Journal of Negative Results in Biomedicine, 2005; 4: 5-5 (más artículos en esta revista)

Insatisfactorio la transferencia de genes en el hueso-resorbing osteoclastos liposomal con sistemas de transfección

BioMed Central
Tiina Laitala-Leinonen (tilale@utu.fi) [1]
[1] Instituto de Biomedicina, del Departamento de Anatomía de la Universidad de Turku, Turku, Finlandia

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Resumen
Antecedentes

- Bone resorbing osteoclastos son células multinucleadas que se forman a través de la fusión de sus células madre hematopoyéticas. Muchos de los detalles de la formación de osteoclastos, y la activación de la motilidad no se han resuelto. Por lo tanto, hay un interés entre los biólogos hueso a la terminal transfect diferenciadas osteoclastos y siga sus respuestas a los transgenes in vitro. Graves dificultades en el gran transfecting, adherente osteoclastos se ha tropezado, sin embargo, con lo que la utilización de modernas herramientas de la biología celular en la investigación osteoclastos desafiante. Transfección de los osteoclastos maduros no por los sistemas de transferencia de genes virales no ha sido reportado.

Resultados

Hemos examinado sistemáticamente la utilidad de varios sistemas comerciales de transfección de ADN humano en los osteoclastos y sus precursores cultivos de células mononucleares, y comparó la eficacia de transfección de ADN adenoviral transfección. Ninguno de los liposomas o endosoma basada en la interrupción de los sistemas de inducción podría inducir EGFP-actina expresión en terminales diferenciadas osteoclastos. En cambio, una masiva muerte celular por apoptosis se encontró con todas las concentraciones y liposomas / ratios prueba de ADN. Mejor eficiencia de transfección fueron obtenidos por adenoviral gen entrega. Marginal transfección de ADN se obtuvo con sólo añadir el ADN de la célula medio de cultivo. Cuando la médula ósea-CD34-positivos derivados de células precursoras fueron transfectadas, algunas de las buenas prácticas agrarias expresión se encontró, a más tardar, 24 horas después de transfección. Un gran número de células apoptóticas y los que se encontraron células que se mantuvo con vida, no se forma cuando los osteoclastos cultivadas en la presencia de RANKL y M-CSF, los reguladores clave de la formación de osteoclastos. En comparación, adenoviral gen entrega dio lugar a la transfección de células CD34-positivo de las buenas prácticas agrarias que se mantuvo positivo durante un máximo de 5 días y permitió la formación de osteoclastos.

Conclusión

Osteoclastos y sus precursores son sensibles a los sistemas de transfección liposomal, que inducen la apoptosis osteoclastos. La transferencia de genes a los precursores de los osteoclastos mononucleares o diferenciadas osteoclastos no es posible con cualquiera de los sistemas comerciales transfección probado. Osteoclastos son no dividir, adherente células que son difíciles de crecer como confluente culturas, que pueden explicar los problemas con los reactivos de transfección. Un gran número de v α β 3 integrina en la superficie de los osteoclastos y permite a la infección por adenovirus endocitosis producto en la división y la no división de las células de manera eficiente. Entrega de genes virales, por lo tanto, es actualmente el método de elección de los osteoclastos transfección.

Antecedentes

Osteoclastos son células óseas-resorbing que son altamente polarizada cuando fisiológicamente activa [1]. Su mononucleares precursores hematopoyéticos son en origen, y no adherentes permanecen en la cultura hasta que diferenciar más lejos de la multipotent linaje celular [2, 3]. Monocitos, los macrófagos y osteoclastos derivan de las mismas células precursoras [4]. Multinuclear osteoclastos se forman por la fusión de sus cometidos células precursoras mononucleares y RANKL es el principal factor de crecimiento inducir la formación de osteoclastos [5]. Morfología de los osteoclastos y la actividad depende en gran medida de la matriz que son cultivadas en, el hueso está su sustrato natural. Pareja osteoclastos someterse a varios ciclos de activación e inactivación, donde el hueso se reabsorbe en el estado activo y células migran en el estado de reposo. Eventualmente, las células mueren apoptotically y, en vivo, la formación de hueso nuevo en las células osteoblásticas se lleva a cabo para llenar la laguna resorción.

Transfección de células se utiliza en la investigación biomédica para estudiar la función de cada uno de los productos de genes in vitro o in vivo. Viral y no viral de los sistemas de transferencia de genes están disponibles de varios proveedores, y de varias líneas de células y células primarias pueden ser eficientemente transfectadas [6, 7]. Barreras fisiológicas, incluyendo la membrana plasmática, todavía causa transfección dificultades con distintos tipos de células. Cell-superficie glicosaminoglicanos inhiben transfección in vitro [8], lo que sugiere que la transferencia de genes es eficiente como la suma de muchos parámetros que afectan positivamente. Dentro de las células, el ADN tiene que escapar de la endosomes antes de su maduración en lisosomas [9]. Cell-de grupos específicos de la transferencia de genes partículas también sería beneficioso, y la manipulación de los complejos de la transferencia de genes mediante la adición de proteínas o péptidos de orientación se encuentra actualmente en la investigación [10].

Cuando el ADN plásmido es transfectadas a las células, que necesita ser transportado al núcleo de llegar a la transcripción maquinaria [11, 12]. Transporte nuclear se podría lograr ya sea durante la mitosis, cuando la membrana nuclear se vuelve perturbada o por el transporte a través de los poros nucleares. Transfección de la no división de las células se puede obtener mediante la activación de la absorción nuclear mediante la inserción de las señales de localización nuclear en el transgén [13, 14].

Adenoviral la transferencia de genes en los osteoclastos se ha demostrado que funcionan bien [15]. Esto se debe probablemente a los numerosos α v β 3 receptores de la integrina que se encuentran en la membrana plasmática osteoclastos [16]. Los informes que describen no transfección viral en madurar, adherente osteoclastos no se han encontrado. También hay informes que describen transfección de los macrófagos, como RAW264.7, que no han viral después de la transferencia de genes se ha inducido a formar multinuclear células gigantes [17]. Aún sigue siendo polémico, sin embargo, si estas células son verdaderamente polykaryons o osteoclastos capaces de la resorción ósea. Debido a su deseo de estudiar la migración y los osteoclastos matriz ósea remoción de una forma más fisiológica contexto, cultivadas de los osteoclastos y sus precursores mononucleares temprana sobre el hueso y se utilizan estas culturas para transfección. En anteriores trabajos en nuestro laboratorio sugiere que otros métodos convencionales como la transfección de fosfato de calcio, DEAE-Dextran, electroporación, raspadura de la carga y la hipertonía del choque no se puede utilizar. En el presente artículo presentamos los datos sobre el fracaso de los sistemas de uso de la liposomal en la transfección de los osteoclastos maduros humanos y sus precursores mononucleares in vitro.

Resultados
Reactivo de transfección de ADN ratio

Transfección reactivos específicos reactivo a la DNA ratios de transfección que afectan a la eficacia y la toxicidad. Con el fin de determinar que los coeficientes a utilizar en los siguientes experimentos, decidimos probar tres ratios. Sobre la base del análisis morfológico de las células, un ensayo ratio fue elegido para un nuevo análisis. Aunque decepcionante en esta etapa, un estudio más detallado se siguió para determinar si la disminución de tiempo de incubación después de transfección permitiría expresión de los transgenes.

Índice de apoptosis

La muerte de las células es el principal problema a la hora de utilizar los sistemas de transfección liposomal. Por lo tanto, determinó el número de células apoptóticas de la tinción de Hoechst utilizando un microscopio de fluorescencia convencional. Cultivadas de los osteoclastos se incubaron con reactivos para la transfección 2 h, seguido de un 4 h, 8 h ó 24 h período de cultivo. En la base de referencia de control, en la que no transfección reactivos o adenovirus se han añadido, sólo algunos núcleos apoptóticos se encontraron multinuclear y polarizada y los osteoclastos se mantuvo activa, según lo determinado por la morfología del anillo de actina (Figura 1, [18]] y de la resorción mediciones de la actividad (Figuras 2 y 3]. Cuando las muestras tratadas con reactivos de la transfección fueron evaluados, un gran número de núcleos apoptóticos y sólo se observaron algunos núcleos sigue siendo unfractionated (Figura 4]. Intactos los osteoclastos no se encuentra en estas muestras, y de la resorción actividad fue totalmente perdido. La falta de una dosis-respuesta sugiere que incluso pequeñas cantidades de liposomas o PEI no eran tolerables a los osteoclastos. Algunos núcleos apoptóticos se refleja también en las muestras tratadas con adenovirus, pero la mayoría de los núcleos se mantuvo intacta, y muchos los osteoclastos se mantuvo activamente resorbing hueso.

La viabilidad de ensayo

Con el fin de determinar si cualquier combinación de transfección concentración de reactivos y tiempo de incubación permitiría la supervivencia celular, cultivadas en los osteoclastos y 96 placas y medido de células muertas y vivas de fluorescencia con un lector de microplacas. Como puede observarse en la Figura 5, pero no hemos podido evitar matar a las células, con los reactivos de transfección. Cuando las muestras fueron controlados en mayor detalle después de la tinción citoquímicas de los osteoclastos marcador enzima TRACP [19], se hizo evidente que una pérdida total de los osteoclastos se produjo ya después de un tratamiento con 1 h transfección reactivos. Adenoviral gen también dio lugar a la ejecución de los osteoclastos y la disminución de la viabilidad de muerte, pero la mayoría de las células se mantuvo con vida y muchas células expresó el transgén.

También queríamos comprobar si sería posible transfect los no adherentes CD34-positivo de células mononucleares y luego inducir la diferenciación de los osteoclastos. El Live-Dead ensayo se realizó por lo tanto, también con la fiscalización de los precursores de células mononucleares. Como puede observarse en la Figura 6, los índices de viabilidad sigue siendo algo mayor pero muy baja en comparación con la línea base para el control o el adenovirus tratados muestras.

Transfección eficiencia

GFP expresión adherente fue seguida en los osteoclastos y en la no adherente precursores mononucleares transfectadas durante 4 horas frescas y cultivadas en medio de 1 h, 24 h, 48 h o 5 días. No GFP expresión se observó en los osteoclastos después de transfección con cualquiera de los sistemas de transfección a prueba (Tabla 1]. En comparación, adenoviral entrega de los transgenes dio lugar a un 15% la eficiencia de transfección multinuclear osteoclastos. Cuando CD34-positivo no adherentes células precursoras fueron transfectadas, algunas células fueron positivas 24 h y 48 h después de transfección, pero no se observaron células positivas en el día 5 con cualquiera de los reactivos de transfección a prueba (Tabla 2]. En el adenovirus infectados culturas, múltiples células que expresan GFP fue visto 24 h y 48 h después de la infección y algunas células también 5 días después de la infección. Estos datos sugieren que la transfección de los osteoclastos o células precursoras mononucleares no era viable con la transfección métodos convencionales.

Discusión

Osteoclastos son células que necesitan ser cultivadas como pilas o como diferenciación de la cultura de la médula ósea procedentes de células precursoras mononucleares. El sustrato natural de los osteoclastos es de hueso, y la siembra de las células de forma no natural sustrato, como de plástico o vidrio, tiene un gran efecto en la regulación de la expresión genética y morfología celular [18, 20]. Por lo tanto estamos destinados a transfecting multinuclear osteoclastos se adhirieron al hueso cortical bovino, un sistema ampliamente utilizado en la investigación de los osteoclastos. Adenoviral transfección de los osteoclastos se utilizó en este estudio como referencia el sistema de transferencia de genes, mientras que se ha demostrado que trabajar también con los osteoclastos [15]. CAR-receptor vinculado adenovirus son internalizados a través de endocitosis después de apego a α v integrinas, que son de amplia distribución en la superficie de los osteoclastos. Aunque la entrega de genes virales es en lo que es mejor muy eficiente y rápida, un fuerte promotor podrá conducir transgén producción excesiva e interferir con la fisiología normal de las células. El uso de los patógenos humanos, como el adeno-y lentiviruses, también requiere una atención especial y la autorización, mientras que los métodos convencionales de transfección puede utilizarse en cualquier laboratorio.

Comercial liposomal modificaciones de los sistemas de suministro de genes y PEI-dependiente endosomal perturbación sistemas fueron sistemáticamente evaluado para determinar si alguno de la concentración-tiempo de incubación combinaciones daría lugar a los osteoclastos transfección. Para nuestra decepción, no obstante, ninguno de los 8 sistemas de transfección podría proporcionar satisfactoria osteoclastos transfección eficiencia. GFP-etiquetados actina se utilizó como transgenes para facilitar el seguimiento de la transferencia de genes, pero no se observaron transfectadas osteoclastos. Adenoviral gen de entrega era el único método capaz de proporcionar suficientes transfección eficiencia. Entre los no adherentes mononucleares células precursoras, una tasa de transfección igualmente pobres se obtuvo. El efecto más notable fue la gran inducción de la apoptosis con liposomas catiónicos y con PEI-dependiente de protones endosomal esponjas. Cuando la absorción de la transfección de reactivos repleto de ADN en las células se vigila de manera más detallada, se puede observar que la mayoría de las moléculas nunca penetraron la membrana plasmática. Se acaba de poner de manifiesto que la superficie de células glicosaminoglicanos son capaces de inhibir transfección [8]. Los osteoclastos membrana plasmática está recubierto con grandes cantidades de ácido hialurónico y otras glicoproteínas (para revisión ver [21]], y esto puede explicar por qué los reactivos de transfección no están en condiciones de entregar su carga a la membrana plasmática. Otra explicación para la falta de transfección puede ser la baja densidad celular. Si bien comercial transfección reactivos se sugirió que se utilizará en el sub-confluente confluente a cultivos de células, los osteoclastos nuestras culturas fueron aprox. 50% confluente (Figura 1d]. Nuestras células no se dividen, y esto también puede contribuir a la transfección dificultades.

Pareja osteoclastos no se puede cultivarse como suspensión confluency culturas y es difícil de controlar. Sin embargo, los osteoclastos asumir membrana plasmática-impermeable de ADN y ARN las moléculas de medio de cultivo [22 - 24]. Por antisentido y ARNsi de la investigación, sería óptimo para aumentar la adopción y disponibilidad intracelular de genes de las moléculas desmontables en los osteoclastos culturas. Si bien la transferencia de genes virales es difícil de controlar, la principal opción para los experimentos de genes desmontables sería un no-viral sistema que permite transgén embalaje, la protección y la biodisponibilidad suficiente.

Conclusión

Aunque muchas líneas celulares de células primarias, y algunos son fáciles de transfect utilizando fosfato de calcio, DEAE-dextrano, la electroporación, raspadura de carga o sistemas de transfección liposomal, estos sistemas no pueden ser utilizados en multinuclear osteoclastos. Estas grandes, adherente, la no división de las células son frágiles y se someten a la apoptosis rápidamente cuando es químicamente o mecánicamente. Óptimo de las células de los sistemas de transfección comercial debe ser en el sub-confluyentes, en rápida división fase de crecimiento, que no puede ser proporcionado en los osteoclastos culturas. Microinyección pueden utilizarse para transfección osteoclastos, aunque sólo unos pocos transfectadas osteoclastos son suficientes y la experiencia está disponible. Para una correcta transfección de los números más altos de los osteoclastos, sin embargo, el único racional de las herramientas son los sistemas de vectores virales.

Materiales y métodos
Cultivo de células

Humanos de la médula ósea-CD34-positivos derivados de células mononucleares se cultivaron en los bovinos hueso cortical rebanadas en presencia de M-CSF (33 ng / ml, R & D Systems, Reino Unido) y RANKL (66 ng / ml, Peprotech, Reino Unido), como sugirió El proveedor (Cambrex, EE.UU.). TGF-β1 (1 ng / ml, R & D Systems, UK) se añadió en el día 3, y adherente, terminales diferenciadas osteoclastos fueron transfectadas en el día 7. Cuando no adherentes precursores de los osteoclastos se utilizaron, la transfections se realizaron en el día 1. Las células fueron cultivadas en alta glucosa MEDM complementada con el 10% de calor-suero de ternera fetal inactivado, 20 mM HEPES, 100 U / ml penicilina y 100 mg / ml estreptomicina (Gibco de todos Invitrogen, Reino Unido). Las células se cultivaron en placas de 96 y con 200 μ l de medio de las mediciones de fluorescencia con un lector de placas. Bovina hueso cortical rebanadas fueron 150-180 μ m de espesor secciones transversales que se sonicated y esterilizadas por inmersión en el 70% de etanol antes de su uso. Un grupo de control de las células adjunta a la coverslips de vidrio recubiertos con colágeno tipo I (BD Biosciences, Bélgica) también se incluyó. No inscritos células fueron transfectadas en los pozos que contienen colágeno de tipo I-coverslips vidrio recubierto de hueso o rodajas.

Sistemas de transfección

El plásmido que contiene EGFP-actina (Clontech, EE.UU.) fue transfectadas a las células fluorescentes para permitir la visualización de los filamentos de actina transfectadas. Por transfección mediada por liposomas, Metafectene (Biontex, EE.UU.), Lipofectamine Plus (Gibco Invitrogen, Reino Unido), Tfx-50 (Promega Corp, EE.UU.) y FuGene6, DOTAP y DOSPER (todos los de Roche, Alemania) fueron utilizados de acuerdo a la del proveedor Instrucciones. Reactivo / DNA ratios fueron las siguientes: 1 μ g de ADN plásmido es complejo, con 1,5, 3,0 o 6,0 μ l de FuGene6 o Lipofectamine Plus transfección reactivo, o con 2,0, 3,0 o 4,0 μ l de Tfx-50 o Metafectene transfección reactivo, o con 5, 7,5 o 10 μ g de DOTAP; o con 3, 7,5 o 12 μ g de DOSPER. Asimismo, la interrupción endosomal basada en los sistemas de transfección JetPei (PolyTransfection, EE.UU.) y DuoFect (Quantum Appligene, EE.UU.) se utilizan de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Por DuoFect transfección, 50 μ M deferrioxamine se añadió al medio de cultivo de 24 h antes de transfección. Con estos sistemas, 1 μ g de ADN plásmido es complejo, con 0,5, 0,75 o 1,0 μ l de reactivo o DuoFect transfección con 1,5, 3 o 4,5 μ l de reactivo de transfección JetPei.

Para probar la transfección óptimo de reactivos de ADN-a-ratio, las células fueron incubadas con los reactivos de transfección de 2 h de la presencia de suero, sumergido en caliente PBS y transferir al nuevo placas de cultivo que contenían el medio osteoclastos y factores de crecimiento por un nuevo período de cultivo de 48 h . De células de morfología y expresión de los transgenes se supervisaron y microscópicamente los siguientes reactivos a los coeficientes de ADN fueron escogidos para ser utilizados en el futuro experimentos: 1 μ g de ADN plásmido es complejo con 3,0 μ l de FuGene6, Lipofectamine Plus, Tfx-50 o Metafectene transfección reactivo; O al 7,5 μ g de DOTAP o DOSPER; o con 1,0 μ l de DuoFect; o con 4,5 μ l de reactivo de transfección JetPei. En los siguientes experimentos, las células fueron incubadas con los reactivos de transfección de 2 h en presencia de suero, sumergido en caliente PBS y transferir al nuevo placas de cultivo que contenían el medio osteoclastos y factores de crecimiento por un nuevo período de la cultura, de 4 h, 8 h ó 24 h . Expresión de los transgenes y la viabilidad celular se evaluó con la ayuda de un microscopio de fluorescencia (Leica) y un lector de microplacas (Victor2, Wallac).

Un adenovirus comercial resultante en la expresión de las buenas prácticas agrarias en el marco del promotor CMV se utilizó como control de transfección (QBiogene, EE.UU.). Las células fueron infectadas con el virus de 5000 partículas de Ad5.CMV GFP-100 μ l en el medio durante 1 h, después de que 100 μ l de agua a medio y osteoclastos se añadieron factores de crecimiento. GFP expresión y de la viabilidad celular se evaluó como ya se ha descrito.

Transfección la eficiencia y la viabilidad

Expresión de los transgenes en las células se vigila bajo microscopio de fluorescencia 1 h, 24 h, 48 h, y 5 días después de transfección, y todas las buenas prácticas agrarias-positivas las células mononucleares y los osteoclastos (células con al menos 3 núcleos) fueron contabilizados. Para la cuantificación de apoptosis, el 3% paraformaldehido-2% de sacarosa se utiliza para la fijación de las células antes de la tinción de núcleos con Hoechst a lo sugerido por el proveedor (Molecular Probes, EE.UU.). Apoptosis núcleos fueron contados bajo microscopio de fluorescencia. Para controlar en detalle la viabilidad de células, teñidas las células muertas y vivas con el Live / Dead-sistema (Molecular Probes, EE.UU.). Las células cultivadas en placas de 96 y se tiñeron después de transfección mediante la adición de 7 μ M Calcein AM (tinción de células vivas) y 5 μ M ethidium homodimer-1 (EthD, detectó células muertas) a los cultivos celulares que fueron lavadas con PBS cálido. Las células fueron incubadas con los tintes de 45 minutos en 100 μ l de PBS, seguido de mediciones de la intensidad de fluorescencia utilizando exitation / filtro de emisión conjuntos de 495/520 nm (Calcein AM) y 530/642 nm (EthD). Viabilidad índices fueron contados dividiendo la fluorescencia de células en vivo por la fluorescencia de células muertas.

Análisis morfológico

Los efectos de los reactivos de transfección de la morfología de las células cultivadas fueron controlados durante la fase de la cultura con la óptica, y más detallado análisis morfológico se realizó sobre muestras fijadas. Las células fueron fijadas en el 3% PFA-2% de sacarosa, durante 15 min. Seguir de confluency los osteoclastos y la formación de capacidad en las culturas, las células fueron fijadas y teñidas de TRACP con el leucocitaria Fosfatasa Ácida kit (Sigma, EE.UU.). Bone resorbing osteoclastos se determinaron por tinción con anillo de actina AlexaFluor 488 Phalloidin (Molecular Probes, EE.UU.). Resorción se vigila la actividad en las muestras por biotinylating la resorción piscinas existentes inmediatamente antes de transfección con sulfo-NHS-biotina (Pierce, EE.UU.), como se describe antes [25]. Después de transfección y más cultura, las muestras fueron fijadas y biotina se detectó con FITC-streptavidina (DAKO, Dinamarca) y de todos los pozos de la resorción se tiñeron con TRITC-lectina de Ventajas de Windows Original (Sigma Aldrich, EE.UU.).

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como media ± desviación estándar de cuatro réplicas y todos los experimentos se realizaron de forma independiente en dos ocasiones (n = 8). Las diferencias con el control se examinaron de significación estadística por análisis de varianza y del alumno T-test. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado significativo.

Contribuciones de los autores

TLL es responsable del contenido de este artículo.

Agradecimientos

Jukka Rissanen y Salla Ylönen son reconocidos para la asistencia técnica y el prof. H. Kalervo Väänänen de asesoramiento científico. Este trabajo fue apoyado financieramente por la Agencia Nacional de Tecnología finlandesa.