Genetic Vaccines and Therapy, 2005; 3: 6-6 (más artículos en esta revista)

Producción y caracterización de amplificación de tumor derivado de las bibliotecas cRNA a ser utilizados como vacunas contra los melanomas metastásicos

BioMed Central
Jean-Philippe Carralot (carralot@curevac.de) [1], Benjamin Weide (bnweide@med.uni-tuebingen.de) [3], Oliver Schoor (oliver.schoor @ uni-tuebingen.de) [2], Jochen Probst (jochen.probst @ student.uni-tuebingen.de) [1], Birgit Scheel (bs@curevac.de) [1], Regina Teufel (rt@curevac.de) [1], Ingmar Hoerr (ih @ curevac . De) [1], Claus Garbe (claus.garbe @ med.uni-tuebingen.de) [3], Hans-Georg Rammensee (rammensee@uni-tuebingen.de) [2], Steve Pascolo (steve.pascolo @ Uni-tuebingen.de) [1]
[1] CureVac, Paul Ehrlich Strasse 15, 72076 Tübingen, Germany
[2] University of Tübingen, Institute for Cell Biology, Department of Immunology; Auf der Morgenstelle 15; 72076 Tübingen, Germany
[3] Section for Dermatological Oncology, Tübingen University Hospital, Liebermeisterstraße 25, 72076 Tübingen, Germany

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Resumen
Antecedentes

Anti-tumor vacunas dirigidas a todo el repertorio de antígenos tumorales representan un atractivo inmunoterapéuticos enfoque. En el contexto de una fase I / II de ensayos clínicos, los pacientes con melanoma metastásico vacunados con amplificación de tumor autólogo ARNm. A fin de proporcionar a las grandes cantidades de mRNA necesaria para cada paciente, la Stratagene Creator ™ ™ SMART biblioteca de cDNA se modificó el método de construcción y que se aplican para producir bibliotecas derivados de los tumores de 15 pacientes. La calidad de los ARNm biblioteca vacunas se evaluó a través de la secuenciación y análisis de microarrays.

Resultados

Random análisis de bacterias clones de la biblioteca mostró una tasa de 95% de los plásmidos recombinantes entre los cuales un mínimo de 51% de los clones contiene un completo Open Reading Frame. Además, a pesar de un pequeño sesgo hacia la amplificación abundantes transcripciones frente a los grandes fragmentos raros, podríamos documento relativamente conservadas perfil de expresión de genes entre el ARN total del tumor de origen y los correspondientes in vitro de ARN transcrito complementario (cRNA). Por último, con una lista de los 30 más abundantes transcripciones de MEL02 biblioteca del paciente, un gran número de antígenos asociados tumor (TAAs) del paciente, ya sea específica o compartida por varios melanomas se encontraron.

Conclusión

Nuestros resultados muestran que cantidades ilimitadas de cRNA en representación del tumor transcriptome podría obtenerse, y que esta cRNA fue una fuente confiable de una gran variedad de antígenos tumorales.

Antecedentes

La identificación por van der Bruggen et al. [1] de los primeros asociados tumor (TAA) antígeno específico reconocido por los linfocitos T citotóxicos (CTLs) en los pacientes con melanoma impulsado el desarrollo de la inmunoterapia contra el cáncer estrategias. Durante los últimos años, los protocolos de vacunación dirigidos a los antígenos de diferenciación (MART-1/Melan-A [2, 3], gp100 [4], Tyrosinase [5, 6]] o el cáncer de testículo antígenos (MAGE [1, 7], NY - ESO1 [8]] se pusieron a prueba y mostró resultados alentadores [9 - 11].

Sin embargo, un creciente cuerpo de evidencia sugiere que, en lugar de utilizar antígenos definidos, dirigidos a todo el espectro de antígenos tumorales que representan una alternativa, potencialmente más eficaz método [12 - 14]. De hecho, el uso total de material para la vacunación tumor permite el desarrollo de las células T y B dirigido contra una gran variedad de conocidos, pero también desconocidos TAAs [15]. Además, el estímulo de ese gran espectro de efectores específicos dirigidos contra epítopes múltiples restringida por diversos HLA clase I y tipo II que reducen el riesgo de tumor de escapar a través de la pérdida o el antígeno MHC downregulation [16 - 19]. Por último, otra ventaja de todo el tumor enfoque es que, en un establecimiento autólogo, del paciente TAAs eventualmente derivados de tumor específicas de mutaciones somáticas podrían destinarse [20, 21].

Con el fin de vacunar a pacientes con todo el espectro de TAAs, se han desarrollado varios métodos. En 1998, Soiffer et al. [22] reveló los resultados obtenidos por la vacunación de los pacientes con tumor de células autólogas irradiado diseñada para producir GM-CSF. El mismo año, Nestlé et al. [23] mostró parcial o completa del tumor remisiones en seis pacientes con melanoma vacunados con células dendríticas (DC) cargadas con lisado tumor autólogo. Alternativamente, Boczkowski et al. [24] informó de que países en desarrollo de ratón pulsado con tumor in vitro RNA podría desencadenar una inmunidad anti-tumoral in vivo. Varios grupos más desarrollado y optimizado esas diferentes estrategias [25 - 27], pero se enfrentan a la limitación impuesta por la necesidad de grandes cantidades de tejido del tumor para lisado suficiente para la preparación o el rendimiento de la extracción de RNA. A fin de superar este inconveniente, Boczkowski et al. [28] modificó el método SMART (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), a fin de transcribir in vitro tumor cDNA y se lleva a cabo, por tanto, un solo paso de amplificación de mRNA tumor. Transfectadas en células presentadoras de antígenos (CPA), esta cRNA amplificado fue demostrado in vitro para inducir inmunidad anti tumor [29, 30]. Como alternativa método de vacunación, Hoerr et al. [31] demostraron la capacidad de los ARNm que codifican antígenos definidos o total de cRNA para activar un antígeno-específicos de la respuesta inmune directa después de las inyecciones intra-cutánea del ácido ribonucleico. Del mismo modo, Granstein et al. [15] mostraron S1509 protección contra las células tumorales en ratones que recibieron tres inyecciones intradérmica de ARN total extraído de células S1509. Aunque todavía marginal en comparación con el ARNm estudiado carga DC-vacunas, la inyección directa de mRNA representa una tecnología que ofrece la importante ventaja de eludir las inversiones de dinero y tiempo medidas de generación de países en desarrollo.

En 2003, iniciamos la primera fase I / II estudio clínico para poner a prueba la viabilidad, seguridad y eficacia de una vacuna autóloga de amplificación de mRNA tumor en estadio III / IV pacientes con melanoma metastásico (La detallada evaluación de la toxicidad, clínicas y Inmunológicos eficacia de este tratamiento se informó en un siguiente manuscrito). Quince pacientes recibieron del 3 al 16 de inyecciones intradérmica de 200 μ g de amplificación de tumor autólogo cRNA. La cantidad de ARN se inyecta limitados por el máximo volumen de inyección intradérmica (100 μ l) y establecer de acuerdo con los resultados preclínicos que se indica que una concentración de ca. 0,8 μ g / μ l es un buen líder para la transferencia de genes. La inyección del calendario consistió en aplicaciones cada dos semanas de cuatro inyecciones y luego una vez al mes. Se decidió empíricamente, ya que no anteriores datos sobre la toxicidad y la eficacia de este método de vacunación están disponibles en los seres humanos. Una inyección en ratones ha demostrado ser suficiente para desencadenar una respuesta inmune [31]. Sin embargo, en los pacientes con cáncer, una estimulación sostenida de la inmunidad es, probablemente, pidió el fin de conseguir una eficaz lucha contra el tumor de la respuesta inmune. Según este protocolo, la cantidad requerida de cRNA para un completo tratamiento fue de entre 0,6 y 3,2 mg por paciente (tabla 1]. Con el fin de obtener cantidades ilimitadas de producto, un nuevo método para la amplificación del mRNA tumor se ha desarrollado. En pocas palabras, una biblioteca de cDNA fue generada a partir de ARN del tumor usando el SMART (Switch Mecanismo Al 5'end de ARN Plantillas) sistema (BD Clontech), y luego fue clonado en nuestro RNActive ™ vector (CureVac GmbH), y ampliada en Escherichia coli, y Finalmente transcrita in vitro. Al contrario que el protocolo descrito por Boczkowski et al. [28] en la que la PCR-amplificación de cDNA biblioteca tumor está directamente utilizados como plantilla para la transcripción in vitro (lo que resulta en cantidades limitadas cRNA), el método aplicado en nuestro laboratorio nos ha proporcionado cantidades ilimitadas de los tumores derivados de cRNA.

Considerando que el método se informó de SMART para mantener los niveles relativos de ARN que figuran en el original transcriptome independientemente de su tamaño o de su nivel básico de expresión [32], el paso en la clonación E. Coli fue descrito por el contrario a favor de introducir un sesgo de corto fragmentos [33]. Por lo tanto, se analizó la calidad de la amplificación de ARNm producido bibliotecas que se utiliza como una vacuna en pacientes con melanoma. Varios clones recogidos al azar de los producidos dentro de las bibliotecas fueron analizados por PCR y secuenciado. Además, los perfiles de expresión génica de dos metástasis se compararon con sus correspondientes cRNA de bibliotecas.

Resultados y discusión
Tumor derivado de la calidad del ARNm biblioteca

ARN total fue extraído forma melanoma tejidos frescos 15. Entonces se utiliza para generar bibliotecas de cDNA de acuerdo con el protocolo SMART (BD Clontech, Palo Alto, CA). Las bibliotecas de cDNA obtenido se ligated en la RNActive ™ vector (CureVac GmbH, Tübingen, Alemania), que contiene las secuencias de la estabilización de ARNm 5 'y 3' UnTranslated Regiones (UTR) de α y β-globina-respectivamente [34, 35]. Además, este vector presentó un 70 Un poli (A) cola seguir mejorando ARNm traducción posibles (datos no presentados). RNActive ™ bibliotecas se transformaron en ultracompetent E. Coli. El número total de primaria transformantes fueron de 6 × 10 4 a 5 × 10 5 clones con un número medio de 2 × 10 5 (cuadro 1]. Con el fin de determinar la eficiencia de la ligadura, 24 clones por biblioteca son recogidos al azar y envía a 35 ciclos de PCR usando primers de acompañamiento de la inserción cDNA sitios. Noventa y ocho por ciento de los 312 clones analizados había una inserción con tamaños que van desde los 200 pb a 10 kbp (datos no presentados). Con el fin de probar la calidad de las bibliotecas, el plásmido de ADN, de 9 de clones al azar recogidos fueron extraídos para 5'end secuencia (Figura 1]. De las 112 secuencias de lectura, 2 clones no insertar confirmar la tasa de 2% de la libre ligadura encontrado por análisis de PCR. Entre los restantes 110 clones, 3 (3%) mostraron secuencias clasificadas como aberrantes insertar con tamaños inferiores a 50 bp probablemente correspondiente a los eventos de recombinación. Los otros 107 se analizaron las secuencias [36] BLAST (Basic Local Alignment Página de búsqueda), utilizando la base de datos nr. Alrededor de la mitad de los clones (51%) corresponden a la plena Open Reading Frames (ORFs), de secuencias anotada. Las demás secuencias son homólogas a las tecnologías ecológicamente racionales (etiquetas de secuencia expresada) que codifican proteínas con potencial desconocido funciones. De longitud completa clon tamaños iban desde 344 a 5925 bp, con un tamaño medio de 1395 bp correlacionar con el tamaño de inserción promedio de 1,4 kb de cDNA bibliotecas descrito por Draper et al. [37]. Curiosamente, el 28% de los clones que se suman a la anotada ORFs (14% de todos los clones secuenciados) fueron los genes relacionados con el tumor (por ejemplo, la proteína de unión S100 Calcio A4-metastasin [38]], o genes informó de que se sobreexpresa en tumores (por ejemplo, Receptor de laminina [39]]. Esta observación equipados con el objetivo de utilizar el cRNA bibliotecas como las vacunas anti-tumorales.

Relativa de la representación de transcripciones

Con el fin de determinar si un sesgo fue presentado por el protocolo de amplificación, la relativa a la expresión de genes ARN total extraído de dos metástasis se comparó la relativa a la expresión génica en las correspondientes bibliotecas cRNA amplificado. Biotina etiqueta complementaria de ARN y ARN tumoral total de cRNA amplificado bibliotecas de los pacientes MEL02 y MEL10 se generaron utilizando la muestra y Affymetrix eucarióticas gama estándar de procesamiento de procedimiento y hibridizada en el HG-U133A microarrays. Según el Análisis de Microarray Suite 5,0 software (MAS 5,0; Affymetrix), el 34% y el 36% de los genes que se informaron como "presente" en el tumor RNA total se detectaron también como "presente" en la amplificación de las bibliotecas de los pacientes MEL02 y MEL10 respectivamente (Tesis transcripciones son calificados como "recuperados" en la siguiente). Las otras transcripciones informó la Microarray Suite 5,0 Análisis de software como "presente" en el tumor del ARNm, sino como "ausente" en la biblioteca correspondiente cRNA se denomina como "perdido". Con el fin de determinar los factores que influyen en el sesgo de amplificación de los genes, el tamaño de las distribuciones "perdido" y "recuperado" y se compararon las transcripciones dibujan en la figura 2A. Para ambos pacientes MEL02 y MEL10, el tamaño medio de distribución de los "recuperados" los genes (2218 y 1965 nt respectivamente) fue significativamente menor (t test, P <0.0001) que el tamaño medio de las transcripciones perdido durante el proceso de amplificación (2894 y NT 3222, respectivamente). Esto sugiere un sesgo de amplificación disfavoring grandes fragmentos como observó Wellenreuther et al. [33]. Además, los valores de fluorescencia en el tumor original de los genes como "recuperado" y "perdidos" en el cRNA se compararon como se muestra en la figura 2B. Promedio señales de 2711 y 3709 para MEL02 y MEL10, respectivamente, fueron observados por los genes presentes en la biblioteca y, por lo tanto cRNA preservados durante el proceso. En contraste, los genes "perdidos" durante la amplificación de señal tuvo un promedio de sólo 708 de 1174 y para los pacientes MEL02 y MEL10 respectivamente. Estos valores fueron significativamente menores (t test, P <0.0001) que los encontrados para el grupo de los "recuperados" los genes. De este modo, las transcripciones de mayor abundancia en el tumor original fueron conservados preferentemente durante el proceso de amplificación que mRNAs de menor abundancia finalmente se perdió.

La intensidad de la señal de fluorescencia de los genes como "presente" en el tumor y la correspondiente cRNA bibliotecas se dibujan en la figura 3. La correlación de los factores de una regresión lineal fueron 0,55 y 0,42 para los pacientes MEL02 y MEL10 bibliotecas, respectivamente, lo que confirma que el ARNm de amplificación es bastante heterogéneo. Sin embargo, en el grupo de "recuperado" las transcripciones no se evidenció una correlación significativa entre la transcripción de su tamaño o la intensidad de la señal en el tumor de origen y su factor de amplificación durante la clonación (datos no presentados).

Paciente específicos de la expresión génica

Con el fin de evaluar la pertinencia de la autólogo enfoque, la intensidad de la señal de los genes presentes en las metástasis de MEL02 y MEL10 fueron comparados en la figura 4. Como era de esperar, las dos muestras de melanoma eran muy similares con un coeficiente de correlación de una regresión lineal de 0,75 para el 6693 genes compartidos entre los dos tumores. Sin embargo, los dos tejidos mostraron perfiles específicos con 3222 y 483 ARNm expresado sólo en las transcripciones del paciente MEL02 y MEL10 metástasis respectivamente. Estos antígenos específicos de los pacientes podría representar especialmente interesante inmunológicos objetivos [13], y abogar por la inyección de tumor autólogo cRNA en lugar de la utilización de la biblioteca cRNA derivados de líneas de células tumorales como una vacuna.

Varios antígenos tumorales están presentes en las bibliotecas de cRNA

Las transcripciones muestran señales de la más alta fluorescencia cRNA inyectado en la biblioteca se detallan en el cuadro 2 para MEL02 paciente. Entre los 30 genes que muestra la más alta representación de las señales probablemente más abundantes transcripciones, 13 ya han sido descritas como implicada en la génesis tumoral o como se observó sobreexpresa en diferentes tipos de cáncer. El bien definido y ampliamente utilizado tumor antígeno Melan-A se encuentra como una de las más abundantes transcripciones que muestran la pertinencia de cRNA bibliotecas como las vacunas de melanoma. Además, la presencia en la biblioteca de inyectado muchos otros "relacionados con el tumor" rara vez se utiliza antígenos en las vacunas objetivos destaca el potencial de dicho producto para vacunar a los pacientes contra un gran grupo de TAAs.

Conclusión

Con el fin de vacunar a los pacientes con melanoma metastásico con tumor autólogo amplificado derivados cRNA, quince bibliotecas fueron producidos usando un método modificado SMART. A pesar de un tumor heterogéneo de amplificación de genes, este método nos han brindado una fuente ilimitada de tumor y el paciente específico TAAs. En efecto, el análisis de microarrays de las bibliotecas se indica la presencia de gran número de copias de conocidos los antígenos asociados tumor como Melan-A, sino también de abundantes antígenos relacionados con el tumor poco orientados en la inmunoterapia. Aunque no se abordan en el presente trabajo, este método también puede permitir la orientación de las mutaciones específicas de tumor. Estas características hacen de la amplificación de mRNA tumor el método de elección para obtener fácilmente cantidades ilimitadas de la codificación del ARN del paciente para TAAs específicas que se pueden aplicar como inmunoterapia antitumoral.

Materiales y métodos
Muestras tumorales

Inmediatamente después de la cirugía, los tejidos metastásico plenamente informado de los pacientes (n º aprobación del comité de ética.: 269/2002) fueron en picado ~ 0,1 cm 3 piezas, y sumergido en RNAlater solución de Ambion (Hungtingdon, Reino Unido), y almacenados a 4 ° C hasta el momento de la identificación histológica del melanoma como un patólogo experimentado.

Tumor total de la extracción de RNA

ARN total fue extraído de los tumores utilizando el RNeasy mini kit de Qiagen (Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del proveedor. En breve, de 15 a 30 mg de muestras colocados en un tubo de 2 ml eppendorf snap-fueron congelados en un baño de nitrógeno líquido y perturbado con micropistils de Eppendorf (Hamburgo, Alemania). Tumor seco se resuspendió en buffer RLT, homogeneizada a través de una aguja de calibre 20-y digerido con 200 μ g de proteinasa K (Qiagen) a los 55 ° C durante 10 min. Las muestras fueron luego aclaró, cargado en RNeasy mini columnas, lavado y, por último, en eluyen 50 μ l de RNAse libre de agua. ARN fue cuantificado por espectrofotometría UV (OD 260 / OD 280 proporción era de más de 1,8 en todos los casos) y se analizaron en un 1,2% formaldehído / gel de agarosa.

Biblioteca de cDNA generación

Bibliotecas de cDNA tumor RNA total se generaron utilizando el Creador ligeramente modificada SMART ™ ™ PCR cDNA biblioteca kit de construcción de BD Biosciences Clontech (Heidelberg, Alemania). En pocas palabras, 1 μ g de ARN total fue transcrita invertir usando SMART ™ IV y III CDS / 3 'oligo-dT primers proporcionados por el fabricante. Después de la terminación de la reacción, 2 μ l de cDNA se amplificó Ventaja 2 utilizando el kit de PCR (BD Biosciences Clontech). ADN polimerasa fue inactivada con proteinasa K y de la biblioteca de cDNA fue digerida con 200 U Sfi I de la enzima. CDNA bibliotecas fueron entonces purificados de gel en un gel de agarosa al 1% y fragmentos de 300 pb y 10 kbp fueron extraídas con EZNA ™ Gel kit de extracción de Peqlab GmbH (Erlangen, Alemania). Después de la precipitación, la biblioteca de cDNA se ligated a dephosphorylated Sfi I-digeridos RNactive ™ vector proporcionada por CureVac GmbH (Tübingen, Alemania), separados en tres reacciones para optimizar vector / inserto ratios.

Clonación

Los tres ligadura de los productos se utilizaron para transformar XL10-Gold ultracompetent células de Stratagene (Heidelberg, Alemania). Para el análisis, 1 y 10 μ l de caldo de transformación se chapada en el 2 LB-ampicilina y placas de agar, la cultura después de la noche a la mañana a 37 ° C, el número de clones fue contado. Las inserciones de 8 clones por transformación fueron amplificados por PCR usando primers de acompañamiento a la inserción y sitios de los amplificados fueron analizados en un gel de agarosa al 1%. Las bibliotecas que tengan más de 10 4 clones / ml y menos de 20% de los no clones recombinantes, se ampliaron en tres 300 ml maxicultures en 2X LB-ampicilina mediano durante 20 horas a 33 ° C con el fin de limitar la amplificación desigual de los clones.

ADN preparación y linealización

Maxicultures se combinaron, por centrifugada a 5000 rpm durante 10 minutos y se extrajo ADN plásmido usando EndoFree plasmídico Maxi (Qiagen). Después de las precipitaciones, de 100 μ g de la biblioteca de cDNA fueron digeridos con 100 U de la enzima I No. Después de fenol / cloroformo ammoniumacetate extracción y precipitación, linealizadas cDNA bibliotecas se resuspendido en agua libre de RNAse, cuantificado por espectrofotometría UV (OD 260 / OD 280 proporción era de más de 1,8 en todos los casos) y se analizaron en gel de agarosa al 1%.

CRNA transcripción in vitro

Veinte a cien microgramos de la biblioteca de cDNA lineal fueron transcritos in vitro utilizando T7 mRNA Optikit de CureVac GmbH. Después de la síntesis de ARNm, la plantilla de la DNA fue digerido con 40 a 100 U de DNAse recombinante que he adquirido de Ambion. ARNm se precipitó LiCl, fenol / cloroformo purificado, NaCl precipitado, y finalmente resuspendido en PBS. CRNA se filtro esterilizado (0,2 μ m), el calor desnaturalizado a 80 ° C durante 10 min antes de final de alicuotear estéril. CRNA se cuantificó por espectrofotometría UV (OD 260 / OD 280 proporción era de más de 1,8 en todos los casos) y se analiza en el 1,2% formaldehído / gel de agarosa. Esterilidad de cRNA se verificó inoculando LB medio (en todos los casos, no se observó el crecimiento bacteriano después de 4 días a 37 º C) y el contenido de endotoxina se determinó a través de Bio-Whittaker (Verviers, Bélgica) ensayo LAL kit (endotoxina contenido fue siempre por debajo 7 UE / ml).

Clonar secuenciación

Para cada biblioteca, 3 colonias por transformación fueron recogidos al azar-con una pipeta de punta y utilizado para inocular 3 ml de LB-ampicilina medio. Después de la noche a la mañana la cultura a 37 ° C, se extrajo ADN plásmido usando EZNA miniprep kit (Peqlab). Clonar secuenciación se realizó a través de ABI Big Dye y un primer promotor T7. Secuencias fueron purificados en Autoseq. G-50 columnas (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania), se ejecutan en un 310 Genetic Analyzer ™ de ABI PRISM (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania) y se analizaron con el software 3.4.1 Análisis de Secuencia (ABI PRISM). Finalmente, el algoritmo de BLAST [36] fue utilizado para identificar coincidencias con los genes conocidos.

Microarray análisis

Análisis de la expresión de ARN total tumor tumor cRNA amplificado y se realizó en el HG-U133A microarrays de Affymetrix (High Wycombe, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante eucarióticas muestra y procesamiento de gama estándar de procedimiento [40], que se basa en el método ICV originalmente descrito por Van Gelder et al. [41]. En pocas palabras, 1 ª línea de la síntesis de ADNc se realizó utilizando un oligo (dT) 24 cartilla que contiene una secuencia promotora T7. Después de la degradación del ARN plantilla de cDNA y el segundo capítulo la síntesis de ADNc, ARN complementario (cRNA) fue transcrita in vitro utilizando biotina PNT y T7 RNA polimerasa. Después de la purificación utilizando columnas RNeasy (Qiagen), 18 μ g de biotina-etiquetados cRNAs fueron fragmentados por metal inducida por hidrólisis. Hibridación, manchas, y el escaneo de microarrays se han realizado por el Servicio de Tubinga Microarray. Imágenes escaneadas fueron procesados mediante el análisis de Microarray Suite 5.0 (MAS 5,0; Affymetrix) y de expresión las diferencias entre el tumor y la biblioteca de muestras fueron determinados por algoritmos de comparación de referencia proporcionada por el software. Los datos fueron tratados posteriormente con Microsoft Access ™ y Excel ™.

Contribuciones de los autores

JPC llevaron a cabo la extracción total del tumor RNA, la producción de mRNA bibliotecas, el análisis de los clones, participó en el análisis de microarrays de ARN muestras, evaluaron los datos de los microarrays y redactó el manuscrito. OS llevó a cabo el análisis de microarray de RNA de muestras con la ayuda de la Microarray Facility Tübingen. BW CG y el paciente lleva a cabo para la contratación de personal y la preparación de muestras de tumor. JP, y BS RT participado en el diseño del estudio, el desarrollo de la labor y ayudó a redactar el manuscrito. CG, IH, HGR y SP concebido, diseñado y coordinado este estudio. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

JPC cuenta con el apoyo de un "Fortüne" beca de la Universidad de Tübingen y JP cuenta con el apoyo de la DFG Graduiertenkollegue "Infektionsbiologie" de Tübingen.