Journal of Carcinogenesis, 2005; 4: 16-16 (más artículos en esta revista)

Sulindac metabolitos inhibe del factor de crecimiento epidérmico activación de los receptores y de expresión

BioMed Central
Heather A Pangburn (heather.walczak @ uchsc.edu) [1], Hanna Kraus (hanna.kraus @ uchsc.edu) [3], J Dennis Ahnen (dennis.ahnen @ uchsc.edu) [2], Pamela L Rice (Pamela.rice @ uchsc.edu) [2]
[1] Molecular y Toxicología Ambiental Programa de Ciencias de la Salud, Departamento de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Colorado Health Sciences Center, Denver, EE.UU.
[2] Centro Médico de Administración de Veteranos, Denver, EE.UU.
[3] Departamento de Medicina de la Universidad de Colorado Health Sciences Center, Denver, EE.UU.
[4] Universidad de Colorado Comprehensive Cancer Center, Denver, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

El uso regular de los fármacos antiinflamatorios no esteroides (AINE) se asocia con una reducción de la mortalidad por cáncer colorrectal (CCR). AINE inducir apoptosis la muerte celular en células de cáncer de colon in vitro e inhibir el crecimiento de la mucosa colónica neoplásicas en vivo sin embargo, los mecanismos bioquímicos necesarios para estos efectos inhibitorios de crecimiento no están bien definidos. Hemos informado anteriormente de que los metabolitos de los AINE sulindac downregulate señal extracelular-quinasa regulada 1 / 2 (ERK1 / 2) de señalización y que este efecto es a la vez necesaria y suficiente para la apoptosis efectos de estos medicamentos. El objetivo de este proyecto es específicamente para probar la hipótesis de que sulindac metabolitos bloquear la activación y / o de la expresión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) receptor (EGFR).

Métodos

HT29 células humanas de cáncer de colon fueron tratados con EGF, solo o en presencia de sulfuro de sulindac o sulindac sulfona. Células lisados se analizaron por immunoblotting para fosforilados EGFR (pEGFR, pY1068), el total de EGFR, fosforilados ERK1 / 2 (pERK1 / 2), el total de ERK1 / 2, activan la caspasa-3, y α-tubulina.

Resultados

EGF inducida por el tratamiento rápido de fosforilación de ambos EGFR y ERK1 / 2 en células de cáncer de colon HT29. El pretratamiento con sulindac metabolitos durante 24 h bloqueado EGF inducida por fosforilación de los EGFR y ERK1 / 2 y la disminución de la expresión de la proteína total de EGFR. Bajo condiciones basales, downregulation de pEGFR y el total de EGFR se ha detectado ya en 12 h siguientes sulindac sulfuro de tratamiento y persiste a través de al menos 48 h. Sulindac sulfona inducida downregulation de pEGFR total de EGFR y se detectó ya a partir del 1 hy 24 h, respectivamente, a raíz de un tratamiento farmacológico, y persiste a través de al menos 72 h. EGFR downregulation por sulindac metabolitos se observó en tres diferentes líneas celulares de la CRC, se produjeron antes de la observada downregulation de pERK1 / 2 y la inducción de la apoptosis de estas drogas, y no era dependiente de la activación de la caspasa.

Conclusión

Estos resultados sugieren que la señalización de EGFR downregulation por sulindac metabolitos pueden ocurrir, por lo menos en parte, mediante la inhibición de la activación y expresión de EGFR. La inhibición del EGFR señalización puede dar cuenta de parte del crecimiento y quimioprotector efectos inhibitorios de estos compuestos.

Antecedentes

CCR es la segunda causa más común de muerte por cáncer en los EE.UU., con una incidencia anual estimada de 104950 y 56290 de la mortalidad en el año 2005 [1]. El riesgo de desarrollar CCR en la población general de EE.UU. es casi el 6% [1]. Medidas eficaces de prevención podría reducir tanto la incidencia como la mortalidad por CCR. Los AINE son uno de los más ampliamente estudiados y prometedores grupos de compuestos para la prevención del CCR.

AINE mediar sus efectos antiinflamatorios mediante la inhibición de la actividad enzimática de la ciclooxigenasa-1 (COX-1) y / o la COX-2. Sulindac es un AINE no selectivo que inhibe tanto la COX-1 y COX-2. Sulindac se metaboliza rápidamente en el hígado a dos metabolitos principales, 1) sulindac sulfuro, que es un activo AINE, y 2) sulindac sulfona, que no inhibe la COX la actividad enzimática y, por lo tanto no es un AINE. Un gran conjunto de pruebas de cultivo celular, modelo animal, humana epidemiológica y los estudios clínicos indican que los AINE, incluyendo la aspirina y el sulindac, han potente y quimioprotector chemoregressive propiedades contra el cáncer de colon [2, 3]. A pesar de pruebas fehacientes de que los AINE inhiben el crecimiento de la mucosa colónica neoplásicas, la biológica y mecanismos bioquímicos responsables de los efectos inhibitorios del crecimiento de estos fármacos no están bien definidos. El quimioprotector y chemoregressive efectos de los AINE no puede ser debido a la inhibición de la COX solas como hemos demostrado que el sulfuro de sulindac y sulindac sulfona ambos inhibir la fosforilación de ERK1 / 2 en HCT15 células que no expresan la COX-1 o la COX-2 [4 ]. Además, sulindac sulfona, el metabolito no de AINE sulindac, se ha demostrado, por nuestro laboratorio y otros, para inducir la apoptosis de las células cancerosas in vitro, prevenir la formación de tumores en modelos animales, y la causa de regresión de los adenomas en la poliposis adenomatosa familiar (PAF ) [2, 5].

Varios mecanismos biológicos para la quimioprotector efectos de los AINE se han propuesto incluyendo la inhibición de la proliferación, la inducción de la apoptosis y la inhibición de la angiogénesis. Nuestro laboratorio [5, 6] y otros [2], han informado de que los AINE inhiben el crecimiento de células en cultivo CRC principalmente por la inducción de la muerte celular apoptótica. Un mecanismo de apoptosis dijo también en humanos tratados con adenomas sulindac sulfona [7]. Nos han informado de que el efecto apoptótico de sulindac no depende de la inhibición de la COX [4, 5, 8], pero parece ser dependiente de la downregulation de ERK1 / 2 [8].

El trabajo de varios laboratorios ha demostrado interacciones importantes entre la bioquímica efectos de los AINE y de señalización EGFR. Está demostrado que la COX-2 es la expresión de la proteína estimulada por EGF y la disminución de los inhibidores de EGFR [9]. Sulfuro de sulindac y la indometacina inhiben TGF α inducida por la producción de prostaglandina y la incorporación de timidina RIE-1 en las células [10], y la indometacina, el ibuprofeno, la aspirina y los bloques de EGF inducida por Ca + + afluencia Caco-2 en células de cáncer de colon [11]. Además, la terapia de combinación de los AINE y los antagonistas de EGFR mostrar un efecto aditivo contra el desarrollo de tumores de colon in vivo [12] y dos estudios previos indican que los AINE podrían inhibir el EGFR señalización [13, 14]. Por último, sulindac ha demostrado inhibir la expresión de ErbB2/HER2 la expresión de la proteína en la mucosa rectal de los pacientes con PAF [15]. Los mecanismos bioquímicos por los que los AINE podrían modular la señalización EGFR no ha sido abordado en ninguno de estos estudios.

Anteriormente hemos demostrado que el sulfuro de sulindac y sulindac sulfona inhibir ERK1 / 2 fosforilación tanto basales y en respuesta a EGF [6], y que esta inhibición es suficiente [5] y [8] necesarios para la apoptosis efecto de estos medicamentos. El objetivo de este estudio fue específicamente probar la hipótesis de que sulindac metabolitos bloquear la activación y / o la expresión de EGFR (Figura 1]. Se presenta, por primera vez, que sulindac metabolitos bloque tanto basal como EGF inducida por fosforilación de EGFR y downregulate total de la expresión de la proteína EGFR. En conjunto, estos resultados identificar un nuevo objetivo para las acciones de sulindac y sugieren que la inhibición de la activación del EGFR puede ser un importante mecanismo bioquímico de la downregulation de ERK1 / 2 y la señalización quimioprotector actividad de los AINE.

Métodos
Reactivos

Medios de cultivo de células y suero fetal bovino (SFB) fueron adquiridos de Mediatech (Herndon, VA), antibióticos y solución antimicótico (penicilina / estreptomicina / fungizone) de Life Technologies, Inc (Grand Island, NY), el cultivo de tejidos y placas de los Halcones (Franklin Lakes, NJ). Primaria planteadas anticuerpos contra fosforilados ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204), el total de ERK1 / 2, y el total de EGFR se compraron desde Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA), la principal de anticuerpos contra fosforilados EGFR (Tyr1068), peroxidasa de rábano-conjugadas anti - Ratón y conejo anti-anticuerpos secundaria, y se compraron FEAG de Biosource (Camarillo, CA). Primaria de anticuerpos contra la caspasa-3 (reconoce ambos longitud completa caspasa-3 y productos) y cleaved caspasa-3 (sólo reconoce productos de la caspasa-3 activada resultantes de la división adyacente a Asp175) se obtuvieron a partir de células de Señalización de Tecnología (Beverly, MA ). Immobilon-P membranas se adquirieron de Millipore (Bedford, MA), quimioluminiscente visualización reactivos de NEN (Boston, MA), y de rayos X de la película de Pierce (Rockford, IL). Sulfuro de sulindac se LKT Laboratories Inc (St. Paul, MN). ZVAD-fmk (inhibidor de la caspasa I) y primaria de anticuerpos contra la α-tubulina se compraron de Calbiochem (San Diego, CA). Sulindac sulfona es un generoso regalo de Cell Pathways Inc (Horsham, PA).

Cultivo de células

HT29, Caco-2, y HCT116 células humanas de cáncer de colon se compraron de American Type Culture Collection (Manassas, VA). HT29 y HCT116 células se han mantenido en los medios de comunicación RPMI 1640 complementado con 10% de SFB y el 1% penicilina / estreptomicina / fungizone solución; Caco-2 en las células se han mantenido con los medios de comunicación MEDM 4 mM L-glutamina ajustado para contener 1,5 g / L de glucosa y complementada Con 0,01 mg / ml humanos de la transferencia, el 10% de SFB, y el 1% penicilina / estreptomicina / fungizone solución. Chapada y células fueron cultivadas en placas de cultivo de tejidos, tal como se especifica en la sección de resultados.

Morfológico cuantificación de la muerte de las células apoptóticas

Un bromuro de etidio / acridina naranja doble tinte morfológicas de ensayo [16] se utilizó para cuantificar la muerte celular de apoptosis inducida por sulindac metabolitos. Las células fueron cultivadas en múltiples platos y así dado el adecuado tratamiento de drogas. Tres días después del tratamiento, las células fueron cosechadas y manchado con una mezcla de 100 μ g / ml de bromuro de etidio y 100 μ g / ml acridina naranja y luego examinadas por microscopía de fluorescencia. Tres campos de cada 100 células fueron contadas y el número de células apoptóticas (según lo determinado por la morfología nuclear), así como el número de células necróticas de vida y se expresa como un porcentaje del total de células contadas.

Lisados de células y inmunotransferencia

En el momento de la cosecha, se raspó las células de los platos, lavar con helado buffer fosfato salino (PBS), y pildoradas en 2400 × g durante 5 min. Siempre que fue posible se mantenga como células fría como sea posible durante todo el procedimiento. Después de aspirar el sobrenadante, las células fueron lavadas dos veces con PBS frío y hielo se centrifuga. El pellet de células lisadas fue en la extracción de células buffer (10 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 20 mM Na 4 P 2 O 7, 2 mM Na 3 VO 4, 1 % Triton X-100, el 10% de glicerol, 0,1% SDS, 0,5% deoxycholate, 1 mM PMSF, 60 μ g / ml aprotinina, 10 μ g / ml leupeptina, 1 μ g / ml pepstatin) durante 30 min, en el hielo, con vortexing en Intervalos de 10 min. Lisados fueron luego se centrifuga a 18000 × g durante 10 minutos a 4 ° C, y sobrenadantes recogidos. Lisados de las concentraciones de proteína se determinó por el método de Lowry [17].

Lisado muestras (50 μ g de proteína total) fueron separados por dodecil sulfato de sodio-electroforesis en gel de poliacrilamida y electrotransferred noche a la mañana en Immobilon-P polivinilideno difluoride membranas. Inespecíficos vinculante fue bloqueada por inmersión en las membranas Tris-neutral con solución salina al 1% (w / v) seco de la leche y de 0,05% de Tween 20 durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego se incubaron con blots pEGFR, pERK1 / 2, caspasa 3, cleaved caspasa -3, O α-tubulina primaria de anticuerpos mecedora mientras que a 37 ° C durante 1 h. Inmunorreactivas proteína fue detectado por incubando blots con peroxidasa de rábano-anticuerpo secundario conjugado durante 1 h seguida de sustrato quimioluminiscente de 1 min. Membranas para probaron fosfato proteínas fueron despojados y reprobed con total EGFR o total de ERK1 / 2 anticuerpo primario seguido de peroxidasa de rábano-anticuerpo secundario conjugado como se ha descrito anteriormente. No fueron despojados de control blots correr para demostrar que este procedimiento stripping dio los mismos resultados que con cada blots primaria de anticuerpos. Inmunorreactivas proteínas se visualizaron por la exposición a la película radiográfica. Cuantificación de los niveles de proteína se determinó por densitometría usando un sistema de procesamiento de imágenes visuales (UN-SCAN-IT gel, la Ciencia Seda, Inc, Orem, UT).

Análisis Estadístico

Los datos fueron analizados por ANOVA de una manera utilizando un Newman-Keuls y prueba de comparación múltiple de significación estadística aceptado a la p <0,05 (GraphPad Prism 4,0, GraphPad Software Inc, San Diego, CA).

Resultados
EGF induce la fosforilación de EGFR y ERK1 / 2 en HT29 células humanas de cáncer de colon

Con el fin de verificar que se EGFR señalización intacta en nuestras células, los efectos del tratamiento de EGF en la expresión y la activación de EGFR y ERK1 / 2 en HT29 células humanas de cáncer de colon se examinó. Se observó que FEAG rápidamente inducido a> 7 veces más de pEGFR que fue máxima en 10 minutos (Figura 2A y 2B]. Del mismo modo, EGF inducida por una vía rápida,> 30 veces, el aumento de pERK1 / 2, que también fue el máximo en 10 minutos (Figura 2A y 2C]. EGF inducida por fosforilación de EGFR y ERK1 / 2 persistido a través de 60 minutos, y ya no se detectó a las 24 h (datos no presentados). Se obtuvieron resultados similares en HCT116 y Caco-2 de células humanas de cáncer de colon líneas (datos no presentados).

Sulindac metabolitos bloque EGF inducida por fosforilación de EGFR y ERK1 / 2, downregulate total de la proteína EGFR, inducir apoptosis y muerte celular

Estamos próximos determinado el efecto de sulfuro de sulindac sobre EGF inducida por fosforilación y la expresión de EGFR y ERK1 / 2. HT29 pretratamiento de las células durante 24 h con 40-160 μ M sulfuro de sulindac bloqueado la capacidad de EGF para inducir la fosforilación de EGFR en una manera dependiente de dosis. Total expresión EGFR y EGF inducida por fosforilación de ERK1 / 2 proteínas también se downregulated siguientes pretratamiento con sulfuro de sulindac (Figura 3]. No hubo efectos de las drogas o el tratamiento de EGF en el total de ERK1 / 2 de expresión.

El efecto de sulindac sulfona de EGF inducida por fosforilación de EGFR y ERK1 / 2 también fue examinado. Como se ha visto con el sulfuro de sulindac, HT29 pretratamiento de las células durante 24 h con 200-800 μ M sulindac sulfona reducido notablemente la capacidad de EGF para inducir la fosforilación de EGFR; total de los niveles de expresión EGFR y ERK1 / 2 fosforilación También se downregulated (Figura 4], aunque En menor medida que con el sulfuro de sulindac.

El hallazgo de que el total de la expresión de la proteína EGFR se redujo en metabolitos sulindac (Figuras 3 y 4] fue inesperada, por lo tanto, confirmó estos resultados utilizando un segundo anticuerpo (Biosource catálogo # AHR5062). El EGFR de confirmación de anticuerpos es un cóctel de anticuerpos EGFR (compuesto por cuatro anticuerpos monoclonales), ambas dirigidas contra los dominios extracelular y citoplasmática de EGFR. El mismo downregulation del total de EGFR suscitado por sulindac sulfuro y sulfona se encontró uso de este anticuerpo (datos no presentados), lo que confirma que estos resultados no son propios de un solo epítopo EGFR o consecuencia de un artefacto de la utilización de un solo anticuerpo.

FEAG no tuvo ningún efecto sobre morfológicos de la apoptosis o la activación de la caspasa-3, pero el tratamiento con 40-160 μ M sulfuro de sulindac (Figura 3] o de 600-800 μ M sulindac sulfona (Figura 4] apoptosis inducida sustancial de la muerte de las células, según lo determinado por la división de caspasa - 3 y confirmado con el naranja de acridina y bromuro de etidio morfológicas de ensayo (datos no presentados).

Sulindac metabolitos downregulate basal de fosforilación y expresión EGFR

Ahora vamos a examinar el curso temporal de los efectos de sulindac expresión de EGFR y de fosforilación en las células cultivadas en el 10% de SFB (condiciones basales). Fosforilación de EGFR y el total de la expresión de la proteína EGFR se downregulated ya en 12 h, y persiste a las 24 h siguientes sulindac sulfuro de tratamiento (Figura 5]. Downregulation significativo de pERK1 / 2, no se detectó antes de las 24 h en estos experimentos. Prueba de la apoptosis, por la presencia de caspasa-3 productos (Figura 5A] también se detectó por primera vez a las 24 h; examen de la morfología nuclear después de la tinción con naranja de acridina y bromuro de etidio a las 48 h confirmó cleaved caspasa-3 inmunoblot resultados (datos no presentados ). Sulindac sulfuro de tratamiento no había de influir en los niveles de total de ERK1 / 2 o α-tubulina proteínas. Para este experimento immunoblots tiempo para cada punto se ejecutan en distintos geles, por lo tanto, sólo las muestras en un solo punto de tiempo, análisis en busca de una proteína particular, se pueden comparar directamente.

El efecto de sulindac sulfona basal en la activación y expresión EGFR fue también examinado. Sulindac sulfona tratamiento dio lugar a una modesta pero significativa disminución de la fosforilación de EGFR ya a partir del 1 h después del tratamiento, y este efecto persiste a través de una mayor y 24 h (Figura 6A y 6B]. Downregulation total de EGFR (Figura 6A y 6C] y pERK1 / 2 (Figura 6A] proteínas fue visto a las 24 h; caspasa-3 división (Figura 6A] también se detectó por primera vez a las 24 h. Pruebas morfológicas de la apoptosis fue evidente a las 48 h, la fecha más próxima punto examinado de esta forma. Sulfona tratamiento no había de influir en los niveles de total de ERK1 / 2 o α-tubulina proteínas.

Para excluir la posibilidad de que downregulation de EGFR por sulindac metabolitos fue exclusivo de las células HT29, experimentos similares se llevaron a cabo en Caco-2 y células HCT116. Sulindac sulfuro y sulfona downregulated tanto pEGFR expresión de EGFR y total en estas líneas celulares, como así (datos no presentados).

ZVAD sulindac bloquea la apoptosis inducida, pero no EGFR downregulation

Aunque la downregulation de EGFR observó con sulindac metabolitos se produjeron antes de cualquiera de las pruebas bioquímicas o morfológicas de la apoptosis, es también posible que algunos de los EGFR disminución en la expresión de la proteína podría ser una consecuencia de la activación de la caspasa por sulindac metabolitos. Para examinar esta posibilidad, HT29 células fueron pretratadas con vehículo o 25 μ M, de la amplia especificidad ZVAD inhibidor de la caspasa-fmk (ZVAD) durante 60 minutos antes de comenzar el tratamiento con 600 μ M sulindac sulfona o vehículo durante 48 h. ZVAD pretratamiento completamente bloqueado sulindac sulfona apoptosis inducida, medido por el examen de la morfología nuclear (Figura 7A] y que impedía la división de caspasa 3 a la activa 17 y 19 kDa fragmentos (Figura 7B; los 20 kDa caspasa 3 fragmento observados con la combinación de sulfona ZVAD y ha demostrado ser un producto inactivo división [26 - 29]. Si bien 25 uM ZVAD impedido tanto la activación de la caspasa morfológicas y la apoptosis inducida por sulindac sulfona, no impedir sulindac sulfona inducida disminuye en total o pEGFR (Figura 7B - D]. Combinación experimentos con ZVAD y sulfuro de sulindac mostró resultados similares como los que se muestra en la Figura 7 para sulindac sulfona. Estos resultados demuestran que downregulation de EGFR por sulindac metabolitos no es una consecuencia de la apoptosis efecto de estos medicamentos.

Discusión

Nuestro laboratorio informó que originalmente sulindac metabolitos inhiben el EGFR / mitogen proteína quinasa activada (MAPK) / ERK1 / 2, vía de señalización en el plano de MEK o superior [5] (Figura 1] y que la downregulation de la mitogen-activated proteína quinasa quinasa ( MEK) / ERK1 / 2 es a la vez necesaria y suficiente para la apoptosis efecto de estos medicamentos [8]. Ahora informe, por primera vez, que sulindac metabolitos inhibe la fosforilación de EGFR y downregulate la expresión de la proteína total de EGFR en las células humanas de cáncer de colon. Downregulation de EGFR se produjo a las dosis y en un tiempo que es compatible con la posibilidad de que el efecto de las drogas sobre el EGFR podría ser el mecanismo de la inhibición de MEK1 / 2 y ERK1 / 2, la actividad y la muerte de la célula apoptótica inducida por estos medicamentos.

Ambos sulindac y sulfuro de sulindac sulfona downregulate EGFR expresión y de la fosforilación en dosis comparables a los que impiden que las ERK1 / 2 fosforilación inducir apoptosis y muerte celular (Figuras 5 y 6]. El curso temporal de experimentos sugieren que la cinética de los EGFR efecto puede variar entre las dos sulindac metabolitos. Con sulfuro de sulindac, el efecto sobre el EGFR y ERK1 / 2, se produjo simultáneamente (vistas por primera vez a las 12 h) y antes de cualquier efecto detectable sobre la apoptosis. Esto sugiere que la downregulation de EGFR puede ser responsable de algunos o la totalidad de la ERK1 / 2 efectos inhibitorios de la droga. La relación entre sulindac sulfona del efecto sobre EGFR y ERK1 / 2 no es tan clara, ya que un efecto sobre pEGFR se detectó sustancialmente anterior (1 hora) que el efecto sobre pERK1 / 2 y la apoptosis (24 horas). Estas diferencias en la cinética de los dos metabolitos en pEGFR sulindac y pERK1 / 2 downregulation podrían representar diferencias en la potencia, duración del efecto, el espectro de la fosforilación de EGFR sitios que se ven afectados por las diferentes drogas, efectos diferentes sobre las fosfatasas, y / o diferencias En el mecanismo molecular de acción. Similar a nuestros resultados, Jimeno et al. Informó de que HuCCT tratamiento de las células con el inhibidor EGFR de tirosina cinasa (TKI) o el erlotinib mononclonal anticuerpo cetuximab (MAb) dio lugar a importantes downregulation de pEGFR ya a partir del 1 h después del tratamiento mientras que los principales efectores (pERK1 / 2 y pAKT) no se Coordinadamente afectados [18]. A pesar de estas diferencias en la cinética, la conclusión de que EGFR downregulation se observó consistentemente con sulindac y metabolitos en tres diferentes líneas de células CRC (HT29, HCT116, y Caco-2) se establece el EGFR como un nuevo objetivo de sulindac.

La activación de la vía EGFR es particularmente común en los cánceres colorrectales [19 - 22] y la sobreexpresión de EGFR se correlaciona con la enfermedad más agresiva y mal pronóstico [23 - 26]. Ambos MAbs EGFR TKIs y que bloquean la activación de EGFR se utilizan en la actualidad para el tratamiento del cáncer colorrectal [27]. A la luz de nuestras pruebas de que los AINE downregulate EGFR señalización e inducir la apoptosis, es interesante observar que ambos MAbs EGFR TKIs y se ha demostrado importante para estimular los genes pro-apoptóticos y anti-apoptóticos downregulate genes, en particular los de la familia Bcl-2 [28 - 30]. Además, el tratamiento con combinaciones de agentes inhibidores de EGFR por diferentes mecanismos es más eficaz que el tratamiento con un solo agente. Por ejemplo, la combinación de erlotinib más cetuximab causado un efecto aditivo sobre la inducción de la apoptosis in vitro, y un efecto aditivo sobre el crecimiento tumoral in vivo arresto [18]. Así, downregulation de EGFR podría mediar la apoptosis y quimioprotector efectos de los AINE y podría explicar algunas de las pruebas clínicas de los efectos inhibitorios de crecimiento aditivo de los inhibidores de EGFR y los AINE. Estos datos sugieren una bioquímica justificación de la utilización de combinaciones de los clásicos y de los AINE inhibidores de EGFR en el tratamiento o prevención de la CRC.

Si la inhibición de la EGFR es un mecanismo de señalización de los AINE como indican nuestros datos, será de gran interés para examinar toda la gama de posibles consecuencias de downregulation de EGFR. Hasta ahora, sólo hemos examinado las ras-raf-MEK1/2-ERK1/2 brazo de señalización EGFR, pero varias otras vías de señalización son conocidas por ser activado por el EGFR incluido el fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3-K) y Janus Quinasa (JAK)-señal de transductores y activadores de la transcripción (STAT) itinerarios [31]. Sulindac metabolitos pueden afectar también a otros miembros de la familia de los receptores ErbB tirosina quinasas (RTK), incluyendo Erb2, ErbB3, ErbB4, no ErbB RTKs incluidos VEGFR y PDGFR, y / o receptores que carecen de actividad tirosina quinasa, como el receptor de la adenosina. Estudios para examinar el efecto de los AINE en estos trayectos y los receptores están en marcha.

No hemos examinado sistemáticamente el mecanismo por el cual sulindac metabolitos downregulate EGFR pero el tiempo relativamente breve curso (ya en 1 hora) sugiere que el efecto es más probable debido a una mayor degradación de EGFR en lugar de la inhibición de la síntesis de proteínas nuevas. Nuestros datos demuestran que la inhibición del EGFR no es una consecuencia de la activación de la caspasa o debido a la apoptosis efectos de las drogas en la apoptosis que se detectó por primera vez después de 24 h de tratamiento sulindac metabolito, mientras que downregulation de EGFR se consideraba ya a partir del 1 a 12 horas después de las drogas Tratamiento. Además, la inhibición de la apoptosis con la amplia especificidad ZVAD inhibidor de caspasas no impidió EGFR downregulation por sulindac metabolitos. Por lo tanto, postula que el EGFR downregulation por sulindac metabolitos no se debe a la activación de las caspasas, sino más bien es resultado de una mayor proteasomal y / o la degradación lisosomal. Necesario emprender nuevos estudios para determinar el mecanismo exacto de EGFR downregulation por sulindac metabolitos.

Sulindac metabolitos disminuido tanto expresión de las proteínas totales y pEGFR. El curso temporal de experimentos, en particular los que tienen sulindac sulfona (Figura 6], sugieren que la downregulation de estas dos formas del receptor podría estar ocurriendo por distintos mecanismos. Aunque total y pEGFR downregulation con sulfuro de sulindac ocurrieron simultáneamente, el metabolito sulfona pEGFR disminuido ya a partir del 1 h downregulation mientras que del total de la proteína EGFR fue observado por primera vez en el punto 24 h tiempo. Esta secuencia indica que la downregulation de pEGFR no es probable que sea consecuencia de la downregulation de los receptores de la total, por lo menos con sulindac sulfona.

Conclusión

En resumen, hemos descrito por primera vez que sulindac metabolitos downregulate EGFR y prevenir la fosforilación de EGFR EGF. Este efecto puede explicar, al menos en parte, nuestra observación anterior de que estos fármacos inhiben basal y EGF inducida por la activación de MEK / ERK brazo de la vía de señalización del EGFR. Downregulation de EGFR se demostró ser independiente de la COX actividad inhibitoria como lo ocurrido con sulindac sulfona. Estos resultados se suman a la creciente cantidad de datos que sugieren que existen interacciones entre los efectos de los AINE y de señalización EGFR [13, 14]. Nuestros resultados son los primeros que sugieren que estas interacciones se debe a un efecto directo de drogas en el EGFR.

Abreviaturas

AINE, no esteroides anti-inflamatorio; CRC, el cáncer colorrectal; ERK1 / 2, la señal extracelular-quinasa regulada; EGF, factor de crecimiento epidérmico, EGFR, receptor del factor de crecimiento epidérmico; pEGFR, fosforilados receptor del factor de crecimiento epidérmico; pERK1 / 2, Fosforilados señal extracelular-quinasa regulada 1 / 2; COX, ciclooxigenasa; FAP, la poliposis adenomatosa familiar; FBS, suero bovino fetal; PBS, buffer fosfato salino; MAPK, mitogen-activated proteína quinasa; MEK1 / 2, mitogen-activated proteína quinasa quinasa ; MAb, anticuerpo monoclonal; TKI, inhibidor de tirosina quinasa; PI3-K, fosfatidilinositol-3-quinasa; JAK / STAT, Janus kinasa / señal de transductores y activadores de la transcripción; RTK, los receptores de tirosina quinasa

Agradecimientos

La financiación proporcionada por el Departamento de Asuntos de Veteranos de Mérito y Examen del Programa de Investigación y Prevención del Cáncer de la Fundación