AIDS Research and Therapy, 2005; 2: 7-7 (más artículos en esta revista)

Evaluación de VIH-1 inhibidores de la entrada por MLV/HIV-1 pseudotyped vectores

BioMed Central
Sandra Siegert (sandra.siegert @ fmi.ch) [1], Sonja Thaler (thaler@3-med.klinik.uni-mainz.de) [1], Ralf Wagner (ralf.wagner @ klinik.uni-regensburg.de ) [4], Barbara S Schnierle (schba@pei.de) [1]
[1] Georg-Speyer-Haus, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Paul-Ehrlich-Strasse 42-44, D-60596 Frankfurt am Main, Alemania
[2] Paul-Ehrlich Institute, Abt. 2 / 01, Paul Ehrlich-Strasse 51-59, D-63225 Langen, Alemania
[3] Department of Medicine III, Johannes Gutenberg University, 55101 Mainz, Germany
[4] Instituto de Higiene y Microbiología Médica de la Universidad de Regensburg, Franz-Josef Strauss-Allee 11, 93053 Regensburg, Alemania
[5] Friedrich Miescher Institute, Maulbeerstrasse 66, CH-4058 Basel, Switzerland

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Resumen
Antecedentes

Virus de la leucemia murina (MLV) vector de las partículas puede ser pseudotyped truncada con una variante del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) sobre la proteína (Env) y selectivamente objetivo la transferencia de genes a las células CD4 que expresan tanto y un co-receptor. Vector imita transducción de la entrada del VIH-1 en proceso y es por tanto una herramienta segura para el estudio del VIH-1 en la entrada.

Resultados

El uso de células FLY, que expresan la MLV gag y pol genes, se generó estable productor líneas celulares que expresan el VIH-1 y una dotación de genes del genoma retroviral vector de codificación de la proteína verde fluorescente (GFP). El BH10 o 89,6 P VIH-1 se expresó Env bicistronic de un vector que permite la rápida selección de líneas celulares estables. Un codón-uso-env gen sintético optimizado de alta permitida, Rev-Env expresión independiente. Vectores generados por estas células de productores muestran sensibilidad a los diferentes inhibidores de la entrada.

Conclusión

Estos datos ilustran que MLV/HIV-1 vectores son un valioso sistema de detección de inhibidores de la entrada o la neutralización de los anticuerpos generados por las vacunas.

Antecedentes

El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se describió por primera vez hace unos 20 años. Desde entonces, casi 20 millones de personas han muerto a causa del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) la infección y 42 millones están infectados con el. Nuevos medicamentos y una vacuna eficaz se necesitan con urgencia. En particular, los nuevos fármacos que bloquean el VIH tipo 1 (VIH-1) entrada en la célula hospedadora con claras ventajas sobre los medicamentos actualmente utilizados. Ellos deben derogar la creación de una infección productiva y, en consecuencia, podría disminuir las posibilidades de que el VIH-1, el desarrollo de resistencia. Por otra parte, una vacuna que previene el SIDA deberían recopilar ampliamente transversal reactiva anticuerpos neutralizantes para prevenir la infección. Un seguro y simple ensayo para la medición de las actividades contra neutralizar diferentes cepas del VIH-1 es crítica para el desarrollo de esta vacuna o los fármacos inhibidores de la entrada.

Anteriormente generado un vector retroviral que específicamente las transferencias de genes humanos en células CD4 + [1, 2]. Este vector fue derivado por pseudotyping virus de la leucemia murina (MLV) cápside partículas con una variante del VIH-1 sobre de proteínas (Env), que contiene la glicoproteína de superficie gp120 de la UB y un carboxilo-terminal truncado transmembrana (TM) de proteínas citoplasmáticas con sólo el 7 amino Ácidos. VIH-1 Env facilita vector apego a las células diana y la fusión de membranas, que se inicia por la interacción del VIH-1 Env con la molécula de CD4 receptor en la superficie de la célula objetivo. CD4 vinculante induce un cambio conformacional en el sobre glicoproteína y permite la unión de un co-receptor de la familia de receptores de quimioquinas [3]. El co-receptor es de uso que dependen de la cepa de virus: virus R5, que infectar monocitos y macrófagos, el uso CCR5 y X4 virus, que infectan a las líneas de células T, utiliza CXCR4. X4R5 cepas pueden utilizar CXCR4, así como CCR5 para entrar. La transferencia de un gen marcador MLV/HIV-1 vectores por tanto, es un método simple y seguro a la entrada de ensayo mediada por el VIH-1 Env y se puede utilizar para evaluar el VIH-1, inhibidores de la entrada, tales como pequeñas moléculas o anticuerpos neutralizantes en el suero De los animales vacunados o pacientes.

En este sentido, la producción optimizada de la MLV/HIV-1 vector para permitir el análisis de diferentes del VIH-1 Envs y demostrar que la respuesta a inhibidores de la entrada viral depende de la cepa de VIH-1 fue el derivado de Env. Esto ilustra que MLV/HIV-1 pseudotyped vectores son herramientas útiles para el análisis de VIH-1 en la entrada.

Resultados y discusión
Generación de una línea celular estable productor codificación de los 89,6 P VIH-1 Env

Nosotros y otros han informado anteriormente que MLV capsids puede pseudotyped con cytoplasmatically truncado variantes del VIH-1 o VIH-2 sobre las glicoproteínas que poseen sólo el 7 frente al citoplasma de los aminoácidos. Estos MLV / VIH pseudotyped vectores tienen el VIH gama de huéspedes [4, 1, 5]. Se utilizó un X4 HIV-1 Env variante (BH10) para pseudotyping, que restringen la entrada de vectores a los receptores CD4 y CXCR4 de las células positivas [2]. Env del VIH-1 se expresó de construir una expresión que también codificada Rev, que se requiere para el transporte de la rev elemento sensible (RRE) que contienen env ARNm del núcleo al citoplasma. En el presente estudio se evaluó un codón de uso optimizado de VIH-1 env gen que codifica la variante truncada Env de la X4R5 89,6 P VIH-1 carece de aislar y secuencias rev. Western blot de las células transfectadas 293T mostró que el cambio de lentiviral a mamíferos codón de uso permitido alto HIV-1 Env expresión de la proteína en ausencia de Rev (Figura 1]. El 89,6 P Env mostraron diferentes migración en geles de poliacrilamida de la BH10 aislar, que puede ser causada por diferentes patrones de glicosilación de las proteínas y refleja la cepa específica de las diferencias en Env.

Anteriormente construyó una MLV/HIV-1 productor línea celular basada en células FLY [6], que expresa el VIH-1 Env de la X4 del VIH-1 y una cepa BH10 vectores retrovirales codificación de la proteína verde fluorescente (GFP) [2] . Estas células son más mencionados como el VIH-FLY-87-GFP células. VIH-1 es la expresión de la proteína Env impulsada por la fuerte humanos elongación factor 1 α promotor y estable clones fueron seleccionados a través de la puromycin gen de resistencia (pac) bicistronic codificada en el ARN mensajero.

Hemos clonado un codón de uso optimizado 89,6 P-VIH-1 Env en este vector y estable de células clones fueron aislados rápidamente por puromycin selección. Expresión de proteínas de VIH-1 Env fue asegurada por la expansión de las células en la continuación de la presencia de puromycin. Un solo clon se transduced con una codificación de las buenas prácticas agrarias de vectores retrovirales para obtener el productor línea celular FLY-sin-GFP.

Caracterización de los vectores derivados de las partículas de VIH-FLY-87-GFP o FLY-sin-GFP

La caracterización de las dos líneas celulares de productores se comenzó por determinar la cantidad de partículas infecciosas de vectores retrovirales liberados de las células de productores. Partículas infecciosas puede ser fácilmente detectado por la transferencia del gen gfp. NIH3T3 CD4/CXCR4 células que expresan los receptores CD4 y CXCR4 fueron transduced con sobrenadantes derivados de VIH-FLY-87-GFP o FLY-sin-GFP células y después de dos días analizaron por citometría de flujo. Figura 2A da un típico FACS NIH3T3-CD4/X4 análisis de las células en serie con transduced vector sobrenadantes diluidos. Títulos se indican en la figura 2B infecciosas en las unidades por ml y representan los valores medios de cinco experimentos. Los títulos producidos por el VIH-FLY-87-GFP células se reproducen más elevados que los obtenidos de FLY-sin-GFP células. Sin embargo, el fenotipo de X4R5 el 89,6 P VIH-1 Env fue retenido por la pseudotypes. Sólo las partículas derivadas de los vectores FLY-sin-GFP células fueron capaces de transducción NIH3T3 células que expresan CD4 y CCR5 (Figura 3].

El cambio de uso del codón 89,6 P Env resultado en FLY alta expresión en las células, sin embargo, fueron los títulos de los vectores siempre inferiores a los de los vectores que contienen BH10 Env. Analizar la cantidad de Env incorporado a partículas, los sobrenadantes de las células de productores, se recogieron y se centrifuga a través de un 30% de sacarosa cojín. El Western blot de los pellets de manifiesto que los niveles elevados de los 89,6 P Env fue incorporado a partículas vector (Figura 4]. Igualdad de la carga fue verificada por la detección de la proteína Gag p30 MLV. Estos datos implican que la cantidad de Env en el vector viral partículas no se correlaciona con su título. En lugar de ello, parece probable que la capacidad de fusión de Env, que muestra la cepa específica de las diferencias, afecta a la infectividad del vector.

Evaluación de VIH-1 inhibidores de la entrada

El apego y la entrada del VIH-1 en las células CD4 implicar una serie de cambios conformacionales de Env que permiten co-receptor de carácter vinculante y, por último, la fusión de las membranas celulares y virales. AMD-3100 es un inhibidor de molécula pequeña gp120 apego a la del receptor CXCR4, y T-20 es un péptido sintético correspondiente a una región helicoidal de la gp41 de VIH-1 que bloquea la fusión del celular y la membrana viral. Mientras que AMD-3100 sólo es activa frente a X4 y X4R5 cepas del VIH-1, T20 inhibe la fusión de la mayoría de las cepas del VIH-1.

Como se muestra en la Figura 5A, la sensibilidad de la BH10 y 89,6 P Env contienen vectores a AMD-3100 era ligeramente diferente. BH10 fue menos sensibles, lo que indica una mayor afinidad por el CXCR4. Sin embargo, la respuesta a T20 no fue significativamente diferente entre ambos Env proteínas (Figura 5B]. El inhibidor de la concentración se utilizan en estos estudios eran más altos que los publicados anteriormente porque C-terminal truncado Envs tener una rápida cinética de fusión, por lo que son menos sensibles a los inhibidores de la entrada [7]. Se ha demostrado que la cola citoplásmica frena el plegamiento de VIH-1 Env de una tarde prebundle configuración en el paquete de seis hélice, y por lo tanto también retrasa el proceso de fusión [8]. La inhibición del VIH-1 mediada Env transducción se concreta, desde amphotropic viva modificada no puede ser inhibida por AMD3100 o T20 (datos no presentados).

Presentamos aquí dos productor de líneas de células que liberan MLV/HIV-1 pseudotyped vectores retrovirales partículas. Gfp de la transferencia de genes puede ser utilizado como un indicio de un proceso mediado por la infección por el VIH-1 sobre de la glicoproteína. Este ensayo es robusto y fácil de realizar y las buenas prácticas agrarias expresión puede ser rápidamente controlado por citometría de flujo sin más tinción de las células objetivo. Expresión de la pandemia del VIH-1 Env de un vector bicistronic permitido rápido establecimiento de líneas celulares estables productor. Optimización del VIH-1 Env codón llevado a la utilización de alta expresión sin necesidad de co-Rev expresión y, en combinación con la bicistronic vector, facilitar el fácil intercambio de secuencias Env. El sistema también se puede aplicar a la producción de vectores transitorios, y genes sintéticos permitirá pruebas rápidas de VIH-1 en diversos Envs, incluidos los de las cepas resistentes a los medicamentos.

Conclusión

MLV/HIV-1 vectores son un valioso sistema de detección de inhibidores de la entrada o la neutralización de los anticuerpos generados por las vacunas.

Métodos
Plásmidos

La variante truncada glicoproteína de la envoltura del VIH-1 Env Tr712 [1] se deriva de la plásmido pLßAc/env-Tr712-neo como SalI SalI 3,1 kb / XhoI fragmento XhoI y fue clonado en el XhoI XhoI sitio de la bicistronic vector pEF - IRES-P [9]. La secuencia de los 89,6 P VIH-1 Env aislar (a bis 1 - 712) fue de síntesis química y de los codones se modificaron para GC alto contenido sin cambiar la secuencia de codificación. El péptido señal Env secuencia se intercambió con la del receptor CD5. Env fue extirpada como EcoRI EcoRI / XhoI fragmento XhoI, burdo-y terminó clonado en el sitio XhoI XhoI del vector pEF-IRES-P, por lo que el clon pEF-IRES-P-89,6 p.

Células

NIH 3T3 derivados [10], 293T (ATCC CRL-# 11268) y FLY [11] las células fueron cultivadas en la Dulbecco modificado a medio Eagle (GIBCO BRL, Eggenstein) suplementado con 10% suero bovino fetal, 1% penicilina / estreptomicina y un 1% L-glutamina. FLY células se basan en células humanas HT1080 y expresar el MLV Gag / Pol gen producto [11]. Transfectadas establemente VIH-FLY-87-GFP o FLY-sin-GFP células fueron cultivadas en el medio descrito anteriormente complementado con 2,5 μ g / ml puromycin (Sigma, Deisenhofen).

Estable transfección de células

FLY células (10 6) Se sembró a 10 cm en una placa de cultivo de tejidos. Al día siguiente, las células fueron transfectadas con 10 μ g de la bicistronic construir pEF-IRES-P-89,6 p. transfección se realizó con el reactivo SuperFect ™ transfección (Qiagen, Hilden). Cuarenta y ocho horas después de transfección, 2,5 μ g / ml puromycin se añadió al medio. Después de la selección y aislamiento de clones única célula, las células fueron la prueba del VIH-1 sobre de la glucoproteína expresión Western blot y la mejor expresión de clon fue transduced con VSV-G pseudotyped vectores retrovirales codificación de las buenas prácticas agrarias (pMX-EGFP) [12].

Transducción retroviral y determinación título

Diluciones seriadas de los vectores sobrenadantes de los envases se aprobaron a través de las células de 0,45 μ m de los filtros y se incubaron con 1 × 10 5 NIH 3T3-CD4/CXCR4 o NIH 3T3-CD4/CCR5 células y de 6 h de incubación más largo (por ejemplo, durante la noche) no cambió El título. Se mezclaron con diferentes cantidades de T20 (generoso regalo de la Prof von Laer, Georg-Speyer-Haus, Frankfurt) o AMD-3100 (NIH SIDA Investigación y Programa de reactivos de referencia) para ensayos de inhibición. El número de células que expresan GFP-fueron detectados por análisis FACS 48 - 72 horas después de la transducción. Los títulos se ofrecen en las unidades de infecciosas por ml (UI / ml) y se determinará calculando el porcentaje de células positivas de las buenas prácticas agrarias. GFP expresión está controlada por un cambio de fluorescencia verde (FL-1). FACS análisis se realizó con un FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg) utilizando el software Cellquest.

Preparación de las proteínas virales y immunoblots

Para el análisis de la incorporación de proteínas Env partículas en el vector, el sobrenadante de células productor fue filtrada a través de un 0,45 μ m-filtro (Greiner, Frickenhausen, Alemania) y se centrifuga a través de un 30% de sacarosa cojín durante 90 min a 26000 rpm en un rotor SW28 . El pellet se resuspendió en 50 μ l SDS carga buffer [13] y 25 μ l fueron analizados. Lisados de células se prepararon como se describe antes de [1] y 40 μ g de proteína fueron analizados. Las proteínas se separaron por electroforesis en un 7,5% a través de un gel de poliacrilamida y electroblotted sobre una membrana de nitrocelulosa transferencia (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania). Inmunomarcación se realizó en base Tris salino (pH 7,4) con 5% de leche en polvo y 0,1% de Tween 20. Las proteínas se detectaron por incubación con antisuero de cabra contra gp120 (Dunn Labtech, Ansbach, Alemania) o de un antisuero policlonal contra MLV p30 [1], seguido de una incubación con peroxidasa de rábano con etiqueta de cabra anti-anticuerpos o proteínas A. Proteínas bandas Finalmente se visualizan por una mayor detección de quimioluminiscencia utilizando el kit ECL (Amersham, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Sandra Siegert y Sonja Thaler realizó los experimentos, Ralf Wagner y Bárbara Schnierle participado en el diseño de los experimentos, y Barbara Schnierle supervisó la conducción de los experimentos y la interpretación de los resultados.