Journal of Negative Results in Biomedicine, 2005; 4: 7-7 (más artículos en esta revista)

Un ampliado sindical pantalla en la esclerosis múltiple utilizando 202 marcadores de microsatélites de orientación relacionados con la apoptosis genes no revela nuevos factores predisponentes

BioMed Central
René Gödde (rene.goedde @ ruhr-uni-bochum.de) [1], Stefanie Brune (Steffi.Brune @ web.de) [1], Peter Jagiello (peter.jagiello @ ruhr-uni-bochum.de) [ 1], Eckhart Sindern (eckhart.sindern @ ruhr-uni-bochum.de) [2], Michael Haupts (michael.r.haupts @ ruhr-uni-bochum.de) [3], Sebastián Schimrigk (sebastian.schimrigk @ Ruhr-uni-bochum.de) [4], Norbert Müller (norbert.mueller @ medizin.uni-essen.de) [5], Jörg T Epplen (joerg.t.epplen @ ruhr-uni-bochum.de) [ 1]
[1] Departamento de Genética Humana, de la Universidad de Ruhr, Bochum, Alemania
[2] Departamento de Neurología, Kliniken Bergmannsheil, Ruhr-Universität, Bochum, Alemania
[3] Departamento de Neurología, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr-Universität, Bochum, Alemania
[4] Departamento de Neurología, Hospital de San Josef, de la Universidad de Ruhr, Bochum, Alemania
[5] Departamento de Medicina de Transfusión, Universitätsklinikum Essen, Essen, Alemania

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Resumen

Apoptosis, la muerte programada de las células, juega un papel en la etiopatogenia de la esclerosis múltiple (EM), una enfermedad común del sistema nervioso central con antecedentes genéticos complejos. Sin embargo, no está claro si el impacto de la apoptosis se debe a un comportamiento alterado apoptótico causado por las variaciones de los genes relacionados con la apoptosis. En cambio, la apoptosis en la EM también pueden representar una respuesta secundaria al estrés celular en la inflamación aguda en el sistema nervioso central. En este sentido, examinados 202 genes relacionados con la apoptosis de asociación por genotipo 202 marcadores de microsatélites inicialmente en 160 pacientes con EM y 160 controles, ambos divididos en 4 series de muestras de ADN combinada, respectivamente. Al aplicar la corrección de Bonferroni, que no existen diferencias significativas en frecuencias de los alelos fueron detectados entre los pacientes con EM y los controles. Sin embargo, optamos 7 marcadores para retyping individuales en muestras de ADN, con lo que la eliminación de los marcadores 6 de la lista de candidatos. Los restantes candidatos, el gen ERBB3 microsatélite, se genotipo adicionales en 245 pacientes con EM y los controles. No ERBB3 asociación de la marca con la enfermedad se detectó en estas nuevas cohortes. En consecuencia, no hemos encontrado una prueba más de la apoptosis genes relacionados con factores de predisposición como en la EM.

Introducción

La esclerosis múltiple (EM) es una de las enfermedades neurológicas más comunes de principalmente de los adultos jóvenes [1]. Ha sido predominantemente caracterizada como una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central (SNC), con lo que la mielina y daño axonal y la formación de placas focales desmielinizadas. Mielina de las células T reactivas entrar en la CNS a través de la barrera hematoencefálica y mediar en los eventos inflamatorios observados [2]. Si bien la contribución de los elementos disfuncionales del sistema inmune en la EM desarrollo de la enfermedad ha sido ampliamente aceptado desde los primeros días de investigación de la EM [3 - 5], la influencia de la apoptosis y la muerte neuronal en placas inflamatorias agudas en parte ha sido tenida en cuenta. Sin embargo, los últimos conocimientos sobre la patogenia de la EM sugieren diversos impactos de la apoptosis en este trastorno neurológico, aunque la contribución a la susceptibilidad a la enfermedad sigue siendo difícil de alcanzar.

Predisposición a la enfermedad depende de los factores genéticos y ambientales, como se ha demostrado por estudios en gemelos [6] y en virtud de la latitud que dependen de la distribución geográfica [7], por lo tanto, la asignación de miembros a la gran familia de las comunes enfermedades multifactoriales, por lo menos en el Hemisferio norte. A pesar de la influencia de esos factores predisponentes, la etiopathological mecanismos subyacentes, así como la mayoría de los factores genéticos responsables de la predisposición a MS siguen siendo en gran medida indefinido. Hasta ahora, la única asociación constante se ha demostrado con el HLA-DRB1 * 1501-DQB1 * 0602 haplotipo en pacientes con EM de ascendencia europea [8 - 10].

Apoptosis, la auto-controlados muerte de las células, es un fisiológicas' suicidio programa "que conduzca a la eliminación selectiva de células específicas, ya sea porque se convierten en indispensables en sus tejidos medio ambiente o nocivo a través de la infección, la transformación maligna o, en general, la mutación. En cuanto a la EM, alteración de la apoptosis puede resultar en elevados números o ampliada persistencia de la mielina de las células T reactivas en el SNC de tejidos, el aumento de los procesos inflamatorios observados [11, 12]. Por otro lado, la apoptosis de las células neuronales y gliales sus acompañantes en el agudo y activo MS lesiones recientemente se ha demostrado y puede dar cuenta de la mayor parte de la discapacidad adquirida en el tiempo [13 - 17]. Por lo tanto, cuando la determinación de genes candidatos para MS estudios de asociación, los factores que intervienen en la regulación y ejecución de la muerte celular programada debe considerarse suplementarios a los que actúan en la disregulación del sistema inmune.

Se realizó una asociación en la pantalla de 202 marcadores de microsatélites en o cerca al candidato putativo MS genes relacionados con la apoptosis y el sistema inmune utilizando específicamente diseñado cebadores de ADN y se agruparon en un diseño de caso-control, tal como se describe anteriormente [18]. Ese 'indirecta' enfoque estrictamente depende de la presencia de vinculación desequilibrio (LD) entre ciertos alelos de un marcador microsatélite predisponentes y la correspondiente mutación en el gen candidato cercano. Asociación se puso a prueba por medio de tablas de contingencia comparando las frecuencias alelo en pacientes con EM y los controles. Posteriormente, en el caso de los marcadores se encontraron asociados, se realizó la genotipificación de microsatélites de ADN individuales, excluyendo así a las asociaciones de falsos positivos resultantes de artefacto introducido por la puesta en común de ADN.

Materiales y métodos
Paciente y el control de muestras de ADN

Todas las personas que participan en este estudio dieron su consentimiento por escrito para el análisis genético. Muestras de sangre periférica> 600 donantes de sangre sanos fueron proporcionados por el departamento de trasplante e inmunología de la Universidad hospital Eppendorf (Hamburgo, Alemania) y el departamento de medicina transfusional del hospital de la Universidad de Essen (Essen, Alemania). Los más de 800 pacientes con EM no vinculados clasificados de acuerdo con los criterios de Poser [19] y que asisten a los Departamentos de Neurología, Clínica de la Universidad de Bochum (Alemania), fueron incluidos. Se extrajo el ADN de los leucocitos de sangre periférica mediante métodos estándar [20]. La calidad de cada uno de los ADN fue evaluada por la separación en geles de agarosa 0,7%.

Puesta en común de ADN

El empleo de un conjunto de muestras de ADN de microsatélites en el genotipo introduce errores [9], a menos que se realiza la puesta en común absolutamente precisa. La concentración de ADN de cada individuo se cuantificó por triplicado utilizando la medición espectrofotométrica y después diluirse a un final de 50 ng / μ l. Después de verificar una vez más las concentraciones de estas dos veces, 40 AND individuales se combinaron en una piscina de ADN de una concentración final de 25 ng / μ l. De esta manera, el 4 de ADN piscinas fueron creadas para pacientes con EM y los controles, respectivamente. Usando subpools evita errores cuantitativos, ya que cada alelo perfil de imagen (AIP), de los microsatélites es estadísticamente comparado con los otros subpool del grupo respectivo.

Marcadores de microsatélites

Intragenic microsatélites o, si no disponibles, los microsatélites localizados en la vecindad inmediata (<50 kb) de los genes específicos fueron incluidos. Para todos los genes representados por marcadores de microsatélites, secuencias de oligonucleótidos, distancias a la gen específico, y más informaciones se presentan en la página web http://www.ruhr-uni-bochum.de/mhg/marker_information.pdf Marcadores. Sólo con igualdad de los marcadores "subgrupo dentro de la" alelo distribuciones con ≥ 2 alelos se incluyeron en los análisis posteriores. Todos los marcadores asoció significativamente (p ≥ 0,05) fueron posteriormente genotipo individual (véase más adelante).

Cola primer reacción en cadena de polimerasa (PCR)

Se utilizó un universal de fluorescencia con etiqueta de cola oligonucleótido añadido a los 5 'parte de la secuencia específica para el primer fragmento de análisis automático. La cola (5'-CATCGCTGATTCGCACAT-3 ') fue diseñado para ser propensas estructura secundaria, y su secuencia se "desparramó" a la base de datos NCBI genoma humano [21] no ceder importantes homologías. De genes específicos de la aplicación de los microsatélites se eligieron-masker repetir la elección de la Santa Cruz genoma navegador [22]. Primers se han diseñado y ajustado a una temperatura de fusión de 55 ° C utilizando el Primer Software Express 2,0 (ABI). La amplificación se realizó mediante tres oligonucleótidos: (1) un ejemplo de cola hacia adelante (de cola F), (2) un primer invertir y (3) un primer etiquetados (denominado M) correspondiente a la secuencia 5'-cola de la cola F. condiciones de PCR Fueron las siguientes: 1 × PCR buffer (Qiagen), 1,5 pmol etiquetados F, 0,2 mM de cada dNTP, 3 mM MgCl 2, 0,2 pmol de cola F, 1,5 pmol invertir ejemplo, 0,25 U Taq Qiagen Hot Start (Qiagen) y 50 ng de DNA . Las reacciones de PCR se realizaron con una primera fase de activación a 95 ° C durante 15 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 1 min, recocido a 55 ° C por 1 min y extensión a 72 ° C por 1 min, y un final Extensión a 72 ° C durante 10 min.

Electroforesis y genotipado

Electroforesis se llevó a cabo a 96-así ABI377 losa-gel sistema. Alícuotas de 1,0 μ l de productos de PCR y 2 μ l de fluorescentes escalera (MegaBACE ET400-R Tamaño estándar; Amersham) fueron mixtos. A 1 μ l de muestra de esta mezcla se cargó en un 4,5% de poliacrilamida (PAA) que contenga 5,625 ml de gel de 40% (19:1) PAA, 18 g de urea, 5 ml 10 × TBE buffer (90 mM Tris-borato, 2 mM EDTA , PH 8.3), 25 ml de H 2 O bidestilada, 30 μ l 10% ammoniumpersulphate y 20 μ l Tetramethylethylendiamin. Antes de la polimerización, la mezcla de gel fue filtrada a través de un-0,2 μ m de filtros de membrana. Electroforesis se ejecute utilizando protocolos estándar ABI. Raw datos se analizaron mediante el software Genotyper (ABI), lo que arroja un marcador específico AIP. AIP consistirá de una serie de picos con alturas diferentes que corresponden a los respectivos alelo distribución de frecuencia dentro de cada grupo analizado el ADN.

Estadísticas para el alelo comparación de las frecuencias

Asociación fue probado por comparación de la MS y de control de AIP. Peak alturas se normalizaron en función del número de alelos por piscina de espera (n = 80). Los promedios de cada pico (cada alelo) se calculará en función de la total alelo contar. Alelos con frecuencias <5% y se añadieron hasta considerarse como un alelo. Caso y el control combinado de las distribuciones de control de piscinas y MS, respectivamente, fueron posteriormente comparados estadísticamente por medio de tablas de contingencia. Por lo tanto, p valores nominales son aproximados y debido a la utilización de las estimaciones de los cargos en lugar de observar las frecuencias de los alelos. Con el fin de seleccionar los marcadores para futuras investigaciones, sin corregir los valores p fueron ordenadas de acuerdo con sus pruebas de la asociación [23]. Marcadores que muestran las diferencias más significativas entre los pacientes con EM y los controles fueron elegidos para un nuevo análisis por genotipo individual.

Genotipo del individuo

PCR de un conjunto de muestras de ADN pueden introducir objetos que puedan causar un aumento de la tasa de resultados de falsos positivos, es decir, las diferencias entre las piscinas puede parecer exagerado. Por lo tanto, la mayoría de conspiciously diferentes marcadores fueron genotipo individual en muestras de ADN de los pacientes y los controles, tanto de la original piscinas (tanto n = 160), así como otras cohortes de pacientes y de control (tanto n = 245) y en condiciones similares, tal como se utiliza para ITP piscina. Asociación se analizó por comparación de las frecuencias de los alelos de microsatélites de la MS con la cohorte correspondiente alelo en el grupo control de la prueba de Chi cuadrado.

Resultados y discusión

La evaluación estadística de 202 marcadores de microsatélites en 160 pacientes con EM y 160 controles combinados en 8 piscinas de ADN, cada uno integrado por 40 personas, respectivamente, con marcadores de 7 reveló diferencias significativas entre las frecuencias de los alelos de los pacientes con EM y los controles (Tab. 1].

Sin embargo, a excepción de NOS1, no superó marcador límite importancia, y la corrección de Bonferroni para múltiples ensayos (n = 202) no eliminar todos los resultados importantes. Sin embargo, los 4 más prometedor marcadores fueron escogidos para profundizar el análisis de cada genotipo, y por tanto excluyendo posibles artefactos introducidos a través de la puesta en común de ADN y eludir la necesidad de corrección masiva: ERBB3 (V-erb-b2 erythroblastic leucemia viral oncogén homólogo 3), NF κ B2 (nuclear Κ factor de la luz del polipéptido potenciador de genes en las células B-2), β NGF (factor de crecimiento del nervio β) y NOS1 (óxido nítrico sintasa 1). El alelo observado frecuencias individuales de un conjunto de muestras de ADN y se comparan en la Fig. 1.

Alelo frecuencias fueron contados a partir de los distintos genotipos y en comparación estadísticamente según AIP resultantes de análisis de ADN combinada con la misma 160 pacientes con EM y los controles. En el caso de alelos adicionales fueron detectables, sólo los alelos que se observaron en ambos experimentos se analizaron. Los resultados de las pruebas estadísticas se muestran en la tabla 2.

Al parecer, el 3 de los 4 comparaciones individuales y mancomunados de las AND muestran diferencias sustanciales. Sólo el microsatélite cerca de la ERBB3 gen se mantuvo asoció significativamente cuando los mismos fueron muestras de ADN nueva dactilografía individualmente. Para el NF κ B2, NGF y β NOS1 genes, las comparaciones de las frecuencias de los alelos mancomunados e individualmente-mecanografiados muestras de ADN (Fig. 1] muestran un importante y típico artefacto [9]. ADN polimerasas tienden a amplificar corto preferentemente en favor de los alelos ya alelos (dependiente de la longitud de amplificación). Por lo tanto, en ITP agrupados sobre la base de muestras de ADN, la más corta alelos de un marcador microsatélite será con frecuencia excesivamente representados en el producto resultante de PCR. Este efecto es más evidente en el marcador NOS1, donde uno de los alelos observada en el grupo de experimento obviamente sólo resultados de los citados efectos. También en NGF β, los alelos 1 y 2 fueron significativamente más representadas en la pantalla usando mezcla de ADN, lo que resulta en una falsa asociación positiva. Sólo para el ERBB3 gen, el alelo frecuencias observadas en el experimento escribiendo sobre la base de ADN combinada adecuadamente corresponden a las frecuencias de forma individual a máquina.

Con el fin de validar la asociación de ERBB3 con EM, se realizó un genotipo de otro cohorte de 245 pacientes con EM y los controles, respectivamente (las frecuencias se muestran en la Fig. 2].

El análisis estadístico de este último alelo reveló una distribución de frecuencias no significativa p valor de 0,325. Por lo tanto, la asociación de los ERBB3 de microsatélites no se pudo confirmar en el ADN adicional de cohortes de pacientes con EM y los controles.

En conclusión, no hemos encontrado pruebas en su apoyo para la participación de la apoptosis en los genes relacionados con la predisposición a la MS. Sin embargo, dicha contribución no se puede excluir basado exclusivamente en nuestros experimentos, por diversas razones. Sólo una fracción de todos los genes relacionados con la apoptosis ha sido incluido en nuestro estudio y, por lo tanto, muchos más genes candidatos que pueden representar auspicioso. Además, como nuestro enfoque depende exclusivamente de la presencia de LD entre un marcador de predisposición y una mutación, la falta de LD entre los microsatélites y su correspondiente gen también dará lugar a un resultado negativo. Como el proyecto HapMap-[24] que progresa rápidamente y, por lo tanto, la información acerca de la estructura de bloques de haplotipos del genoma humano aumenta mucho, tal vez pronto sea posible volver a evaluar nuestros resultados negativos con respecto a la estructura de bloques de haplotipos del gen en estudio.