Immunity & ageing : I & A, 2005; 2: 11-11 (más artículos en esta revista)

Proteoglicanos heparán sulfato induce la producción de NO y TNF-α por murino microglia

BioMed Central
Simona Bussini (clinneur@unimi.it) [1], Lucía Meda (clinneur@unimi.it) [1], Elio Scarpini (elio.scarpini @ unimi.it) [1], Emilio Clementi (clementi.emilio @ hsr. It) [2], Giancarlo Conti (clinneur@unimi.it) [1], Marco Tiriticco (marco.tiriticco @ libero.it) [1], Nereo Bresolin (nereo.bresolin @ unimi.it) [1], Pierluigi Baron (pierluigi.baron @ unimi.it) [1]
[1] Departamento de Ciencias Neurológicas, el Centro de Excelencia en Enfermedades Neurodegenerativas y "Dino Ferrari" Centro de la Universidad de Milán, IRCCS Fondazione "Ospedale Maggiore Policlinico, Mangiagalli e Regina Elena", Via F. Sforza 35, 20122 Milano, Italia
[2] Depto preclínicos Ciencias de la Universidad de Milano, 20157 - Milano y el Instituto Científico E. Medea 23842 - Bosisio Pasini, Italia

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Resumen
Antecedentes

Una característica común de la enfermedad de Alzheimer (EA) es la patología de la abundancia de microglia activada en neuritic placas que contengan la proteína beta-amiloide (A β) y de las moléculas incluidas proteoglicanos heparán sulfato (HSPG). Además de la función de acompañante favoreciendo amyloidogenesis patológico, se sabe poco acerca de si puede o no inducir HSPG activación microglial. Culturas de primaria microglia murino se utilizaron para evaluar el efecto de HSPG en la producción de moléculas proinflamatorias que se sabe que están presentes en neuritic placas de la EA.

Resultados

HSPG estimulado sobre regulación del factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α), la producción de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) mRNA y la acumulación de la proteína TNF-α y nitrito (NO 2 -), en un tiempo-y de manera dependiente de la concentración . Los efectos de HSPG se debieron principalmente a la propiedad de la proteína básica a lo indicado por la falta de microglial acumulación de TNF-α y NO 2 - en respuesta a denaturated HSPG o GAG cadenas de heparán sulfato (HS).

Conclusión

Estos datos demuestran que HSPG crónica puede contribuir a la activación microglial y neurodegeneración observado en neuritic placas de la EA.

Introducción

Las placas seniles en la enfermedad de Alzheimer (EA) del cerebro se caracteriza por la presencia de un núcleo consistente de amiloide fibrilar A β, rodeada de una corona de distrófico neurites y activado microglial células. Microglia reactiva en libertad una variedad de compuestos potencialmente neurotóxicos, incluyendo citoquinas y radicales libres. Muchos grupos de investigación han proporcionado pruebas de que la deposición de β es un agregado que participan en el proceso inflamatorio crónico que se forman en las placas seniles de la EA cerebro [1, 2].

A β es un 39 - a 42-amino-ácido péptido que surge de procesamiento proteolítico de la proteína precursora amiloide (APP) [3, 4]. El péptido β A que se encuentra en las placas seniles y los depósitos cerebrovascular existe como un agregado de multímeros con una apariencia fibrilar [5]. Varias otras moléculas también se han mostrado estar asociados con un β depósitos, y los estudios in vitro de fibrilogénesis sugieren que pueden ser importantes en la acumulación y persistencia de la A β fibrillas in vivo. Estos incluyen la apolipoproteína E, laminina, la acetilcolinesterasa, α 1-antichymotrypsin y proteoglicanos heparán sulfato (HSPG) [6 - 11].

HSPG multifuncional es una macromolécula caracteriza por un polipéptido básico a la que glicosaminoglicanos (GAG) están covalentemente adjunto. Hay por lo menos cuatro diferentes clases de HSPG presente en AD, que o bien están asociados a la membrana celular o con la matriz extracelular [12]. HSPG se ha asociado con tanto difusa y placas neuritic [13, 14]. Su temprana presencia en la AD alteraciones patológicas, así como su inmunohistoquímica colocalización con todas las variedades de A β placas, independientemente de su etapa de maduración, han sugerido que HSPG podría desempeñar un papel activo en la formación de la placa. En este sentido se ha propuesto que facilita HSPG A β deposición y / o promueve un β persistencia de la inhibición de los mecanismos de liquidación, por lo tanto, aumentar la formación de depósitos en un β AD [15]. De acuerdo con esta hipótesis, los estudios in vitro han demostrado que HSPG puede unirse con alta afinidad a un β, así como a la política de asociación activa y protege A β de la degradación de la proteasa [16 - 19].

Además de su función en amyloidogenic vías, HSPG podría contribuir a la patogénesis AD también a través de la activación microglial de las células. Esta posibilidad nunca ha sido investigado. Para este estudio hemos evaluado en el "in vitro" de las culturas microglial células de ratón, dos conocidos de sus marcadores de activación, es decir, la producción de la citoquina proinflamatoria factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y la expresión de mRNA para el nítrico inducible Óxido (NO) sintasa (iNOS). Esta enzima se genera en la microglia en respuesta a una variedad de citoquinas pro-inflamatorias y productos bacterianos, tales como lipopolisacárido (LPS). Además, hemos medido en los medios de cultivo sobrenadantes la acumulación de NO 2 -, un buen indicador de la generación de NO por iNOS. Nuestros resultados muestran que HSPG podría contribuir a la neurodegeneración en neuritic placas de AD también a través de la activación microglial de las células y el consiguiente aumento de la respuesta inflamatoria.

Materiales y métodos
Reactivos

Proteoglicanos heparán sulfato (HSPG), heparán sulfato (HS), lipopolisacárido (LPS, de Escherichia coli 026.B6) fueron adquiridos a Sigma (St Louis, MO, EE.UU.) y se disuelven en clínica pirógeno libre de H 2 O. Los niveles de endotoxina en HSPG SA y las existencias se mide por E-TOXATE (Limulus Amebocyte Lisado, LAL) kit comprado a Sigma (St Louis, MO, EE.UU.).

Preparación de las culturas Microglial

Los ratones fueron obtenidos de Charles River Laboratories, Inc (Wilmington, MA, EE.UU.) y se utilizan de acuerdo a las directrices institucionales que se encuentran en cumplimiento de la nacional (DI no. 116, GU supl. 40, feb 18, de 1992, Circular N º 8, GU, 14 Luglio 1994) y en el derecho internacional y las políticas (Directiva 86/609 CEE del Consejo, DO L358, 1 12 de diciembre de 1987; Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Consejo Nacional de Investigaciones de EE.UU., 1996). Primaria murino microglial culturas fueron preparados como ha sido descrito previamente [20]. En pocas palabras, las células de la corteza cerebral día 1 de edad, los ratones se disocian con tripsina 0,25% y 0,1% DNAse (Sigma) y chapada en 75 cm 2 frascos cultura (Corning, Acton, MA) en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (MEDM) (Invitrogen Corporation Grand Island, NY, EE.UU.) con 10% de SFB inactivado por calor (Invitrogen Corporation Grand Island, NY, EE.UU.) y 100 μ g / ml de gentamicina (Invitrogen Corporation Grand Island, NY, EE.UU.). Disociarse gliales culturas se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO 2 y medio se repusieron 4 días después de galvanoplastia. El día doce de la cultura, frascos fueron sacudidos por 2 horas. Los medios de cultivo sobrenadante (que contiene predominantemente microglia y oligodendrocitos) son recogidos y luego las células se chapada en ninguno de los dos 96-así placas de tejido (Nunc, Roskild, DK) a una concentración de 4 × 10 4 células por cada 100 μ l por pocillo, o en 48-tejido de las placas también en una concentración de 25 × 10 4 por 500 μ l por pocillo, y se mantiene a 37 ° C con 5% de CO 2 por 1 hora. Poco adherente oligodendrocitos fueron retirados de las culturas por suave temblor de la cultura platos a mano. Después de verter frente a la cultura de los medios de comunicación sobrenadante (que contiene oligodendrocitos), el adherente microglia se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO 2, para su posterior tratamiento. La pureza de las culturas microglial fue sistemáticamente evaluada por tinción con el F4/80-antibody (Serotec, Oxford, Reino Unido), la que se reconoce una glicoproteína expresada predominantemente en microglia / macrófagos células [21], y que se encuentran en el rango de 96 -- 98% de células en todos los preparativos.

La exposición de microglia a HSPG

Microglial células fueron incubadas con HSPG en una concentración de 5, 15, 30, 40 μ g / ml para 2, 4, 12, 24 y 48 h. Después de los tiempos indica, la cultura sobrenadantes se cosecharon, y congelado a -70 ° C hasta el análisis en busca de los niveles de TNF-α secretado y nitrito (NO 2 -). Después de 4 h para cada ARN total fue aislado de las condiciones de las celdas de plata de 48-en el cultivo de tejidos y los platos, utilizando el reactivo TRIzol protocolo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). En algunos experimentos con células fueron expuestas a 15 μ g / ml de SA o HSPG denaturated a 90 ° C durante 10 min. Después del tratamiento indicado en ocasiones, medios de cultivo sobrenadantes se analizaron para el NO 2 - acumulación y liberación de TNF-α como se describe a continuación.

TNF-α ensayo

Antigénica ratón TNF-α se detectó por ELISA sistema de Biosurce (Camarillo, CA, EE.UU.), y basado en el cuantitativo "sándwich" la técnica de inmunoensayo enzimático. La sensibilidad del ensayo fue de 10 pg / ml.

Nitrito de ensayo

Nitrito (NO 2 -) es un producto final estable utilizado ampliamente como un indicador de la producción de NO por las células cultivadas. En nuestras condiciones experimentales, NO 2 - acumulación fue ensayada por la reacción de Griess, de acuerdo con el método descrito previamente [22]. En pocas palabras, la cultura los medios de comunicación se mezclaron con cantidades iguales de reactivo de Griess (p-aminobenzene sulfonamidas 1%, naphtylethylenediamide 0,1% en ácido fosfórico 2,5%) en placas de 96 pozos: las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente durante 10 minutos, y posteriormente se absorbancia Leer a 540 nm utilizando un lector de microplacas. NO 2 - concentraciones fueron calculadas de acuerdo con un estándar de la curva de nitrito de sodio.

RT-PCR

Un total μ g ARN su cuantificación por espectrofotometría y aislado de cada una de las condiciones era invertir transcritas utilizando oligo (dT) 20-primers y Superscript II-la transcriptasa reversa de acuerdo con el protocolo del manifacturer (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). C-ADN equivalente a 20 ng de ARN total fue objeto de posteriores análisis de PCR en un volumen total de 30 μ l que contiene 25 pmol de primers específicos para TNF-α, iNOS y glyceraldehyde fosfato deshidrogenasa (GAPDH; utilizado como control interno) (Cuadro I], 10 mM Tris-HCl pH 8.3 (a 25 ° C), 50 mM KCl, 10% DMSO, 1,25 mM MgCl 2, 250 μ M de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP, y 1,5 unidades de AmpliTaq ADN-polimerasa ( Roche, Branchburg, NJ, EE.UU.). PCR se realizó en las siguientes condiciones: (1) 2 min a 93 ° C, (2) 30 segundos a 93 ° C, 30 segundos a 60 ° C (TNF-α), o al 68 ° C (iNOS y GAPDH), 45 seg a 72 ° C durante 26 ciclos (iNOS), 24 ciclos (TNF-α) y 20 ciclos (GAPDH), (3) 10 min. A 72 ° C. Productos de PCR se analizaron en gel de agarosa al 1,5% que contiene 10 μ g / ml de bromuro de etidio. Los controles incluyen ARN sometido a la RT-PCR procedimiento sin adición de la transcriptasa inversa y PCR realizados en ausencia de c-ADN que siempre yelded resultados negativos.

Análisis estadístico

Los datos son expresados como medias ± desviación estándar (SD). Evaluación estadística se realizó con medidas repetidas ANOVA (análisis de varianza), seguido por el test de Dunnet para determinadas comparaciones. Significación estadística se estableció en p <0,05.

Resultados
1. HSPG desencadena la producción de NO 2 - y TNF-α cultivadas en microglia

Para probar si la interacción de HSPG con microglia podría inducir la producción de proinflamatorias y mediadores potencialmente citotóxicos, que ensayaron la acumulación de NO 2 - como una medida indirecta de la producción primaria de ratón microglia estimulado con HSPG y, por comparación, con LPS. Como se muestra en la Fig. 1, microglia en condiciones de reposo no detectables liberación de NO 2 - incluso después de 48 h de incubación, mientras que HSPG inducida importante acumulación de NO 2 - sobrenadantes en medios de cultivo en el rango de la observada con LPS. El efecto de HSPG en NO 2 - había llegado el momento de producción y dependiente de la concentración, con la máxima acumulación observó a las 48 h (7,5. ± 0,5 veces más que en el control de 30 μ g / ml HSPG; P <0,05, n = 9) ( Fig. 1A] y la producción ya aumentó significativamente después de las 24 h de exposición a 15 μ g / ml (5,2 ± 0,4 veces más que el control, P <0,05, n = 9) (Figura 1B]. También investigó si HSPG o no fue capaz de inducir la producción de TNF-α por microglia. En ausencia de tratamiento, las células producen constitutivamente muy pequeñas cantidades de TNF-α, mientras que su estimulación con LPS o HSPG resultó en la liberación de importantes niveles de TNF-α, con la máxima acumulación observó a las 4 h (25 ± 1,8 veces más que el control, P < ; 0,05, n = 9), seguido por una disminución en tiempos posteriores (Figura 2A]. Concentración-respuesta, se demostró que la cantidad de TNF-α liberado en el medio de cultivo sobrenadantes aumentó con el aumento de las concentraciones de HSPG (Figura 2B]. TNF-α liberación ya era significativamente mayor después de las 24 h de exposición a 15 μ g / ml HSPG (11,6 ± 0.85.-veces más que el control, P <0,05, n = 9). La especificidad de los efectos de HSPG en la activación microglial fue confirmado por la prueba LAL que traza excluidos de los niveles de endotoxina en nuestro HSPG existencias.

2. HSPG induce la expresión de iNOS y TNF-α mRNA cultivadas en microglia

Para determinar si la producción de NO 2 - y TNF-α HSPG refleja provocada por la inducción de la iNOS y TNF-α mRNA, la RT-PCR se realizó un análisis sobre la microglia total de RNA, utilizando sondas complementarias al ratón macrófagos iNOS y TNF-α codificación Secuencias. En condiciones de reposo la expresión de iNOS mRNA y TNF-α en microglia estaba ausente. Por el contrario, los niveles de ARNm de iNOS y TNF-α fueron claramente inducida después de la estimulación de las células de 4 h con HSPG en la concentración de 15 μ g / ml o de 100 ng / ml LPS (Fig. 3].

3. Microglial activación inducida por HSPG está mediada principalmente por la proteína básica

Para examinar si la proteína GAG básico o el de HSPG participan en la mediación de la activación microglial, los efectos de HSPG se compararon con los obtenidos mediante HSPG denaturated a 90 ° C durante 10 min (HSPG-hd) o cadenas HS-GAG (SA) . Como se muestra en la Fig. 4, la exposición de microglia a 30 μ g / ml HSPG-hd abolido casi por completo la producción de NO 2 - (1 ± 0,2 μ m, P <0,05, n = 9) y, en particular, de TNF-α (98 ± 10 pg / ml, n = 9). Estimulación con 30 μ g / ml HS sólo ligeramente afectado liberación de TNF-α (200 ± 18 pg / ml, p <0,05, n = 9), pero no a la acumulación de NO 2 - (0,8 ± 0,1 μ m, n = 9). La falta de capacidad de HSPG-hd SA y de mantener el NO 2 - acumulación y liberación de TNF-α parece estar mediada en el nivel transcripcional desde HSPG-hd SA y no al aumento de la iNOS y TNF-α mRNA transcripción (Fig. 5 ).

Discusión

La identificación de las placas seniles patológica de los estímulos que pueden conducir a la activación microglial representa una de las cuestiones importantes de la investigación inmunológica en AD. Estudios anteriores han demostrado que la microglia a la estimulación con un β puede producir proinflamatorias y mediadores citotóxicos, y que estos juegan un papel de mediadores en la patogénesis de la EA [23 - 26]. La demostración indirecta de la lesión neuronal, nos llevó a investigar si, además de un β, otras moléculas presentes en las placas seniles, podrían estar involucrados en mecanismos similares de la activación microglial. Hemos identificado HSPG como posible candidato en este proceso sobre la base de que esta molécula ha demostrado ser asociados con un péptido β-y sugirió que contienen depósitos de actuar como acompañante patológica, el aumento de β-plegadas dentro de una estructura β [27, 28].

Estamos HSPG demostrar que es capaz de inducir la liberación de NO 2 - y TNF-α por culta primaria murino microglia. Mediante la evaluación de iNOS y TNF-α mRNA expresión con RT-PCR también hemos demostrado que la liberación de NO y TNF-α en HSPG estimulada microglial células se debe a la inducción de la iNOS y TNF-α la expresión de los genes. Estos resultados sugieren que, además de un β, HSPG también se puede activar la microglia con la producción de moléculas proinflamatorias que se sabe se hallan en el cerebro de pacientes con EA.

El mecanismo exacto por el cual las células neuronales microglia mediar lesión en AD es no del todo comprendidas y varios mediadores que se han propuesto, entre ellos el NO y TNF-α [29 - 31]. A pesar de los niveles fisiológicos de la NO pueden influir en la eficacia sináptica de neurotransmisor que regula la liberación [32], el exceso de NO puede causar la degeneración neuronal mediante la combinación de radicales de oxígeno, tales como anión superóxido para formar el peroxinitrito altamente tóxicos de iones [33]. Del mismo modo, TNF-α ha informado de que se trófico de las neuronas del hipocampo de rata [34]. Sin embargo, los ratones transgénicos que sobreexpresan TNF-α exibit inflamación severa y neurodegeneración [35]. Por otra parte, estudios in vitro han demostrado que algunas A β-microglial inducida por las actividades, incluyendo la producción de quimioquinas y neurotoxicidad, están mediadas a través de la liberación endógena de TNF-α [23, 36, 37]. Que TNF-α es presumiblemente involucrados en la patología AD es también con el apoyo de sus niveles elevados en el suero, LCR y la corteza cerebral de pacientes con EA [38, 39]. En vista de la información que se resume más arriba, es concebible que la generación de NO y TNF-α microglial de las células es un medio por el que puede mejorar HSPG la reacción inflamatoria en neuritic placas, y por lo tanto la patogénesis de la EA. Sin embargo, hay que señalar que astrocitos representan la principal fuente de NO en las placas que la liberación de los niveles de NO neurotóxicos por microglia se ha demostrado in vitro [40, 23, 24, 41]. Futuros estudios serán necesarios para determinar si HSPG astrocitos también se activa para producir NO y TNF-α.

La falta de la inflamación y la activación microglial se describe en el difuso placas abre la pregunta sobre el real papel desempeñado por proinflamatorias HSPG en las primeras etapas de evolución de la placa. Nuestros resultados muestran que la activación microglial de las células por HSPG depende de la concentración, tanto en términos de NO 2 - acumulación y liberación de TNF-α en el medio de cultivo, y que el 15 μ g / ml del compuesto es suficiente para desencadenar el proceso de activación. Aunque HSPG se ha localizado a immunohistologically placas seniles su bioquímica aislamiento de estas estructuras, y por lo tanto su cuantificación, aún no se han realizado [42]. Por lo tanto, no podemos establecer si en la actualidad el umbral de activación microglial encontramos puede explicar las discrepancias en la localización inmunohistoquímica de HSPG en placas difusas que carecen de la inflamación.

La fuente de HSPG celular en el cerebro de mamíferos está representada por astrocitos y microglia, que se ha demostrado por inmunofluorescencia y / o Western Blot para expresar HSPG tanto in vitro como in vivo [43, 44]. Sin embargo, los factores implicados en la biosíntesis HSPG y deposición han sido poco investigados. Recientemente regulación de la HSPG por lesión y la IL-1 α se ha demostrado en astrocitos y microglia [45]. Por lo tanto, la estimulación de las células microglial por HSPG, seguido por el aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias podría estimular aún más la formación de HSPG en un autocrina, feed-forward.

La importancia de la deposición en HSPG AD patogénesis es apoyado por el hecho de que se une una HSPG β, acelera la formación de un β fibril y mantiene un β fibril estabilidad [46]. La mayoría de estos efectos de la HSPG han demostrado ser debido a sus asociados HSGAG secundarios cadenas, como sugirió también la falta de un extracelular β depósitos en ratones transgénicos overexpressing HSPG proteínas básicas [47]. Esto contrasta con nuestros resultados muestran que el papel de HSPG proinflamatorias es principalmente de proteínas mediada por su núcleo. Sin embargo, en estos ratones transgénicos HSPG se detectó sólo dentro de las células, es decir, sin acumulación de los compuestos en el medio extracelular, que es un sello en lugar de AD neurodegeneración. Los estudios realizados en estos animales, por lo tanto, no permiten sacar conclusiones acerca del papel de extracelular HSPG en AD.

En conclusión, la posible participación de HSPG en NO y TNF-α-mediado lesión neuronal inducida por la microglia añade una nueva función biológica de esta molécula en la patogénesis de la EA. Estos datos indican que HSPG inmunomoduladores desempeña un papel en la activación de la microglia, además de la que se propone en amyloidogenic vías y demostrar otro mecanismo por el cual la respuesta inmune puede activar de AD en el cerebro. Por lo tanto, una mayor comprensión de la función de HSPG en la patogénesis de la EA ayudaría en el desarrollo de racional, orientada estrategias terapéuticas para combatir esta enfermedad neurodegenerativa.

Agradecimientos

Damos las gracias al apoyo financiero de la MANAD proyecto de la Comunidad Europea y de "Ricerca Finalizzata Alzheimer 2000", del Ministerio italiano de Sanidad.