fresco y recogido inmediatamente procesado. Biopsias de escisión debe ser manejada dentro de los 20 min y almacenado a -80 ° C (por ejemplo con RNAlater ™, Ambion, Austin, TX) si el aislamiento de ARN no puede realizarse de inmediato. Material de FNA deben recogerse en 5 ml de refresco con hielo 1 × PBS o de otra colección medio sin suero a la cabecera del paciente para reducir al mínimo el metabolismo o la degradación del ARN. Después de girar a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 ° C, 2,5 ml de buffer de lisis ACK debe añadirse con 2,5 ml de 1 × PBS e incubadas durante 5 minutos en hielo a lyse glóbulos rojos (RBC) en el caso de la excesiva contaminación. Cell pellets deben lavarse en 10 ml 1 × PBS y después volver a suspender en los pequeños volúmenes de RNAlater seguido por snap antes de la congelación o la lisis de la bolita en 350 μ l de buffer RLT con frescos además de 2-mercaptoetanol (2-ME) ( RNeasy mini kit, QIAGEN Inc, Valencia, CA, EE.UU.) antes de la congelación en el broche de -80 ° C. Por LCM, los buenos resultados se pueden obtener por lisis de células directamente en el 50 μ l RLT buffer de 2-ME. Total RNA (T-RNA) y poli A RNA pueden ser utilizados como material de partida para la amplificación del ARN.

El método de aislamiento de ARN influye mucho en la calidad y la cantidad de ARN. T-RNA pueden ser aisladas utilizando comercialmente disponibles kits de aislamiento de ARN. El T-ARN por contenido de células de mamíferos oscila entre 20 a 40 pg de los cuales sólo el 0,5 - 1,0 pg están constituidos por ARN mensajero (ARNm) [30, 31]. Ejemplo de condición, viabilidad, el estado funcional y el fenotipo de las células son los principales motivos por los diferenciales de rendimiento de los T-ARN. Ejemplos de manejo con precaución para RNasa contaminación siempre mejora la calidad y la cantidad de ARN obtenido. Medición de la concentración de ARN-T puede ser realizado con un espectrofotómetro en OD 260. Un OD 260/280 ratio por encima de 1,8 se puede esperar. Cuando un número muy limitado de células está disponible como de LCM o FNA, muy bajo o incluso negativo OD lecturas puede observarse. En este caso, OD lectura puede omitirse. Cuando se ARN aislado de las muestras archivadas o cuya recogida de muestras y condiciones de almacenamiento no son controlados y optimizados, es preferible para estimar la calidad y la cantidad de ARN usando Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc Palo Alto, CA) o ARN geles. Borrar 28S y 18S del RNA ribosomal bandas indican la buena calidad de la ARN. Desde 28S rRNA degradación se produce antes de lo 18S rRNA y la degradación del mRNA en la mayoría de los casos se correlaciona con 28S ribosomal RNA, de la relación versus 18S rRNA 28S es un buen indicador de la calidad de ARNm [32]. 28S/18S rRNA cocientes igual o cercana al 2 ARN sugieren buena calidad.

Single Strand cDNA síntesis

Un paso crítico en la amplificación del ARN o ADNc es la generación de la doble varados cDNA (cDNA-ds) plantillas. Primer capítulo ADNc invertir son transcritos de ARNm utilizando oligo dT o cebadores aleatorios. Con el fin de generar plena longitud primer capítulo cDNA, oligo dT (15-24 nt) con un archivo adjunto de un promotor bacteriano fagos T7 secuencia se utiliza comúnmente para iniciar la síntesis de ADNc [25, 29, 33 - 36]. En caso de la degradación del ARN [37], con apego al azar primers de la RNA polimerasa T3 promotor (T3N9) se han utilizado para la primera y segunda cDNA síntesis [38]. Para evitar la degradación del RNA mientras que la desnaturalización y durante la transcripción reversa (RT) de reacción, es útil para desvirtuar el ARN (65 ° C durante 5 minutos o 70 ° C durante 3 minutos), en presencia de RNasin ® Plus RNasa Inhibidor (Promega, Madison, WI), que forma un complejo estable con RNasas y RNasa inactiva a temperaturas de hasta 70 ° C durante al menos 15 minutos.

Para mejorar la eficiencia de la reacción RT incorporación y reducir los errores, la temperatura de la reacción RT puede mantenerse a 50 ° C [39, 40] en lugar de 42 ° C para evitar la formación de estructuras secundarias ARNm. Esto puede hacerse mediante el uso de termo-estable la transcriptasa inversa (ThermoScript ™ RNasa H-transcriptasa reversa, Invitrogen, Carlsbad, CA) o RTase regulares [41] en presencia del disacárido trehalosa [42 - 44]. Disacárido trehalosa no sólo puede mejorar la estabilidad de los termo-RTase pero también poseen termo-activación de las funciones. Esta modificación mejora enormemente la precisión y la eficiencia de la RT, con un impacto mínimo sobre la actividad de la ADN polimerasa [39]. La utilización de la proteína de unión de ADN T4gp32 (USB, Cleveland) en RT reacciones también mejora la síntesis de ADNc [40, 41, 45, 46]. T4gp32 proteína Mayo esencialmente contribuir a la eficiencia cualitativa y cuantitativa de la reacción RT mediante la reducción de las estructuras de orden superior de las moléculas de ARN y, por lo tanto, reducir la pausa sitios durante la síntesis de ADNc.

En Van Gelder y Eberwine Asistentes de la T7 ARN amplificación basada en [28], la cantidad de oligo dT-T7 primer utilizado en el primer capítulo de la síntesis de ADNc puede afectar a la amplificación de ARN en cantidad y calidad. El exceso de oligo dT-T7 en la reacción RT podría conducir a la plantilla de amplificación independiente [47]. Este fenómeno no se observa cuando la plantilla es cambiar de enfoque combinado para la transcripción in vitro (Wang, E. datos no publicados).

Doble varados cDNA (cDNA-ds) síntesis

Métodos de amplificación de ARN difieren de acuerdo a las estrategias utilizadas para la generación de cDNA-ds como plantillas para la transcripción in vitro o mediante amplificación por PCR. Hay dos estrategias básicas que han sido ampliamente validada y aplicada de alto rendimiento para el análisis transcripcional. La primera se basa en Gubler-Hoffman's [48]-ds cDNA síntesis optimizado posteriormente por Van Gelder y Eberwine Asistentes [28, 29]. Esta tecnología utiliza RNasa H digestión para crear cortos fragmentos de ARN como cebadores para iniciar el segundo capítulo de cDNA alargamiento bajo la DNA polimerasa I. Fragmentos de cDNA segundo capítulo se ligated los unos a los otros sucesivamente bajo E. Coli ligase de la DNA seguido por polishment utilizando T4 DNA polimerasa para eliminar bucles de forma tajante y fines. Amplificaciones sobre la base de este métodos han sido ampliamente utilizados en las muestras obtenidas en condiciones fisiológicas o patológicas y ampliamente validado por su fidelidad, reproducibilidad y linealidad en comparación con un ARN-amplificados de la misma fuente de materiales [29, 33, 47, 49 - 52].

La alternativa ds-cDNA planteamiento de síntesis de ARN retroviral recombinación utiliza como un mecanismo para cambiar de plantilla para generar toda la longitud ds-cDNA. El método fue inventado por completo la clonación con fines de cDNA de longitud y, por lo tanto, los principales objetivos de este método son undegredated transcripciones. Gubler Hoffman-ds-cDNA de la síntesis tiene la posibilidad de introducir sesgos debido a la amplificación de un posible 5 'insuficiente representación. Además, el escaso rigor de la temperatura ds-en el que se produce la síntesis de ADNc puede introducir sesgos adicionales [33]. Aunque 5 'en virtud de la representación podría, en teoría, ser superado por bucle horquilla de segunda línea de síntesis [53], las múltiples enzimas (4) utilizado en la reacción, a su vez, también podría causar errores.

Para garantizar la generación de larga duración-ds cDNA, [54] de síntesis se realiza aprovechando la terminal transferasa actividad intrínseca y la capacidad de cambiar de plantilla Moloney Murine Leukemia Virus RTase [55]. Esta enzima añade plantilla no nucleótidos en el extremo 3 'del primer capítulo de cDNA, preferentemente dCTP oligo nucleótidos. Una plantilla de cambiar de oligonucleótido (primer TS), que contiene una cadena corta de de los residuos en el extremo 3 'se añade a la reacción a anneal dC a la cadena de la nueva síntesis del cDNA. Esto produce una pendiente que permite la RTase para cambiar y ampliar la plantilla de cDNA dC más allá de la de crear un segmento de cDNA ds-duplex. Después del tratamiento con RNasa H para eliminar el ARNm original, el primer TS inicia la segunda varados síntesis cDNA por PCR. Desde la terminal de la actividad de la transferasa RTase se activa sólo cuando la síntesis de ADNc se completa, sólo de larga duración solo se varados cDNA de cola con el primer TS y convertido en ds-cDNA. El uso de la TS primer, segundo capítulo de la síntesis de ADNc se lleva a 75 ° C después de 95 ° C y una desnaturalización de 65 ° C recocido paso en la única presencia de la DNA polimerasa [35]. Esta técnica, en teoría, supera el sesgo generado por métodos de amplificación en función sólo el 3 'y, por tanto, la síntesis de nucleótidos es, en teoría, superior a la Gubler Hoffman-ds-la síntesis de ADNc. Sin embargo, no hay diferencias significativas en los coeficientes de correlación de amplificación de ARN amplificado versus no se observaron cuando el Gubler-Hoffman's ds-cDNA método se comparó con la TS-ds cDNA de amplificación de alto rendimiento utilizando el análisis [40, 56] La fidelidad de la plantilla basadas en conmutadores Métodos de amplificación ha sido evaluado por numerosos genes de perfiles de análisis sobre diferentes tipos de plataformas de microarrays, PCR en tiempo real y sofisticados análisis estadísticos, y ha sido bien aceptado para estudios de alto rendimiento transcriptome.

ARN amplificaciones
Objetivo para el etiquetado de cDNA microarray amplificado utilizando ARN

La generación de alta calidad cDNA microarray datos depende no sólo de cantidad suficiente y altamente amplificado representante blanco, sino también en el objetivo de etiquetado eficacia y reproducibilidad. Etapas de la preparación de las metas, como la amplificación de ARN, objetivo de etiquetado, pre-hibridación, la hibridación y el lavado de diapositivas son imprescindibles en la mejora de la señal frente al ruido de fondo ratios. Lineal espectro de la intensidad de la señal que se correlaciona con el número de copias de genes, sin tener que compensar la sensibilidad de detección es uno de los factores clave para el análisis de cDNA de alta calidad. Por lo tanto, el objetivo de etiquetado es un paso crítico para lograr constantemente imágenes de alta señal.

Normalmente, la etiqueta cDNA fluorescently-es generado por la incorporación de los análogos de nucleótido conjugados durante el proceso de transcripción inversa. Dependiendo del sistema de detección, la etiqueta puede ser cualquiera de los marcadores radiactivos, o de la matriz de color fluorescente. Florescence etiquetado supera a los otros métodos de etiquetado debido a la excitación y versátil longitud de onda de emisión. Además, tiene la ventaja de no ser peligrosos. Entre los fluorocromo, Cy3 (N, N8-(dipropyl)-tetramethylindocarbocyanine) y Cy5 (N, N8-(dipropyl)-tetramethylindodicarbocyanine) son los más usados en aplicaciones de cDNA microarray debido a sus diferentes emisiones (510 y 664 respectivamente). Cy5 etiquetados dUTP dCTP y son menos eficaces en la incorporación durante el etiquetado de reacción en comparación con Cy3 etiquetados o dUTP dCTP y son más sensibles a la foto de cloro debido a su estructura química. Por lo tanto, el sesgo de etiquetado debe ser analizado con precisión y los resultados deben ser normalizado de acuerdo a procedimientos estándar de normalización.

Objetivo de etiquetado se pueden dividir en dos categorías principales: la incorporación de fluorescencia directa e indirecta de fluorescencia incorporación. La primera categoría se utiliza fluorescencia de la etiqueta o dUTP dCTP a reemplazar parcialmente sin etiqueta dTTP dCTP o en la reacción RT-para generar Cydye etiquetados cDNA. Esta etiqueta incorporación método es adecuado para clon cDNA microarray aRNA amplificado utilizando como plantillas o oligo gama sRNA amplificado utilizando como plantilla.

Una limitación de etiquetado directo consiste en el hecho de que los nucleótidos fluorescentes no son los sustratos de las polimerasas normal y algunas pueden ser particularmente sensibles a la diversidad estructural de estos oligonucleótidos artificiales. El fluorescente fracciones asociados a estos nucleótidos son a menudo muy voluminosos y, por tanto, la eficiencia de la incorporación de tales nucleótidos por la polimerasa tiende a ser mucho menor que la de los sustratos naturales. Una alternativa es la de incorporar, ya sea por síntesis o por actividad enzimática, un análogo de nucleótidos similares a los naturales de nucleótidos en la estructura con un grupo químicamente reactivo, como 5 - (3-Aminoallyl) -2 '-deoxyuridine 5'-trifosfato (aa - DUTP), en que un tinte fluorescente, como Cydye, se puede adjunto [72]. La reacción de la amina aa-dUTP se pueden incorporar por una variedad de ARN-dependientes y ADN-ADN polimerasas dependientes. Después de la eliminación de libre nucleótidos, la aminoallyl la etiqueta junto a las muestras de tinte, purificado de nuevo, y luego se aplica a un microarray [73]. La proporción optimizada de aa-dUTP dTTP frente en el etiquetado de reacción debe ser de 2 a 3, respectivamente.

En teoría, indirectos supera a la reducción directa de etiquetado por parte de los gastos y aumentar al máximo la intensidad de la señal a través de aumentos de la incorporación de fluorocromo o por medio de amplificación de la señal de fluorescencia utilizando anticuerpos etiquetados o biotina-streptavdin complejos. Sin embargo, más pasos están involucrados en la depuración de la etiqueta meta antes de la hibridación que hacen de este estrategias de uso menos frecuente.

Protocolos de amplificación del ARN

Los protocolos que aquí se presentan son de uso habitual en nuestro laboratorio en respuesta a varias consultas de los investigadores interesados, el protocolo se basa en una combinación de las estrategias expuestas en la sección anterior que se han utilizado para la amplificación de ARN que hemos aplicado para optimizar RT-IVT siguientes El original Eberwine Asistentes protocolos de amplificación del ARN.

Material y reactivos

Diluir solución madre a la concentración de trabajo apropiadas.

DNTP mix solución (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 10 mM cada uno) (Pharmacia Cat # 27-2035-02)

Baja T dNTP (5 mM dA, y de dCTP, 2 mM dTTP)

RNasin Plus (20 unidades / μ l) (Promega Cat # N2611)

Advantage PCR buffer (cDNA Advantage vienen con la polimerasa)

La acrilamida Lineal (0,1 ug / μ l. Ambion; Cat # 9520)

Fenol: Cloroformo: alcohol isoamilo (25:24:1) (Boehringer Mannhem Cat # 101001)

Fase de bloqueo de gel (pesados) (5 prime a prime 3, Inc; pl-Cat # 188233)

7,5 M de acetato de amonio (Sigma; Cat # A2706)

DEPC tratados H 2 O

In Vitro Tanscription Kit (Ambion; T7 Megascript Kit # 1334)

Cy-dUTP (1 mM Cy3 o Cy5)

1 M NaOH

500 mM EDTA

1 × TE

1 M Tris pH 7,5

50 × Denhardt bloqueo de la solución (Sigma; Cat # 2532)

Poly dA 40-60 (8 mg / ml) (Pharmacia; Cat # 27-7988-01)

Cot I Humanos de ADN (10 mg / ml) (Invitrogen; Cat # 15279-011)

20 × SSC

10% SDS

T4gp32 proteína (8 mg / ul USB) (Cat # 74029Y)

Enzimas

RNasa H - MMLV la transcriptasa reversa (Superscript II) (200 unidades / μ l) (Invitrogen; Cat # 18064-071)

50 × Advantage cDNA mezcla Polimerasa (Clontech Cat # 8417-1)

RNasa H (2 U / μ l. Invitrogen; Cat # 18021-071)

10 × T7 RNA polimerasa combinación (dentro de la carpeta de Megascript)

Primers

Oligo dT-T7 cartilla (5 'AAA CGA CGG CCA GTG AAT AAT TGT ACG ACT CAC TAT CGC AGG T (15) 3') (0.125-0.25 μ g / μ l durante la primera ronda de amplificación dependiendo de la cantidad de insumos y de ARN total 0,5 μ g / μ l de la segunda ronda de amplificación) RNasa libre en el agua. Sintetizado cartilla debe ser purificado SDS-PAGE para asegurar la plena longitud. La concentración de la cartilla es variado de acuerdo a la materia prima utilizada. Esta secuencia promotora es mucho más largo que la secuencia definida por consenso y Studier Dunn (1983) y se puede comprar desde New England Biolabs y Stratagene Inc En el extendido de secuencia se muestra aquí, la secuencia de consenso se inserta en la región entre un 5'flanking Que proporciona espacio para la T7 RNA polimerasa de obligar a 3'-y un acompañamiento trinucleótidos que estimula la transcripción catalizada por la enzima.

TS cartilla (5 'AAG CAG TGG AGA TAA CAA CGC CGC GGG GTA 3') (0,25 μ g / μ l) SDS-PAGE purificada. Según el Chenchik de datos [74], ribouncleotide GGG en el extremo 3 'debe dar el mejor TS efecto en lugar de deoxinucleotide GGG. Hemos utilizado TS cartilla con dGGG en el extremo 3 'en múltiples experimentos y logró resultados satisfactorios. El importe del primer TS utilizado en el segundo capítulo de síntesis se puede variar según la cantidad de material de partida. Por regla general, utilizamos 0,25 μ g / μ l 3-6 cuando ug de RNA total utilizada y 0,125 μ g / μ l, cuando menos ARN total utilizado.

Random hexamer (dN 6) (8 μ g / μ l).

Columnas

Micro-Bio Spin Chromatograph columna (gel Bio-P-6) (Bio-Rad; Cat # 732-6222)

Microcon YM-30 columna (Millipore; Cat # 42410).

Purificación de amplificación de ARN
Segunda ronda de amplificación

Mix amplificado aRNA (0.5-1 μ g) en 9 ul DEPC H2O con 1 μ l (2 μ g / μ l) hexamer azar (es decir, dN6) y el calor a 70 ° C durante 3 min, enfriar a temperatura ambiente. Luego agregue los reactivos siguientes:

1. 4 μ l 5 × Primera línea de amortiguación

2. 1 μ l (0.5-1 μ g / ul) oligo-dT primer T7

3. 2 μ l 0,1 M TDT

4. 1 μ l RNAsin

5. 2 μ l 10 mM dNTP

6. 1 μ l Superscript II

42 ° C durante 90 min.

(Nota: Más de 1 ug de aRNA no es sugerido. Exceso de plantilla en IVT podría provocar la reacción de amplificación de llegar a una meseta de amplificación con la pérdida de linealidad. Azar primer Debido a utilizarse aquí, 42 ° C en lugar de 50 ° C es Utilizado)

A partir de aquí, siga el procedimiento descrito anteriormente para la segunda cDNA síntesis, la doble varados cDNA de limpieza. En la segunda IVT, 40 ul de la mezcla de reacción se IVT sugirió que se utilice en lugar de 20 ul. ARN aislamiento es seguido.

Objetivo para el etiquetado de la transcripción reversa

4 μ l primer capítulo de amortiguación

1 μ l dN6 cartilla (8 μ g / μ l)

2 μ l 10 × baja T - dNTP (5 mM A, C y GTP, 2 mM dTTP)

2 μ l Cy-dUTP (1 mM Cy3 o Cy5)

2 μ l 0,1 M TDT

1 μ l RNasin

3-6 μ g amplificado aRNA en 8 μ l DEPC H2O

Mezclar bien y calentar a 65 ° C durante 5 min luego enfriar a 42 ° C.

Añadir 1,5 μ l SSII. Incubar durante 90 minutos a 42 ° C. Añadir 2,5 μ l 0,5 M EDTA y el calor a 65 ° C durante 1 min. Añadir 5 μ l de NaOH 1 M e incubar a 65 ° C durante 15 min para hidrolizar ARN. Añadir 12,5 μ l 1 M Tris de inmediato para neutralizar el pH. Llevar el volumen a 70 μ l mediante la adición de 35 μ l de 1 × TE.

Nota: Los importes de aRNA utilizarse para el etiquetado depende del tamaño de la matriz. Si la serie 2000-8000 con los genes, 3 ug aRNA será suficiente mientras que un chip de mayor tamaño como los 16-20 k necesitará 6 ug de aRNA. La reacción de los componentes de etiquetado no necesita ser cambiado.

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