Saline Systems, 2005; 1: 3-3 (más artículos en esta revista)

Irradiación ultravioleta induce genes recombinación homóloga en el modelo archaeon, Halobacterium sp. NRC-1

BioMed Central
Shirley McCready (sjmccready@brookes.ac.uk) [1], A Jochen Müller (mueller@umbi.umd.edu) [2], Ivan Boubriak (iboubriak@brookes.ac.uk) [1], Brian R Berquist ( Berquist@umbi.umd.edu) [2], Wooi Loon Ng (wng@brookes.ac.uk) [1], Shiladitya DasSarma (dassarma@umbi.umd.edu) [2]
[1] Escuela de Ciencias Biológicas Moleculares, Oxford Brookes University, Oxford OX3 0BP, UK
[2] Centro de Biotecnología Marina de la Universidad de Maryland, Instituto de Biotecnología, 701 E. Pratt St, Suite 236, Baltimore, MD 21202 EE.UU.
[3] Molecular and Structural Biology Program, Greenebaum Cancer Center, University of Maryland, Baltimore, MD 21201, USA

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Resumen
Antecedentes

Una variedad de las estrategias de supervivencia de la irradiación ultravioleta son utilizados por las células, que van desde la reparación de ADN dañado UV-, la detención del ciclo celular, de la tolerancia no photoproducts UV, y la protección de la luz UV. Algunas de estas respuestas, la participación de genes inducidos por la radiación UV, incluida la respuesta SOS en bacterias y una serie de genes en eucariotas. Para hacer frente a los mecanismos utilizados en la tercera rama de la vida, hemos estudiado el modelo archaeon, Halobacterium sp. NRC-1 cepa, que tolera altos niveles de radiación solar en su entorno natural hipersalinos.

Resultados

Las células fueron irradiadas a dosis de 30-70 J / m 2 de radiación UV-C y un inmunoensayo mostró que el daño en el DNA resultante fue reparada en gran medida dentro de las 3 horas en la oscuridad. En esas condiciones, el perfil transcripcional mostró firmemente hasta el más regulado del gen radA1, la archaeal homólogo de rad51 / recA, que fue inducida de 7 veces. Adicionales de los genes que participan en la recombinación homóloga, como arj1 (recJ-como exonuclease), dbp (eukaryote-como la proteína de unión de ADN de la superfamilia I DNA y RNA helicases), y rfa3 (replicación de un complejo de proteínas), así como nrdJ, codificación De cobalamina dependiente de ribonucleótido reductasa que participan en el metabolismo del ADN, fue también inducida, en una o más de nuestras condiciones experimentales. Ni procariótico eucarióticas ni de reparación por escisión de genes homólogos fueron inducidos y no hay pruebas de un SOS-como respuesta.

Conclusión

Estos resultados muestran que la recombinación homóloga desempeña un importante papel en la respuesta celular de Halobacterium sp. NRC-1 daño a los rayos UV. Recombinación homóloga puede permitir el rescate de las horquillas de replicación estancado, y / o facilitar recombinational reparación. En cualquier caso, este proporciona un mecanismo para observar la alta frecuencia de recombinación entre las poblaciones naturales de arqueas halófilas.

Antecedentes

En todos los organismos estudiados hasta la fecha, la radiación UV causa inducible respuestas. En algunas bacterias la inducible SOS respuesta incluye alrededor de 40 genes que están regulados depende de la pleiotrópica regulador, LexA [1]. En eucariotas una variedad de los genes-están regulados y abajo-en respuesta a la radiación UV-daños incluidos varios genes de reparación del ADN, si bien no eucarióticas equivalente bacteriano de la respuesta SOS se ha identificado [2]. Entre arqueas, la mayoría de los estudios hasta la fecha se han limitado a la genómica comparada enfoques donde inducible mecanismos no han sido discernible [3, 4]. El arqueas hipertermófilas se han encontrado para llevar homólogos de varios eucariotas reparación por escisión de nucleótidos (NER) genes, incluyendo rad2 (FEN1 / XPG), rad3 (XPD), eif4A (rad1 / XPF), y rad25 (XPB) [5, 6] . Sorprendentemente, muy arqueas halófilas, como el modelo de organismo Halobacterium sp. NRC-1 cepa, y algunos no termófilas arqueas metanogénicas, se encontraron a puerto homólogos de los genes eucariotas NER NER genes y bacterias, uvrA, uvrB, uvrC y uvrD [6 - 8]. El clásico sistema de respuesta SOS regulados por LexA carece de arqueas, sin embargo, y la relación entre las bacterias y las eucariotas en la reparación de los sistemas de arqueas no se conoce en la actualidad [9].

Arqueas halófilas, como Halobacterium spp., Son excelentes para la realización de estudios experimentales de los sistemas de reparación del ADN, ya que se encuentran entre los pocos microorganismos archaeal encuentro a los altos niveles de luz solar en su entorno natural. Ellos ocupan un nicho ambiental extrema, en donde la exposición a la intensa radiación solar lleva a la evaporación y la concentración de NaCl cercanos a la o super-saturación. Estos microorganismos, incluyendo la secuencia de tipo salvaje modelo, Halobacterium sp. NRC-1, son altamente resistentes a los efectos nocivos de la radiación ultravioleta en la luz solar, principalmente debido a la extremadamente eficiente photoreactivation ADN de los daños [10, 11]. En presencia de la luz visible que pueden sobrevivir UV dosis muchas veces más elevados que los expuestos a ser cada vez más natural. Célula de supervivencia se aproxima al 100% después de dosis de hasta 100 J / m 2 mientras que 1 hora de exposición a la luz solar causa daños equivalentes a, como máximo, sólo unos pocos J / m 2 [[12]; SM, inédito]. UV de la tolerancia Halobacterium sp. NRC-1 es en comparación con otros organismos clave en la Figura 1. Halobacterium es significativamente más tolerantes a la radiación UV, incluso sin photoreactivating luz, más o Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae, aunque no tan resistente como la extremadamente resistentes a las radiaciones Deinococcus radiodurans. Arqueas halófilas también han de reparación por escisión de los mecanismos que puede funcionar en ausencia de luz photoreactivating [12, 13]. Además, como las bacterias y eucariotas, es probable que poseen mecanismos que les permiten tolerar la presencia de algunas lesiones no UV, incluida la lesión de circunvalación por ADN polimerasas que pueden eludir photoproducts [14]] y la recombinación para facilitar la recuperación de las horquillas de replicación estancado [15, 16].

Hemos adoptado un enfoque multifacético para el estudio de la radiación ultravioleta en las respuestas Halobacterium sp. NRC-1. Anteriormente, el papel crítico a la luz de phr2 reparación se demostró a través de una combinación de la genética y la bioquímica [11]. En este sentido, el uso de DNA microarrays para mostrar la importancia de la recombinación homóloga genes en la respuesta de las células a la radiación UV daños. Curiosamente, nuestros resultados son distintos de los obtenidos en un estudio anterior sobre Halobacterium sp. NRC-1 utilizando significativamente mayor dosis de irradiación ultravioleta [17].

Resultados y Discusión

Con el fin de comprender la expresión de genes respuestas a la radiación UV en la totalidad de su genoma, se estudió el modelo archaeon, Halobacterium sp. Cepa NRC-1, empleando DNA microarrays. Hemos utilizado tres diferentes dosis de UV-C, 30 J / m 2, 50 J / m 2, y 70 J / m 2, después de la irradiación con los tiempos de incubación en la oscuridad de 1 hora y 3 horas (Materiales y Métodos). En estas dosis UV, la supervivencia de las células es cercano al 100% tras daño en el DNA, ya sea en la luz o en la oscuridad (Figura 1] [11, 18]. Las células fueron irradiados en el medio de cultivo con irradiación posterior a la incubación en el mismo medio el fin de introducir un mínimo tensiones adicionales. Para dar una indicación de los tipos de reparación a las dosis utilizadas, se determinó la relación de los sucesos cyclobutane dímeros de pirimidina (documentos de programas por países) y 6-4 photoproducts con el tiempo después de la irradiación con una dosis intermedia de 50 J / m 2 (Figura 2]. La mayoría de photoproducts se repararon durante el período de 3 horas, aunque algunos todavía cyclobutane dímeros se mantuvo en 3 horas.

Custom DNA microarrays fueron fabricados utilizando la tecnología de inyección de tinta (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) con oligonucleótidos en el seno de diseño realizados con el programa OligoPicker [19]. La figura arrays 8455 60-mer características de nucleótidos que representan a 2474 marcos de lectura abierta (ORFs). La alta especificidad del 60-mer oligonucoletide arrays se han demostrado previamente [20]. Hasta tres sondas fueron diseñados por ORF con una media de 81 m T ° C y una gama de T m 3 ° C. El puerto diapositivas microarrays de genes de ambas sondas (~ 8000 características por la serie), así como ~ 400 negativos y positivos a la prueba de control de los puntos de hibridación y de las condiciones para permitir el error de modelado. Estos microarrays fueron ampliamente probado, de la linealidad de la respuesta y la significación estadística en un estudio relacionado con este tema de la respiración anaerobia en Halobacterium sp. NRC-1 [21]. La intensidad de señal con un rango dinámico superior a los tres órdenes de magnitud se encontró que permite el análisis simultáneo de baja y alta intensidad características.

Para el análisis de microarrays, dos dosis de UV-C, 30 J / m 2 y 70 J / m 2 se utilizaron. Microarray calidad de los datos se consideró alto. Después de la eliminación de valores atípicos, características reproducirse dentro de una misma gama baja mostraron diferencias en la intensidad de señal procesada absoluta (7% de media), y punto-a-punto variación de las réplicas de los experimentos fue de 9%. De los 2474 marcos de lectura abierta (ORFs), de Halobacterium sp. NRC-1 representados, 100 fueron significativamente hasta regulados y 150 fueron significativamente abajo regulada (1,5 veces por encima o por debajo, respectivamente, el valor de p <0,05) en por lo menos un establecimiento experimental. En el presente trabajo, nos centramos en los genes que participan en la recombinación homóloga del ADN y el metabolismo, que son las más significativamente inducida (Tabla 1]. Los niveles de expresión de todos los genes representados en el conjunto de los 30 J / m 2 de dosis también se les proporcionan (véase el archivo Adicional 1]. Los datos obtenidos de la irradiación UV con 70 J / m 2 fueron esencialmente los mismos (no se muestra). En cualquiera de las dosis, la pauta de inducible transcripciones es muy diferente de lo que sería visto en E. Coli, que no es de sorprender, ya que no hay LexA homólogo en Halobacterium sp. NRC-1. Además, no había pruebas de un clásico SOS respuesta coordinada y ni los genes de reparación del ADN procariótico, incluyendo uvrA, uvrB, uvrC y uvrD ni ninguno de los genes eucariotas reparación homólogos fueron hasta reguladas.

Sorprendentemente, sin embargo, el radA1 gen mostraron los más trascripción inducibles (~ 7 veces) en 1 hora y 3 horas después de las dos dosis de UV (Tabla 1, Figura 3]. RadA1 es el Halobacterium sp. NRC-1 homólogo de RecA/Rad51, que cataliza capítulo invasión y durante el intercambio de recombinación homóloga. RadA1 es más similar a Rad51 en eucariotas que a los bacteriana RecA. Supresión de radA se ha demostrado que causa graves UV en la sensibilidad relacionadas halophililc archaeon, Haloferax volcanii [22]. La expresión cambio de radA1 se consideró estadísticamente muy significativas sobre la base de los siguientes: El radA1 gen está representado por 3 diferentes sondas por arreglo con una de esas sondas que se duplican, a la combinación de un total de 24 puntos de datos para que el gen en el presente informe. Además, se preparó cDNA a partir de tres culturas tratados independientemente por condición y variedad. El promedio de desviación estándar de la tapa de todos los cambios radA1 sondas-dentro de un arreglo era 0,85, mientras que la matriz a diferencia gama de sondas idénticas en repetirse experimentos fue de 18%. El promedio p-valor de los ratios de registro fue <10 -22. Los resultados de los anteriores transcriptome de perfiles después de las perturbaciones ambientales indican que una expresión de 7 veces el cambio es alto en comparación con cualquier gen en Halobacterium sp. NRC-1 [[21]; JM y SD, datos no publicados]. En esos experimentos (5 diferentes circunstancias que no supongan la irradiación UV) la radA1 de genes expresados diferencialmente no era demostrar que la inducción que aquí se presenta fue causado por la irradiación ultravioleta.

El radA2 (radB) gen, una segunda homólogo de recA en arqueas, la codificación de una proteína con función desconocida en la recombinación homóloga, no estaba regulado, de acuerdo con observaciones en otras arqueas [23]. RadA1 acompaña a la inducción, varios otros genes implicados en recombinación homóloga fueron significativamente inducida después de la irradiación UV. El dbp gen, la codificación de un eukaryote-como la proteína de unión de ADN de la superfamilia I DNA y RNA helicases, se upregulated 1.95 (p-valor 0,04) en 1 hora post-irradiación UV con 30 J / m 2. El arj1 gen, una codificación recJ-exonuclease como fue reglamentado hasta 1,5 veces (p-valor de 0,008) a las 3 horas (30 J / m 2). Además, una aparente operón codificación de la proteína de unión del EPR ssDNA complejo, rfa3, (VNG2160, RPA41 homólogo, Zn-dedo de la mano que contiene), rfa8 (VNG2162, RPA32 homólogo), y un no vinculado ORF (VNG2163) fue inducida 1,53 ± 0,02 veces (p - Valores <0,001) en ambos puntos temporales después de la irradiación con 70 J / m 2. Similar veces los cambios se midieron después de la irradiación con 30 J / m 2, sin embargo, los valores de p se en torno a 0,1. En eucariotas, el EPR-ssDNA complejos se forman durante casi todo el ADN de las vías de reparación de los daños. Por ejemplo, el EPR-proteínas son reclutados a Rad51 focos, los complejos de proteínas que se acumulan en los sitios de daño en el DNA y la replicación se bifurca en punto muerto [24, 25]. Ninguno de los otros cuatro EPR homólogos de Halobacterium sp. NRC-1 (VNG0133, 1253, 1255, 6403) fue significativamente diferente expresó. En cuanto a radA1, ninguno de los dos se encontraron por encima de los genes que se expresan en forma diferente de otros experimentos de perturbación ambiental [[21]; JM y SD, datos no publicados].

Nuestros datos de los microarrays, junto con estos resultados, sugieren fuertemente un papel clave para la supervivencia recombinación homóloga en el daño de los rayos UV en esta clase de arqueas. Por analogía con otros organismos, hay al menos dos maneras de recombinación que podría contribuir a la supervivencia de UV daños en Halobacterium sp. NRC-1. (I) Recombinational rescate de las horquillas de replicación estancado puede tener lugar [15, 26]. Rescate de horquillas estancado es probable que esté libre de errores y esto encaja con la baja tasa de mutación en Halobacterium spp. [[1] 27; SM, datos no publicados]. (Ii) la reparación Recombinational puede ocurrir mediante el uso de copias del genoma, un mecanismo que se ha sugerido para facilitar posteriores a la irradiación de supervivencia D. Radiodurans [28]. Halobacterium sp. NRC-1 se cree que contienen varias copias de su genoma (Soppa J. com pers.), Que puede aumentar en gran recombinational reparación.

Además de los genes implicados en la recombinación homóloga, varios otros genes también son muy inducido. Los más interesante, el gen que codifica una cobalamina dependiente de la clase II RNR (nrdJ, anteriormente nrdB2) fue fuertemente hasta reguladas (Figura 3, Tabla 1]. Un pequeño marco de lectura abierta (VNG1642), ubicado inmediatamente aguas abajo a nrdJ codificación de un pequeño dedo de la mano no-zinc que contiene proteína (COG1645) también fue fuertemente inducidos. RNR es la tasa de limitación de la enzima en la síntesis de novo de deoxyribonucleotide triphosphates que se utilizan tanto en la síntesis de ADN y de reparación del ADN, la sobre regulación de los genes nrd puede reflejar la necesidad de aumentar las concentraciones deoxynucleotide para permitir la rápida y exacta de reparación por escisión. En la levadura, daño en el DNA provoca un aumento de los niveles de dNTP y el aumento de dNTP piscinas mejorar la supervivencia celular posterior daño en el DNA [29]. En muchos otros organismos, RNR genes están regulados por UV y se encuentran entre los primeros UV-inducible genes identificados en un estudio inicial de la radiación UV-promotores inducibles en ciernes levadura [30]. RNR está regulada durante el ciclo celular en eucariotas y de la UV depende de la respuesta vinculante de factor de transcripción E2F a los sitios web de la promotora [31]. Cabe señalar que, en el E. Coli, nrd genes inducibles UV-incluso en ausencia de lexA [1].

Además de nrdJ, arcBCA, necesarios para la fermentación de arginina [32] también fueron fuertemente inducidos en particular, aunque sólo en las primeras tiempo, y con algunas variaciones en la magnitud de la inducción entre repetir los experimentos. Si esto refleja una inducción rápida demanda de suministro de ATP durante los períodos de reparación de los daños de ADN no es conocido. Otra posibilidad es que la expresión de estos genes es exquisitamente sensible a los pequeños y destaca que ver estos resultados con cierta cautela en esta etapa.

Un anterior transcriptome análisis de la radiación UV-irradiado Halobacterium sp. NRC-1 cepa culturas [17] mostró, como nosotros, la falta de un SOS-como la falta de respuesta y de la regulación de cualquiera de los genes NER por UV. Sin embargo, estos autores no informaron fuerte inducción de la recombinación de los genes o los genes RNR. La UV dosis utilizada en este último estudio fue considerablemente mayor (200 J / m 2). Esta dosis, que induce, aproximadamente un photoproduct por 600 bp de ADN, las causas de unos cien veces más daño del ADN provocado por la luz natural y como resultado en peligro la supervivencia celular. Es posible que la alta dosis de UV causado la interferencia con la expresión de los genes. Esto es en contraste con alrededor de un 4 por photoproduct kb a 30 J / m 2 y una por 1,7 kb a 70 J / m 2 [33 - 35], la dosis tolerada por Halobacterium sp. NRC-1 y utilizado en el estudio actual.

Se han planteado cuestiones en cuanto a la importancia de la expresión génica respuestas a los rayos UV y otros agentes perjudiciales ADN. En la levadura, S. Cerevisiae, un análisis de supresión mutante que carecen de la radiación UV-inducible genes sugiere que la mayoría no contribuyen a la supervivencia de irradiación ultravioleta [36]. Además, la mayoría de los genes de levadura identificado como teniendo un papel en el daño que sobreviven UV, por el aislamiento de la radiación UV-mutantes sensibles, entre ellos la mayoría de los genes NER, no son UV-inducible. En las células humanas también, la mayoría de los genes de reparación no son UV-inducible [37]. Así, transcriptome análisis deben interpretarse con cautela y de las inferencias sobre el grado de participación de genes deben recibir el apoyo de los estudios fisiológicos y funcionales. En el presente informe, la absoluta contribución de los distintos ADN de los sistemas de reparación de los daños no se ha investigado. Sin embargo, el alto nivel de la regulación a radA1 y de la inducción de la recombinación de genes mientras que otros comparables algunos otros cambios en la expresión de genes se producen, claramente sugiere un importante papel de la recombinación homóloga en el ADN de reparación de los daños en Halobacterium sp. NRC-1.

Conclusión

Nuestro transcriptome de perfiles de trabajo, junto con nuestros estudios de la respuesta fisiológica de un modelo archaeon, ha demostrado que los genes implicados en recombinación homóloga son inducidos por la radiación UV en dosis relativamente bajas. Nuestros resultados son consistentes con recombinación homóloga jugando un importante papel en la respuesta celular a daños en la UV Halobacterium sp. NRC-1, ya sea para permitir el rescate de estancamiento o de horquillas de replicación para facilitar recombinational reparación. En cualquier caso, nos encontramos con que la inducción de la recombinación de genes es importante en la respuesta de Halobacterium sp. NRC-1 a la irradiación ultravioleta, que es especialmente importante, ya que se ha demostrado recientemente que la recombinación es importante para facilitar el intercambio genético de las poblaciones silvestres de arqueas halófilas [38]. Nuestros resultados sugieren que la recombinación homóloga es estimulado por la luz del sol en este modelo archaeon.

Métodos
La cultura y las condiciones de irradiación UV -

Halobacterium sp. NRC-1 cepa fue cultivada a 37 ° C en condiciones aerobias a principios de la fase de crecimiento exponencial (OD 600 0,19 - 0,23) en medio completo [39] y irradiados en la oscuridad, en medio, utilizando una fuente de la radiación UV-C, con tasa de dosis de 1 J / seg / m 2. Post-UV incubación se continuó en la misma temperatura, sin modificar el medio. Normalmente, la radiación UV-no se lleva a cabo en medios de cultivo a causa de la posible absorción de las longitudes de onda ultravioleta. Para el presente experimentos de microarrays, la irradiación en el medio de cultivo es de especial importancia para evitar el estrés adicional causado a las células por la cosecha y la evolución de los medios de comunicación. Además, hemos comprobado que la absorción de la radiación UV-C, por el medio de cultivo utilizado fue mínimo por la medición de la transmisión de luz de 260 nm en un espectrofotómetro. La dosis efectiva de UV no fue significativamente afectada por irradiar en el medio.

Medición de la photoproducts

Un dot-blot inmunoensayo para la cuantificación diferencial de documentos de programas por países y 6-4 photoproducts se llevó a cabo tal y como se describe en detalle previamente [40]. En resumen, la fase exponencial células fueron cosechadas y estéril irradiado en una solución de sales de la radiación UV-C con una tasa de dosis de 1 J / seg m 2. Alícuotas de extracto de levadura y los hidrolizados de caseína se agregaron soluciones para restaurar los nutrientes y las células irradiadas fueron incubados en condiciones aeróbicas a 37 ° C para permitir la reparación de proceder. Todos y después de la irradiación UV incubación se llevó a cabo ya sea bajo la luz amarilla de iluminación o en la oscuridad. Las muestras fueron tomadas en intervalos de tiempo y de ADN extraído para la medición de photoproducts. ADN concentraciones en diferentes muestras fueron cuidadosamente igualaron. Posteriormente, el ADN de cada muestra se dividió en dos y la mitad fue tratada con NaOH caliente para destruir 6-4 photoproducts. Dos dot blots se prepararon sobre filtros de nitrocelulosa, cada uno con una serie de diluciones de ADN de cada muestra. Un filtro fue expuesto a un CPD photolyase de destruir cyclobutane dímeros en todas las muestras de ADN en la mancha que para permitir la medición de 6-4 photoproducts solo. El dot blots fueron entonces expuestos a antisuero policlonal de conejo que contiene anticuerpos a 6-4 photoproducts documentos de programas por países y, a continuación, con biotina de anticuerpos anti-conejo seguido cuantificación colorimétrica utilizando alcalinas photsphatase-conjugado Extravidin (Sigma), Nitro azul tetrazolio (NBT) y 5-bromo - 4-cloro-indolyl fosfato (BCIP) sustrato. La cantidad de color se mide utilizando un densitómetro de barrido (BioRad GS-670) y frente a un conjunto de normas incluidas en cada mancha.

Microarray procedimientos

Relativa de los niveles de mRNA fueron determinados por paralelas de dos colores a la hibridación de oligonucleótidos (60-mer), en representación de microarrays 2474 ORFs que representan el 92% de Halobacterium sp. NRC-1 ORFs según Müller y DasSarma [21]. Transcriptome de perfiles de las células irradiadas con 30 J / m 2 se llevó a cabo por duplicado. Transcriptome análisis de las células irradiadas con 70 J / m 2 se llevó a cabo sólo una vez desde que los resultados son esencialmente los mismos que para el 30 J / m 2. ARN total fue aislado de 50 ml culturas inmediatamente después de la cosecha a 2 ° C utilizando Agilent Total RNA Kit de aislamiento (Agilent) y ADN se hidrolizadas grado de amplificación utilizando DNasa (Sigma, Reino Unido). Con el fin de minimizar el ruido biológica, ARN preparativos de tres culturas crecido en idénticas condiciones se combinaron a partes iguales para la síntesis de ADNc. CDNA fue preparado a partir de 7 μ g ARN total con Super III de comandos de la transcriptasa inversa (Invitrogen, Reino Unido) y Cy3-o Cy5-dCTP (Amersham Biosciences, UK). Rendimiento de duplicar los experimentos en el que los tintes se intercambian durante la síntesis de dar cuenta de las diferencias de etiquetado no es necesario. Anteriores resultados mostraron que las diferencias en la intensidad relativa de los canales podría ser ajustada por la intensidad dependen de los productos básicos LOWESS normalización [[21]; JM y SD, datos no publicados]. CDNA preparativos fueron purificados después de la hidrólisis alcalina de ARN en Qiagen mini-elute columnas (Qiagen, Reino Unido). El cDNA marcado metas se mezcla con la hibridación de amortiguación (Agilent) y control de metas (Agilent), y hibridizada a microarray diapositivas, reunidos en una cámara de hibridación (Agilent), durante 17 h a 60 ° C en la oscuridad. Post hibridación, se lavaron las diapositivas como se describe [21] y para el escaneado Cy3 y Cy5 señales fluorescentes con un Agilent DNA microarray-escáner (Modelo No. G2565BA). El procesamiento de imágenes y el análisis estadístico se realizó utilizando Agilent Reportaje versión 7,1 del software de extracción, tal como se describe anteriormente [21]. Registro de coeficientes para cada característica se calcularon y la importancia de la proporción de registro se evaluó mediante el cálculo de la tasa de registro de la mayoría conservadora y la importancia valor de error (p-valor) usando un algoritmo de propagación de error estándar (Agilent) y un modelo universal de error (Rosetta Biosoftware) .

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Contribuciones de los autores

SM diseñado los experimentos, analizar los datos, y redactó el manuscrito. JM asistida con diseño experimental, llevó a cabo la hibridación microarrays de ADN, la bioinformática y la llevó a cabo y el análisis de datos. IB asistida con diseño experimental y realizó la irradiación ultravioleta, la preparación de RNA, cDNA y etiquetado. BB ayudó en el análisis de la bioinformática. WN asistida con irradiación ultravioleta, la preparación de RNA, cDNA y etiquetado. SD diseñado los experimentos, con la asistencia con la interpretación de los datos, y preparó el manuscrito.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Expresión de los cambios
Halobacterium
NRC-1 marcos de lectura abierta después de la irradiación UV con 30 J / m
2
Se ofrece como un nuevo archivo XLS.
Agradecimientos

Damos las gracias a James P. Carney para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por NSF subvenciones MCB-0450695 y MCB-0296017 a la SD y por BBSRC subvenciones a SM P18099.