Thrombosis Journal, 2005; 3: 12-12 (más artículos en esta revista)

El análisis de la coagulación de la sangre en ratones: la validez de las condiciones de análisis y evaluación de un ensayo casero de los complejos trombina-antitrombina

BioMed Central
Dirkje W Sommeijer (dwsommeijer@hotmail.com) [1], René van Oerle (RVO@LHLE.AZM.NL) [3], Pieter H Reitsma (phreitsma@amc.uva.nl) [1], Janneke J Timmerman ( H.spronk @ gmail.com) [1], CM Joost Meijers (j.meijers @ amc.uva.nl) [2], Henri MH Spronk (henri.spronk @ bioch.unimaas.nl) [3], Hugo diez Cate (h.tencate @ bioch.unimaas.nl) [3]
[1] Laboratorio Experimental de Medicina Interna, del Centro Médico Académico de Amsterdam, Amsterdam, Países Bajos
[2] Departamento de Medicina Vascular, el Centro Médico Académico de Amsterdam, Amsterdam, Países Bajos
[3] Laboratorio de Hemostasia y Trombosis Clínico, Departamento de Medicina Interna, y el Instituto de Investigación Cardiovascular de Maastricht, de la Universidad de Maastricht, Países Bajos

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Resumen
Antecedentes

El uso de modelos de ratón para el estudio de trastornos trombóticos ha ganado cada vez más importancia. Métodos de medición de la activación de la coagulación en ratones, sin embargo, escasos. El principal objetivo de este estudio fue desarrollar un ratón trombina-antitrombina (TAT) ELISA para la medición de la activación de la coagulación y compararla con dos ensayos comercialmente disponibles para humanos complejos TAT. Además, encaminadas a mejorar los métodos de anticoagulación ratón plasma y preparación.

Métodos y resultados

En primer lugar, para la medición de complejos TAT-en el plasma un ratón específico TAT-ELISA fue desarrollado utilizando anticuerpos policlonales de conejo planteadas contra del ratón y la rata trombina antitrombina, respectivamente. Este ELISA detectó un aumento en los niveles de TAT, en un ratón modelo de endotoxemia. Dos pruebas ELISA comerciales TAT humanos parecen ser menos específicas para ratón-rata trombina antitrombina complejos.

En segundo lugar, para evitar la coagulación de la sangre del ratón se citrato de sodio, ya sea mezclado con sangre durante la recogida o en una jeringa se inyecta por vía intravenosa inmediatamente antes de la extracción de sangre. Intravenosa citrato de sodio inhibe completamente la coagulación de la sangre resultante en el plasma con bajos niveles de TAT. Citrato de sodio mezcladas con sangre durante la recogida dado lugar a un aumento en los niveles de TAT 4 de un total de 16 muestras de plasma. En tercer lugar, heparinase se agregó a muestras de plasma in vivo después de la inyección de diferentes dosis de heparina para probar su efecto neutralizante. Heparinase neutralizado hasta un 20 U de heparina / ratón y dio como resultado exacto APTT y determinaciones de factor VIII.

Conclusión

Estos procedimientos de plasma y reactivos para la preparación de las pruebas de coagulación y mejorar los estudios sobre los trastornos trombóticos en ratones.

Antecedentes

Desde la identificación de los genes que codifican las proteínas de coagulación del ratón y la creación de un número cada vez mayor de los ratones transgénicos, el uso de modelos de ratón para el estudio de trastornos trombóticos ha ganado cada vez más interés [1]. Si bien la metodología para determinar la deposición de fibrina en los tejidos [2] y cuantificación de la formación de trombo [2, 3], es de fácil acceso, la utilización óptima de las muestras de sangre de los ratones sigue siendo un área poco explorada.

La disponibilidad de ensayos de laboratorio adecuado es esencial para la coagulación de activación de estudio en ratones, comparable a los seres humanos. Sin embargo, hay una sorprendente falta de métodos de análisis para los ensayos de activación de la coagulación concretamente en ratones. Para los estudios en humanos, varios ensayos comerciales están disponibles, incluidos los ensayos de la trombina-antitrombina (TAT) de los complejos de la prueba in vivo de activación de la coagulación [4, 5]. Cuando estos ensayos, en base a la detección de anticuerpos de la proteína humana epítopos, se aplican en plasma de ratón, es probable que las dificultades que pueden surgir en función del grado de reactividad cruzada entre, sensibilidad y especificidad.

Una cuestión de importancia práctica es que, tradicionalmente, la investigación sobre la coagulación de la sangre depende de la determinación de la actividad de factores de coagulación en una muestra de plasma. Para este propósito específico anticoagulantes, incluidos citrato de sodio o cócteles de sustancias que han de añadirse a las muestras de sangre, con el fin de prevenir la coagulación ex vivo. Si bien los seres humanos, incluso en la recogida de muestras de plasma adecuado no está exenta de problemas prácticos, la recogida de plasma de los ratones es uno de los principales desafíos. Hasta donde sabemos, no existen procedimientos publicados para anticoagulación que se ocupa específicamente de toma de muestras de plasma en el ratón.

El uso de modelos de ratón permite que las investigaciones sobre el mecanismo de activación de la coagulación en el plasma, así como sus consecuencias, es decir, la deposición de fibrina y cambios patológicos en los órganos, al mismo tiempo. Sin embargo, para una buena colección de tejidos como los procedimientos heparinization son frecuentemente requeridos, la mayoría, lo que dificulta las pruebas convencionales de coagulación plasmáticos. Estudios en humanos muestran que además de las muestras de plasma a heparinase neutralizado hasta 2 U / ml de heparina lo que precisa del factor VIII determinaciones [6]. Con el fin de minimizar la interferencia de la heparina probamos el efecto de heparinase añadido a las muestras de plasma de ratón in vivo siguientes heparinization.

En este estudio se ha desarrollado un nuevo ratón TAT ELISA específico y validado este método utilizando un modelo de ratón de endotoxemia, que se caracteriza por una mayor activación de la coagulación. Además, este nuevo ELISA en comparación con dos inmunoensayos humanos disponibles en el comercio para medir los complejos trombina-antitrombina ratón en el plasma muestras recogidas por los diferentes procedimientos de recogida de sangre.

Métodos
Animales

Todos los estudios se realizaron en ratones machos de la C57Bl / 6 cepa (Universidad de Maastricht o el Centro Médico Académico de Amsterdam), que fueron 8 semanas de edad y con un peso aproximado de 20 gramos al comienzo de los experimentos. Los animales fueron alojados en jaulas normal en un entorno con 12 horas de luz-oscuridad ciclo, control de la temperatura (20 ± 2 ° C) y humedad (50 ± 10%). Los animales tuvieron libre acceso al agua y la alimentación (Esperanza Farms, Woerden, Países Bajos). Endotoxemia se han realizado estudios por ip inyección de 2 mg de lipopolisacárido (LPS, E. coli, Sigma, St.Louis, MO) por kg. El Comité de Ética Experimental Animal de la Universidad de Maastricht y de la Academic Medical Center, Amsterdam, aprobó todos los protocolos experimentales.

Productos Químicos

Todos los reactivos fueron de grado analítico o superior y fueron comerciales de los proveedores.

In vitro de la generación de complejos TAT -

TAT-complejos fueron generados in vitro de acuerdo con el método de Boisclair et al. (7). En resumen, 50 μ g ratón trombina y 140 μ g rata antitrombina fueron disueltos en 330 μ l TAT-buffer (50 mM Tris, 175 mM NaCl, 0,02% azida sódica, 0,1% PEG-6000, el 4% de BSA, pH 7,9) y se incubaron durante 45 Minutos a 37 ° C. Las muestras fueron alicuotar en 20 μ l porciones y congelados a -20 ° C.

Western blot

Western blot muestras fueron preparadas de la siguiente manera: 5 μ l 5x muestra buffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glicerol) se agregó a 20 μ l de la trombina (50 μ g / ml), 20 μ l AT (50 μ g / Ml) o 20 μ l in vitro de los complejos TAT. Las muestras fueron preparados sin adición de β-mercaptoetanol y no desnaturalizado por calentamiento debido a los resultados en esta agregación de los complejos TAT in vitro en el PEG-6000 que contiene buffer. Muestras de plasma fueron preparados por la combinación de 20 μ l de plasma, 20 μ l 5x muestra de amortiguación y 60 μ l de H 2 O. Diez μ l de cada muestra fue separada en un 7,5% de acrilamida en gel y transferidos por electroblotting a un filtro de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania). Después de lavar por 5 minutos con PBS / 1% de Tween y el bloqueo de 1 hora a RT en PBS/Tween/5% (v / v) de leche de los filtros se incubaron con 1 / 1000 de suero de conejo diluido en PBS / Tween. Después de tres lavados de 10 minutos con PBS / Tween la blots se incubaron durante 1 hora a RT-conjugado con HRP porcina IgG anti-conejo diluido 250 veces en PBS / Tween. Por último, el blots fueron lavadas con PBS / Tween y H 2 O e incubadas con un sustrato chemoluminescencent (LumiLight, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). El pre-teñidos de bajo rango SDS PAGE marcadores (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) se utiliza como marcador de peso molecular.

Sandwich ELISA complejo TAT -

TAT-niveles en plasma fueron detectados con el nuevo ratón TAT ELISA de la siguiente manera: MaxiSorp placas estaban cubiertas durante la noche a 4 ° C con 100 μ l purificado los anticuerpos anti-trombina en una concentración de 1 μ g / ml en el revestimiento de amortiguación. Posteriormente, las placas fueron lavadas tres veces con PBS / Tween y se incubaron con 50 μ l estándar o 4 veces diluida de plasma en PBS / Tween / FCS durante 1 hora en un agitador a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS / Tween y se incubaron con 100 μ l purificada DIG-AT conjugadas anti-anticuerpos en una concentración de 0,5 μ g / ml durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS / Tween y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 μ l ovejas conjugado HRP-F (ab) 2 anti-DIG fragmentos (Roche Diagnostics) diluido en PBS / Tween. Las placas fueron desarrollados con OPD durante 30 minutos y después de la terminación de la reacción con 1 MH 2 SO 4 del OD se determinó en 490 y 650 nm. Un estándar para el ratón TAT ELISA fue construido con doble diluciones seriadas de la trombina ratón - rata de antitrombina complejos (Sigma) en PBS / Tween / FCS de amortiguación o el ratón plasma.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media con SEM. Las diferencias entre los dos grupos se pusieron a prueba con estudiantes' t test. Las diferencias entre los tres grupos se pusieron a prueba por una de las formas ANOVA. P <0,05 se estableció como umbral de significación estadística. Todos los cálculos se realizaron con SPPS 11,0.

Resultados
Desarrollo de un ratón TAT-ELISA
Comparación de tres TAT del ELISA in vitro

TAT-Detección de los niveles de estándar preparado in vitro de los complejos TAT-se comparó ELISA entre tres métodos: 1. El ratón específicos TAT ELISA, tal como se describe en Materiales y Métodos, 2. Los humanos específicos Enzygnost ® TAT micro de Dade Behring, y 3. El TAT ELISA humanos específicos de ERL. Uso de la TAT ELISA humanos específicos de ERL, un nivel comparable al de la curva de ratón específicos TAT ELISA fue obtenido por la dilución de la serie estándar de amortiguación (Figura 3A]. En contraste con el ratón específicos ELISA, tanto kits comerciales no en la detección in vitro de los complejos TAT preparado después de la dilución en el plasma del ratón (Figura 3B].

Procedimientos de recolección de plasma
Discusión

Estudiar la relación entre alteraciones de la coagulación en la sangre y en los tejidos en ratones nivel requiere de la disponibilidad de herramientas para el análisis de activación de la coagulación. En este estudio se ha evaluado varios procedimientos para la preparación de plasma y la medición de la activación de la coagulación en un modelo murino de endotoxemia. En primer lugar, se describe el desarrollo de un ratón sandwich ELISA para medir el nivel de los complejos TAT ratón en el plasma. En segundo lugar, en comparación sándwich de tres pruebas ELISA para la medición de los niveles de TAT ratón en el plasma. En tercer lugar, hemos probado diferentes técnicas de anticoagulación para prevenir la coagulación ex vivo.

El uso de las nuevas TAT ELISA hemos detectado cambios en el contenido del ratón plasma TAT 4 horas después de la infusión de endotoxina. Previamente, se demostró que la endotoxina tratamiento de los ratones produjo un aumento de los complejos TAT [8], la síntesis de ARNm TF [9] y el aumento de la deposición de fibrina tejido [10]. En voluntarios humanos infusión de endotoxina inducida por los monocitos TF mRNA expresión y de plasma F1 +2 y TAT niveles [11]. Por lo tanto, se espera un aumento de los niveles de TAT en el plasma de ratones tratados con endotoxina. De hecho, TAT niveles basales de 1,6 ± 0,4 ng / ml se incrementaron en los ratones tratados con endotoxina con los niveles máximos de 20,1 ± 9,9 ng / ml después de 4 horas.

Además de las específicas ratón TAT ELISA, los dos disponibles en el comercio humano TAT pruebas ELISA, Enzygnost ® TAT micro de Dade Behring y el TAT ELISA de los Laboratorios de Investigación de Enzimas también detectaron aumentos en los niveles de TAT tratamiento después de endotoxina en ratones. Sin embargo, diferencias significativas entre los tres ensayos se observaron. Los niveles de complejos TAT, medido con el ensayo ERL fueron alrededor de 70 veces más altos en comparación con los otros dos ensayos. Además, el ensayo de Dade Behring no puede detectar in vitro complejos TAT preparado diluido en cualquiera de amortiguación o plasma e in vivo TAT niveles no se correlacionan con los niveles medidos con el ratón específicos ELISA. Dado que los niveles plasmáticos de complejos TAT medido por el ERL ELISA correlacionada con los niveles medidos con el ratón específicos ELISA, que especulan que este ensayo tiene probablemente un poco mejor la especificidad del ratón para que los complejos TAT Dade Behring ensayo. Además, la medida podría ERL ELISA in vitro complejos TAT preparado diluido en una solución tampón. Sin embargo, la variación sustancial en medir las concentraciones de TAT sugiere que el ensayo ERL, desarrollado para su uso en plasma humano, no es suficientemente específico para el ratón complejos TAT. En additioon a estas consideraciones prácticas y las limitaciones, los considerables costes de los ensayos comerciales humano hace por comparación nuestra novela a un ensayo más baratos y probablemente alternativa fiable para el análisis de los complejos TAT ratón en muestras de plasma.

Para ex vivo anticoagulante citrato de sodio es el más comúnmente usado reactivo añadido a plasma humano. Desde que hemos experimentado con los anticoagulantes EDTA o citrato de sodio en la jeringa no siempre prevenir eficazmente ex vivo de coagulación de la sangre del ratón, un método alternativo de la anticoagulación se solicitó. Esto dio lugar a un novedoso método para anticoagulate las muestras de sangre en citrato de sodio que se inyectó por vía intravenosa en la vena cava 20-30 segundos antes de la extracción de sangre por exsanguination. En nuestros experimentos, TAT no se aumentaron los niveles en ninguna de las muestras de plasma obtenidos mediante la inyección iv de citrato de sodio método, en contraste con el método estándar en la que se añadió citrato de sodio a la sangre en la jeringa. Por lo tanto, se concluye que la anticoagulación de la sangre del ratón por inyección iv de citrato de sodio en la práctica se traduce en datos más fiables TAT y en el plasma más adecuado para profundizar el análisis de la coagulación y factores relacionados.

Para el análisis inmunohistoquímico de los tejidos patólogos pueden preferir la infusión de heparina antes de sacrificar al animal. Para determinar si este efecto anticoagulante podría ser eliminado para permitir a otros ensayos incluidos los basados en la coagulación de plasma pruebas, probamos neutralizar la actividad de heparinase ratón en el plasma. De acuerdo con los resultados en el plasma humano nos confirmó que hasta 20 unidades de heparina por ratón, la prolongación del APTT a más de 300 segundos, puede ser neutralizado con heparinase adecuadamente según lo indicado por FVIII normalizaron los niveles de actividad y APTT [6].

Conclusión

En conclusión, la hecha en casa de ELISA para ratón TAT complejos detecta después de la generación de trombina endotoxina reto en ratones. Aplicado a las muestras de sangre obtenidas después de la infusión de citrato sistémica, esta metodología puede mejorar la calidad de los estudios destinados a esclarecer la fisiopatología de la activación de la coagulación en ratones.

Lista de abreviaturas

TTPa tiempo de tromboplastina parcial activado

AT antitrombina

BSA albúmina sérica bovina

HRP peroxidasa de rábano

Lipopolisacárido LPS

PBS Solución salina tamponada con fosfato

RT temperatura ambiente

TAT complejo trombina-antitrombina

Contribuciones de los autores

Dirkje W. Sommeijer participó en la planificación, configuración experimental, el desarrollo de métodos, el análisis de las muestras y por escrito el manuscrito, René van Oerle participó en la muestra de sangre murino colecciones, el desarrollo de métodos, y el análisis de muestras de plasma, Pieter H. Reitsma fue Participan en la configuración experimental, el análisis y la redacción del manuscrito, Janneke J. Timmerman participó en el diseño y el desarrollo de anticuerpos contra la trombina y la antitrombina, Joost Meijers CM participó en el análisis, la configuración experimental, y la escritura del manuscrito, Henri MH fue Spronk Que participan en los animales de trabajo, el desarrollo de métodos, y la escritura del manuscrito, Hugo ten Cate participó en la planificación, configuración experimental, y la escritura del manuscrito.

Agradecimientos

Nos gusta dar las gracias a Willy Morriën-Salomons, Joost Daalhuisen y Ingvild Kopp del Centro Médico Académico por su asistencia. Hugo ten Cate es un investigador clínico de fundación de los Países Bajos Fundación del Corazón. Un breve resumen de la TAT laboratorio procedimiento fue previamente publicado en Weijer et al. De 2004, Diario de Enfermedades Infecciosas, 198 (12): 2308-2317