Saline Systems, 2005; 1: 7-7 (más artículos en esta revista)

Metaproteomic análisis de la Bahía de Chesapeake comunidades microbianas

BioMed Central
Jinjun Kan (kan@umbi.umd.edu) [1], Thomas E Hanson (tehanson@udel.edu) [2], Joy M Ginter (69604@udel.edu) [3], Wang Kui (wangk @ umbi. Umd.edu) [1], Feng Chen (chenf@umbi.umd.edu) [1]
[1] Center of Marine Biotechnology, University of Maryland Biotechnology Institute, Baltimore, MD 21202, USA
[2] Graduate College of Marine Studies and Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware, Newark, DE 19711, USA
[3] Department of Chemistry and Biochemistry, University of Delaware, Newark, DE 19716, USA

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Resumen
Antecedentes

Las comunidades microbianas naturales son extremadamente complejas y sistemas dinámicos en términos de sus funciones y la estructura de la población. Sin embargo, poco se conoce sobre las funciones in situ de las comunidades microbianas.

Resultados

Este trabajo describe la aplicación de métodos proteómicos (metaproteomics) para observar los perfiles de proteína expresada naturales de las comunidades microbianas (metaproteomes). La técnica se validó mediante una comunidad construida y posteriormente utilizada en el análisis de la Bahía de Chesapeake comunidad microbiana (0,2 a 3,0 μ m) metaproteomes. Bahía de Chesapeake metaproteomes figura proteínas de pI 4-8 con masas moleculares aparentes entre 10-80 kDa. Replicada medio Bay metaproteomes compartida ~ 92% de todos los puntos detectados, pero sólo comparten el 30% y el 70% de los puntos comunes con proteínas superior e inferior de la Bahía de metaproteomes. MALDI-TOF análisis de las proteínas altamente expresado no produjo importantes coincidencias con las proteínas conocidas. Tres proteínas de la Bahía de Chesapeake se tentativamente identificados por LC-MS/MS secuenciación junto con MS-BLAST búsqueda. Las proteínas se identificaron microorganismos de origen marino y correlacionado con abundante Bahía de Chesapeake microbiana linajes, Bacteroides y α-proteobacteria.

Conclusión

Nuestros resultados representan la primera metaproteomic estudio de los ensambles microbianos acuáticos y demostrar el potencial de metaproteomic enfoques para vincular metagenomic datos, la diversidad taxonómica, diversidad funcional y de los procesos biológicos en ambientes naturales.

Antecedentes

Bacterioplancton contribuir de manera significativa a la producción primaria y la biomasa en el océano y de las aguas costeras [1, 2]. Con una concentración media de aproximadamente 10 6 células ml -1, bacterioplancton es un importante catalizador de los procesos biogeoquímicos oceánicos incluidos los ciclos del carbono y nitrógeno [3, 4]. Estudiar bacterioplancton es difícil porque la mayoría de los grupos o bien nunca han sido cultivados [5, 6] o crecer a muy baja densidad en el laboratorio [7]. Cultura-molecular independientes han indicado que los enfoques ambientales comunidades bacterianas son más complejos y diversos que se había pensado anteriormente [5, 6, 8]. Metagenómica directa es la clonación, la secuenciación, de reunión y de la anotación de ADN de las comunidades microbianas y se ha aplicado a las aguas, los suelos y ambientes extremos [9 - 12]. Un reciente estudio de metagenomic el Mar de los Sargazos reveló que sustancial compleja diversidad microbiana existente en el océano: 148 bacteriana phylotypes novela y más de un millón de genes antes desconocidos fueron descubiertos y anotada [12].

Como se acumula información genómica de cultivos puros del medio ambiente y las comunidades, se convierte en fundamental para entender la expresión de genes y proteínas función. Aunque metagenome secuencias proporcionan valiosa información sobre las posibles funciones, predecir con exactitud la función ecológica de la secuencia es casi imposible sin información sobre qué proteínas se sintetizan en condiciones específicas [13 - 15]. Para abordar esta cuestión, después de los enfoques genómicos moleculares como microarrays para controlar la abundancia de ARNm [16] se han desarrollado. Además, como las proteínas / proteomes son, en última instancia, los productos funcionales de los genes / genomas, los estudios proteómicos de las comunidades microbianas (metaproteomics) son un claro enfoque para avanzar en nuestra comprensión de la función de la comunidad microbiana.

Metaproteomics puede proporcionar una medición directa de la expresión de genes funcionales en términos de la presencia, abundancia relativa y estado de modificación de las proteínas [17, 18]. Proteómica y metaproteomics confiar en dos dimensiones electroforesis en gel (2D-PAGE), junto con espectrometría de masa (MS), proteína basada en la identificación apoyándose en la base de masas (MALDI-TOF MS) o una secuencia basada en métodos (LC-ESI-MS/MS). Estas técnicas sólo se han aplicado en el ámbito limitado de las comunidades microbianas del medio ambiente. Una dimensión electroforesis en gel (1D-PAGE), junto con el etiquetado o radiactivos actividad enzimática de ensayo se ha utilizado para estudiar las proteínas inducidas en respuesta a estrés ambiental [19, 20]. Sin embargo, la poca información concreta sobre la identidad o las secuencias de proteínas inducidos surgido de estos estudios. Un metaproteomic enfoque se aplicó a una escala de laboratorio de lodos activados bioreactor resultando en la identificación de tres proteínas expresadas muy presumiblemente originados en una uncultured Rhodocyclus de tipo Polifosfato - acumulando organismo [18]. Más recientemente, la genómica y utilizando la espectrometría de masas basado en los métodos proteómicos, metaproteomes de un drenaje ácido de mina (AMD) biopelículas microbianas comunidad han sido identificados y vinculados en sus funciones situ a los ambientes difíciles [21]. Sin embargo, todos estos estudios se trata de baja complejidad comunidades microbianas. Hasta el momento, ningún estudio todavía no se han aplicado métodos proteómicos para comunidades microbianas naturales acuáticos.

Estuarios constituyen uno de los más complejos y productivos ecosistemas. La Bahía de Chesapeake es el estuario más grande en los Estados Unidos (Fig. 1]. Se ha recibido una gran atención debido a su gran espacio geográfico y económico. Con fuertes gradientes ambientales, que proporciona un modelo ideal para el sistema integrado de investigaciones sobre la composición y la función de las comunidades microbianas. En este estudio, hemos elaborado un documento metaproteomic enfoque de la comunidad microbiana perfiles de proteína a lo largo de un transecto de la Bahía de Chesapeake. Se encontraron diferencias significativas entre proteomes recogidos en diferentes sitios y metaproteome patrones de predecir con precisión la relación de los sitios que determine gen 16S rRNA PCR-DGGE (electroforesis en gel de desnaturalización gradiente). Además, las proteínas identificadas muestras de la Bahía de Chesapeake parece proceder de bacterioplancton marino. Este estudio demuestra que metaproteomic enfoques puede aplicarse a los de origen natural y complejas comunidades microbianas en sus hábitats nativos.

Resultados
Comunidad microbiana colección

Epifluorescence cuenta microscópico mostró que concentran comunidades microbianas que figuran principalmente bacterias de vida libre (~ 95%). La recuperación de la eficiencia de las células bacterianas mediante el sistema de ultrafiltración de flujo tangencial fue de 75 ± 5% (datos no presentados). Con la concentración media de 2,5 × 10 6 células ml -1 en el agua a partir de muestras, la densidad de células microbianas en la ultrafiltración retentate fue de unos 2,5 × 10 8 células ml -1. Así, alrededor de 3,75 × 10 10 células fueron analizadas en cada muestra. Los extractos que figuran normalmente entre 140 y 192 μ g de proteína de dar un valor conjunto de 3,7 × 10 -15 a 5,1 × 10 -15 g de proteína celular -1. Este valor es significativamente menor que el determinado para las cepas cultivadas en este estudio y en general de bacterias marinas (60-330 × 10 -15 g de proteína celular -1, [22]]. Queda por determinar si esta diferencia indica que el protocolo de extracción de las necesidades de optimización más o es una propiedad fundamental de las células microbianas en muestras ambientales.

1D-PAGE análisis de las proteínas de cepas bacterianas aisladas y muestras ambientales

Individual proteínas de las bacterias marinas cultivadas fueron bien resueltas por 1D-PAGE y producen distintos patrones de la Bahía de Chesapeake, cuando 8 cepas aisladas fueron comparados (Fig. 2]. Las masas moleculares observada ~ varió de 10 a 250 kDa (Fig. 2, carriles 1-8), mientras que las proteínas de la comunidad microbiana muestras fueron <80 kDa (Fig. 2, carriles 9 y 10). En términos generales la resolución es mucho más pobre en la comunidad como lo demuestran las muestras menos definida en bandas de estas muestras. Esta difuminación efecto se observó también en una simple comunidad microbiana mixta se describe a continuación y no se depende de las manipulaciones de muestreo (datos no presentados).

Análisis de las cepas aisladas y artificial comunidades mixtas

Artificial comunidad consistente en Chlorobium tepidum cepa WT2321, Escherichia coli cepa JM109 y una cepa no de Pseudomonas fluorescens fue analizado por 2D-PAGE. Experimentos preliminares indicaron que una muestra de 300 ml que contiene 1 × 10 7 células por ml de la comunidad podría ser analizada con éxito por 2D-PAGE. El análisis por PAGE-1D ofrece una mayor sensibilidad, ~ 1 × 10 4 células por ml, pero la resolución de cada uno de los grupos pobres, como se ha señalado anteriormente. Ensayos de la proteína en muestras de la comunidad antes de la dilución y la recuperación y después indicó que la preparación de la muestra recuperada metaproteomic ~ 30% del total de proteína microbiana presente en la muestra original de la comunidad.

Los resultados típicos de un experimento 2D-PAGE se muestra en la Fig. 3. Las superposiciones indican que los patrones de 2D-PAGE único de cepas de los miembros de la comunidad coincide con sólo una fracción de las proteínas presentes en los lugares metaproteome simulacros de la muestra (Fig. 3a-d]. Esto es cualitativamente observado como un gran número de verde o rosa manchas de proteínas en la superposición de puntos de vista que muestra inigualable manchas de proteínas. Cada persona cepa se espera que contribuya sólo una tercera parte del contenido de proteínas de la comunidad. En cambio, cuando una muestra de la comunidad antes de la dilución y la recuperación es en comparación con un simulacro de metaproteome que habían sido sometidos a protocolos de manejo de la muestra, casi perfecta concordancia de las muestras es visto como lo demuestra la gran proporción de gris oscuro a negro spots ( Fig. 3d] cuando las imágenes son cubierto. Por lo tanto, ninguna persona miembro de la comunidad, que abarca la gama de tamaños de células en las muestras ambientales, es selectiva excluidos por el protocolo de muestreo.

Extracción de metaproteomes de la Bahía de Chesapeake

En este estudio, con el fin de optimizar la extracción de la proteína microbiana de las comunidades acuáticas, diferentes protocolos que variaban en todos los pasos de extracción y purificación de proteínas se probaron incluidas (i) la recogida de las muestras (filtración en filtro de membrana, la concentración de flujo tangencial con centrifugación), (ii ) Buffer de lavado para eliminar las sales ambiente y polisacáridos, (iii) la extracción de amortiguación (buffer de lisis estándar, SDS-PAGE de amortiguación, la urea-thiourea-CHAPS buffer), (iv) la reducción de agente (dithiothreitol (TDT) vs tributilo de fosfina (PDD) ), (V) el método de lisis celular (congelamiento-deshielo, francés presión de células), (vi) la precipitación de proteínas (acetona vs TCA), (vii) IPG franja gama (pH 3-10 vs pH 4-7), y (Viii) método de tinción (Commassie azul, plata, SYPRO Ruby). De estos ensayos, surgió el siguiente protocolo: (i) la concentración de flujo tangencial con el centrifugado, (ii) el lavado TS buffer (Tris 10 mM, Sacarosa 250 mM), (iii) la urea-thiourea-CHAPS lisis de amortiguación con PDD, (iv) Lisis celular a través de la presión francesa, (v) la precipitación TCA, (vi) Primera dimensión pH 4-7 IPG tira, (vii) SYPRO Ruby tinción. Sin embargo, dadas las características indígenas entre las diversas comunidades microbianas, la extracción de metaproteomes puede variar de sitio, la hora y el experimento también.

Comparación cuantitativa de la Bahía de Chesapeake Metaproteome muestras

Metaproteome imágenes de las diferentes estaciones de la Bahía de Chesapeake en la parte superior (estación 858), media (estación 804, la réplica de una y b) y la reducción de la bahía (estación 707) fueron comparados (Fig. 4a-d]. Una serie de manchas de proteínas fueron compartidas por todas las muestras. Algunas de estas proteínas están presentes en RNasa, Dnase y cóctel inhibidor de la proteasa en la extracción de amortiguación (datos no presentados), pero una serie de proteínas parecen ser comunes en todas las muestras examinadas. Estos son de color negro con manchas de color gris oscuro en el superposiciones de imágenes (Fig. 4a-d]. Un primer nivel de comparación cuantitativa determinará el número concreto de la proteína lugares compartidos entre las muestras (Tabla 1]. El número total de puntos de comparación para cada muestra es relativamente baja como el análisis se limitó a los lugares y con la suficiente calidad para permitir intensificar los intentos posteriores en la identificación de proteínas. Como era de esperar, metaproteome reproducir imágenes de la Bahía de media son más similares entre sí que los de otras estaciones de metaproteomes, compartiendo ~ 92% de todos los puntos detectados. Además, el bajo y medio Bay metaproteomes son mucho más similares entre sí que cualquiera de los dos es superior a la Bahía de metaproteomes con ~ 70% de todas las manchas detectadas en común. El superior de la Bahía de metaproteomes sólo compartida acerca de ~ 30% de los puntos detectados, ya sea con el medio o inferior metaproteomes Bay.

Intensidad relativa de terreno se extrae de la comparación de la media de la Bahía de la Bahía de media y media baja con la Bahía de la Bahía de metaproteome imágenes. Esto no era posible con la parte superior de la Bahía como muestra cotejo manual fue contratado debido al bajo nivel de similitud entre las muestras. Una vez más, como se esperaba, el número de proteínas expresadas diferencialmente (≥ 3 veces el cambio en el terreno coincide con intensidad) fue casi dos veces mayor cuando se compara la media de la Bahía de la Bahía de metaproteomes un menor como al comparar la media reproducirse Bay muestras (Tabla 1]. Estos resultados indican que tanto cualitativa como cuantitativa muy comparaciones entre los sitios y entre las muestras de series de tiempo en el mismo lugar será posible mediante la utilización de los métodos desarrollados en este estudio.

Identificación de proteínas en la Bahía de Chesapeake Metaproteomes

Un total de 41 spots de proteínas fueron extirpados de una serie de geles 2-D que reflejan diferentes pesos moleculares, los cargos y de la abundancia relativa. Tras MALDI-TOF MS, siete puntos no interpretables MS perfiles de rendimiento, mientras que el restante 34 proteínas expuestas clara y distinta MS picos. Búsquedas en bases de datos utilizando el motor de búsqueda MASCOT con distintos valores de los parámetros (péptido masa tolerancia de 0,5 a 3 Da, perdido divisiones de 1 a 5) no produjo importantes coincidencias de estas 34 proteínas. Posteriores publicaciones de otros laboratorios y nuestras propias simulaciones utilizando secuencias de la proteína conocida [[23, 24], Hanson, datos no publicados] sugieren que más de 97% de identidad de secuencia de aminoácidos que se necesitan para proporcionar un partido positivo al buscar con MALDI-TOF MS datos .

Siete proteínas individuales (Fig. 5] aisladas de la Bahía de Chesapeake media (estación 804) metaproteome más muestras fueron analizadas por tanto MALDI-TOF MS y LC-MS/MS secuenciación junto a la búsqueda de MS-BLAST (Tabla 2]. MALDI-TOF MS no presentó identificación de ninguna de estas muestras, similares a las muestras descritas anteriormente. LC-MS/MS búsquedas basadas en identidades siempre provisional para tres muestras de la Bahía de Chesapeake metaproteome. Estos fueron identificados como homólogos de las proteínas hipotético anotado informó recientemente en el Mar de Sargasso metagenome [12]. La información sobre las posibles funciones de estas proteínas se obtuvo mediante la descarga de toda la longitud de las proteínas el Mar de los Sargazos base de datos y buscar en ellos en contra de las bases de datos conocido por BLASTP (Tabla 3]. El Mar de los Sargazos metagenome hipotética proteína CB1 correspondiente a la muestra no es significativamente similar a cualquier conocido en la secuencia de bases de datos de proteínas. CB3 muestra podrá corresponder a la subunidad 7 de la NADH: ubiquinona oxidoreductase (complejo I), mientras que CB6 muestra es similar a una familia de predecir con aminopeptidases no especificado importancia funcional. Los espectros de masas en tándem de muestras CB2, CB3 y CB5 no se corresponden con ningún conocido afectado de queratina y proteínas o albúmina sérica bovina y que posiblemente vinieron de antecedentes.

Discusión

En este estudio, que deliberadamente se centró en el estudio de los perfiles de proteoma bacterioplancton entre 0,2 y 3,0 micrones en tamaño por la elección de prefiltration y ultrafiltración de corte tamaños. Aunque la microscopía epifluorescence observación confirmó que los principales componentes son bacterioplancton (~ 95%), pequeñas cantidades de microbios como posibles eucariotas. Estas probabilidades no afecta a la general de los perfiles de proteínas observó como los análisis se limitan a las proteínas abundantes, que podrían dar la mejor oportunidad para que los identificara.

Metaproteomic enfoques han sido hasta el momento sólo se aplica a escala de laboratorio especializados biorreactores con una comunidad seleccionada para la extracción de fosfato [18] y una baja complejidad de biopelículas microbianas naturales [21]. La extensión de este sistema a la compleja muestras ambientales no es trivial. Los primeros estudios que compararon las cepas aisladas, comunidades artificiales y naturales de la comunidad muestras 1D-PAGE indicó que la solución más poder que se necesitaba para hacer frente a las comunidades incluso simplificado (datos no presentados). Por lo tanto, un enfoque metaproteomic utilizando 2D-PAGE y la identificación de proteínas basado en MS fue aprobado. El protocolo experimental descrito en el presente estudio fue diseñado para evitar metaproteome cambios derivados de sesgo en la recogida de muestras o la manipulación. Esto fue probado usando artificial construido bacteriana ensamble contiene 3 especies diferentes de células con variados tamaños y no se encontraron importantes sesgos.

El protocolo también fue probado sobre el terreno mediante la comparación de muestras de reproducirse desde la mitad de la Bahía de Chesapeake sí y comparar una amplia gama de muestras de superior, medio e inferior estaciones de la Bahía de Chesapeake. La repetirse muestras compartido más de ~ 92% de las proteínas que se indique que la metaproteomic enfoque aplicado en este estudio es sólido. Además, se encontraron diferencias significativas cuando la media Bay metaproteomes fue inferior en comparación con la Bahía y parte superior de la Bahía de metaproteomes con sólo el 70% y el 30% de la proteína puntos en común. Este patrón puede ser probable y explica, en parte, por la diferencia entre la estructura de la población de estas muestras. Huellas genéticas indicaron que bacterioplancton superior de la Bahía de la comunidad es diferente de la Bahía de media y baja (Fig. 6]. La agrupación de análisis basado en la presencia / ausencia de bandas de DGGE mostraron que la similitud entre la Bahía de media inferior a la bahía fue de 64%, mientras que la parte superior de la Bahía de sólo comparte el 46% de similitud con las dos medias más bajas y la Bahía de la Bahía. Por último, la abundancia relativa terreno también fue mucho más estrechamente correlacionados repetirse cuando la media Bay muestras se compararon entre sí que cuando se comparan a la menor muestra de la Bahía. Estos resultados ponen de manifiesto el enfoque descrito aquí es lo suficientemente sensible para detectar tanto tosca (compartido manchas) y multa (abundancia relativa in situ) las diferencias cuantitativas entre las muestras, aun cuando relativamente bajo número de puntos a ser incluidos en el análisis. Esto es fundamental para cualquier enfoque comparativo.

Este estudio, además de otros, indica que la identificación de proteínas es el principal desafío para metaproteomics [18, 21, 23, 24]. Aunque diferentes espectros de masa de proteínas de 34 puntos fueron obtenidos por MALDI-TOF MS, no se han encontrado coincidencias importantes en la secuencia de bases de datos. MALDI-TOF generalmente requiere por lo menos 97% de identidad de secuencia de aminoácidos entre la consulta y la meta de encontrar un importante partido [[25], Hanson inédito]. Parece poco probable que muchas proteínas en muestras ambientales compartirán este nivel de identidad con la secuencia de proteínas en las bases de datos provenientes de organismos cultivados. Modificaciones después de la traducción de las proteínas también cuenta para la dificultad en la identificación. Así, MALDI-TOF MS es improbable que sea útil para metaproteomic enfoques.

En cambio, LC-MS/MS o N-terminal de la secuencia junto a MS-BLAST búsqueda es capaz de proporcionar la identificación provisional de metaproteomes. Sin embargo, la abundancia de la mayoría de las proteínas es demasiado baja para ser identificados a través de la sede de la secuencia N-terminal. En la comunidad de análisis proteómicos natural de drenaje ácido de mina de biopelículas microbianas, las proteínas podrían ser identificadas por la EM y asignados a cinco más abundantes microbios debido a la disponibilidad de datos metagenomic. Pero la relativa alta probabilidad de falsos positivos de identificación de proteínas requiere de congruencia de dos o más proteínas de péptidos por confía en la detección [21]. Por lo tanto, se requiere cautela para la interpretación de los datos. En este estudio, tres de la Bahía de Chesapeake metaproteome muestras coincide con diferentes proteínas hipotético anotado en el Mar de los Sargazos metagenome [12]. Este resultado apoya firmemente un origen marino de estas secuencias como la que se esperaría para un gran número de proteínas en la Bahía de Chesapeake, en particular en el bajo y medio muestras de la bahía donde hay un gran salinidad. Incluso con identidades provisional, la ampliación de esa identidad a la función debe hacerse con cuidado. El Mar de los Sargazos metagenome hipotética proteína CB1 correspondiente a la muestra no es significativamente similar a cualquier conocido en la secuencia de bases de datos de proteínas no dar pistas a su función. CB3 muestra podrá corresponder a la subunidad 7 de la NADH: ubiquinona oxidoreductase o complejo I (Tabla 3]. Complejo I es un componente fundamental de la membrana de la mayoría de las cadenas de transporte de electrones obligado que se encarga de la transferencia de electrones desde NADH citoplásmico piscinas a la membrana obligado quinona piscina junto a la generación de fuerza motriz de protones. Subunidad 7 es una proteína de membrana periférica de la reducción de quinona núcleo del complejo I [26]. El organismo que contiene la correspondencia más cercana es Cytophaga hutchinsonii, miembro de la Bacteroidetes ensamble de organismos, que es una parte importante de muchas comunidades marinas [27]. Es un estudio sobre la estructura de la población de la Bahía de Chesapeake bacterioplancton mostró que Bacteroidetes grupo representa el ~ 10% del total de la comunidad en la hora de verano [por ejemplo, Kan inédito].

CB6 muestra es similar a una familia de predecir con aminopeptidases no especificado importancia funcional. El más cercano se pongan en venta las proteínas es de Novosphingobium aromaticivorans. Aunque N. Aromaticivorans normalmente es considerado terrestres, y otros Novosphingobium relacionados Sphingobium y Sphingopyxis cepas se distribuyen ampliamente. Como un componente importante de la α-proteobacteria, estos grupos pueden ser detectados y aislados de ambientes marinos y de estuario [[28, 29], Kan inédito]. Esta identificación junto con la de apoyar una CB3 acuáticos origen bacteriano de estas proteínas, que es coherente con su presencia en la Bahía de Chesapeake.

Siguen siendo preguntas sin respuesta respecto a la aplicabilidad de metaproteomics a las comunidades naturales. Entre ellas figuran las siguientes: ¿La proteína se centró en un punto 2D gel SDS-PAGE de una muestra ambiental contienen una proteína o varias proteínas? ¿Qué tipo de información es necesaria para inferir la identidad de puntos entre las diferentes muestras? ¿Cuál es la sensibilidad de metaproteomics a los cambios en la composición de la comunidad y el estado fisiológico de los miembros de la comunidad? ¿Cómo puede inferencias funcional proporcionada por metaproteomics ser de nuevo? ¿El enfoque que se esboza aquí ser aplicables a otros sistemas, tales como los suelos, los sedimentos, y ambientes extremos? Es evidente que es mucho más trabajo y enfoques complementarios deben aplicarse a estos problemas.

Conclusión

A nuestro entender, este estudio representa la primera aplicación de un enfoque para un metaproteomic de alta complejidad acuáticos comunidad microbiana. Los principales objetivos de este estudio fueron desarrollar un método capaz de recoger plancton microbiano proteínas en cantidades adecuadas para el análisis por 2D-PAGE. Esto se logró y se intentó identificar a un subgrupo de estas proteínas. Estos intentos reforzado la idea de que los métodos basados en la secuencia (LC-MS/MS) será necesaria para avanzar en la identificación de proteínas en los sistemas naturales. Los estudios futuros identificará un número mucho mayor de proteínas de la Bahía de Chesapeake comunidades microbianas para abordar las cuestiones planteadas más arriba y proporciona una visión de la dinámica de la comunidad microbiana y función.

Métodos
Cultivos bacterianos

Ocho cepas bacterianas aisladas de la Bahía de Chesapeake superior (Baltimore Inner Harbor) se utilizaron en este estudio. Sobre la base de secuencias de genes 16S rRNA, estas bacterias han sido identificadas como Vibrio vulnificus, Marina Bacillus sp., Marinomonas sp. Psychrobacter pacificens, Pseudomonas sp., Pseudoalteromonas sp. Shewanella sp., Y Hahella sp. Respectivamente [Kan inédito]. Estas bacterias se cultivaron en 1 / 2 YTSS caldo (4 g de extracto de levadura, triptona 2,5 g por litro disuelto en el agua in situ) y cosechada en la fase de crecimiento exponencial mediante centrifugación (10000 × g, 5 min, 4 ° C).

Artificial de la construcción comunitaria y la recuperación

Para determinar si el análisis de la comunidad microbiana 2D SDS-PAGE es viable y representativo, de una simple comunidad mixta artificial se construyó utilizando tres cepas bacterianas diferentes de tamaño: Chlorobium tepidum cepa WT2321 (~ 0.5-0.8 μ m de longitud de la célula), Escherichia coli cepa JM109 ( ~ 1.2-1.6 μ m de longitud de la célula), y una cepa no de Pseudomonas fluorescens (~ 8-10 μ m de longitud) (de células amablemente proporcionados por GA O'Toole, la Universidad de Dartmouth). El contenido de proteína en cada celda para cada cepa fue determinada por la medición de la proteína a través de una modificación del ensayo de Bradford (Bio-Rad) y directa en el recuento de células reproducir muestras de cada organismo. Comunidades que contiene la misma cantidad de proteína para cada cepa se construyeron mediante la mezcla adecuada de los volúmenes de cultivos puros. El simulacro de comunidad se diluye en 5 1, de 10 mM buffer fosfato de potasio (pH = 7,2) a las densidades de células y las células recuperadas. Extractos de proteínas totales de la comunidad y simulacros de cada uno de los miembros cepa fueron hechas por granulación muestras de células en un microfuge y extracción de proteínas por resuspending en 5 M de urea + 2 H thiourea + 2% (w / v) CHAPS + 2% (w / v) SB 3-10 + 40 mM Tris + 0,2% (w / v) BioLyte 3-10 (de extracción secuencial de reactivos 3, Bio-Rad) a temperatura ambiente y vortexing durante 2 minutos.

Comunidad microbiana de muestreo

Picoplancton comunidades fueron recogidos en tres estaciones a lo largo del eje medio de la Bahía de Chesapeake el 7 de junio de 2003 a bordo del R / V Cabo Henlopen (Fig. 1]. Las estaciones de 858, 804 y 707 representan a la parte superior, medio e inferior de la Bahía, respectivamente. En cada estación, 0,2 g de cloranfenicol (Fisher Científico, NJ) y 2 ml de inhibidor de la proteasa cóctel II (CalBiochem, CA) se añadieron a 20 l de agua de la superficie (1 m por debajo) para detener e inhibir la síntesis de proteínas de las actividades de las proteasas. Las muestras fueron filtradas a través de pre-3 - μ m de tamaño de poro de los filtros de policarbonato (142-mm de diámetro; Millipore, Bedford, MA) para eliminar las partículas grandes y eucariotas. El filtro fue reemplazado cada 5 litros. Células microbianas en el filtrado, se concentran a un volumen final de 150 ml utilizando una ultrafiltración de flujo tangencial-(30000 MW de corte), como se describe en otro lugar [30]. Copia de las muestras de agua se recogieron en la estación 804. Células microbianas en el retentate se pildoradas mediante centrifugación GS-15R (Beckman, Fullerton, CA) a 13000 × g, 4 ° C por 10 minutos. Las células fueron recogidas enjuagarse con TS lavado buffer (Tris-HCl 10 mM, Sacarosa 250 mM, pH 7,6) y resuspendió con 0,5 ml de buffer de extracción. Consistió en la extracción de amortiguación de 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 7 M urea y 2 M thiourea, 10% (v / v) de glicerol, 2% CHAPS, 0,2% amphylotes, 0,002 M tributilo de fosfina (PDD) , DNasa (0,1 mg / ml), RNasa (0,025 mg / ml) y el inhibidor de proteinasa cóctel (CalBiochem, CA). PDD, DNasa, y RNasa inhibidor de proteinasa cóctel recién añadido a la amortiguación antes de la aplicación de las muestras. Las células se almacenan congelados hasta su posterior procesamiento.

Para estimar la eficiencia de recuperación de ultrafiltración, las células bacterianas fueron contados antes y después de la ultrafiltración. Células bacterianas fueron teñidos con SYBR Gold (Molecular Probes, Inc, Eugene, Oreg.) Siguiendo el protocolo descrito anteriormente [31]. Células bacterianas fueron enumeradas en la excitación azul (485 nm) en un microscopio Zeiss Axioplan epifluorescence (Zeiss), utilizando 63 × Antiflex Neoflua petróleo lente objetivo. Al menos 200 células bacterianas por muestra fueron contados.

Extracción y purificación de proteínas

Por 1D-PAGE, proteínas de las comunidades microbianas naturales y cultivadas de las bacterias fueron extraídas con buffer de lisis (50 mM Tris-HCl, SDS 2%, 10% v / v glicerol, 0,1 M de TDT, Azul de bromofenol 0,01%, pH 6,8). Las células fueron suspendidas en buffer calienta en un baño de agua hirviendo durante 2 minutos seguido por centrifugación (10000 × g, 4 ° C durante 3 min). El sobrenadante fue recogido y 20 μ g de proteína para cada uno se cargaron en geles de poliacrilamida. La tinción de plata se aplicó a 1D-PAGE geles.

Por 2D-PAGE muestras, células en suspensión fueron pasados a través de una celda de presión francés (SLM Aminco) en 20000 lb / 2 en dos veces y luego se incubaron en hielo por 20 minutos. Durante el hielo de incubación, las muestras fueron vortex por 15 segundos cada 5 minutos. Los grandes restos celulares fue removido por centrifugación (10000 × g, 4 ° C durante 5 min). Las proteínas en el sobrenadante se precipitó con trichloracetic ácido y resuspendido en buffer de extracción. Concentración de proteínas de la muestra se determinó a través de la RC DC kit de ensayo proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA). Extraído proteínas fueron almacenadas a -80 ° C.

Centrándose isoeléctrico (IEF) y SDS-PAGE

La primera dimensión de la separación de las proteínas se llevó a cabo en el gradiente de pH inmovilizado (IPG) tiras (11 cm, pH 3-10 o 4-7) en un Bio-Rad proteiforme sistema IEF Cell (Bio-Rad, Hercules, CA). Cada 2D-PAGE se realizó utilizando 100 μ g de proteína total. El programa fue IEF: 250 V durante 20 minutos seguidos con un ramal en dirección lineal 8000V durante 2,5 h, y 8000V para un total de 40000 V-hr con una pista rápida. Después de la primera dimensión, el IEF se equilibrada en tiras fresca Buffer 1 (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 50% glicerol) y tampón de 2 (6 M urea, 2% SDS, 0,375 M Tris / HCl pH 8,8, 20% glicerol y 0,5 g iodoacetamide) (Bio-Rad, Hercules, Calif), respectivamente.

La segunda dimensión de 2D-PAGE se realizaron con un 8-16% gradiente prefabricados de geles de poliacrilamida (Bio-Rad, Hercules, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los geles se tiñeron con SYPRO Ruby (Bio-Rad, Hercules, CA) después de la electroforesis y escaneadas usando un tifón 9410 fluorescentes de imágenes (Amersham, NJ) con 488nm de excitación y de emisión filtro 610 BP30.

Metaproteome de análisis de imágenes

Las imágenes se analizaron y compararon cuantitativamente utilizando el paquete de software de la proteómica Z3 (Compugen, Israel). El gel se compararon las imágenes en el modo de múltiples gel utilizando el total de la densidad en gel método de cuantificación in situ. Todos los geles fueron sometidos a los mismos parámetros de la detección in situ seguida de equiparación automática. Pares comparaciones de los geles se inspeccionaron y coincidencias editado manualmente para eliminar la mala calidad o de baja intensidad de los partidos. Cuando no se pongan en venta automática, el número de lugares de incomparable acompañado y se estimó por el examen manual de superponerse 2D SDS-PAGE imágenes.

Identificación de proteínas por espectrometría de masas

Proteína spots fueron extirpados de geles manualmente utilizando pipetas Pasteur y digerido descrita por Mann et al. [32]. Tríptico péptidos fueron analizados tanto a través de MALDI-TOF y LC-MS/MS. MALDI espectros fueron adquiridos en un Bruker (Billerica, MA) Biflex III espectrómetro de masa MALDI reflectron operan en el modo con el retraso en la extracción. Exteriores de calibración se realizó a través de Calibración Mezcla 2 de la Misa Sequazyme Péptido Normas Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). LC-MS/MS se realizó en un Micromass (Beverly, MA) Q-TOF Ultima API-Estados Unidos, junto a un Micromass capLC. Tríptico resúmenes fueron separados utilizando tanto una columna C18 de captura para el lavado y la concentración (LC Envases (Sunnyvale, CA) 300 μ m × 5 mm C18) C18 y una columna de análisis para mejorar la separación (LC Envases 180 μ m × 15 cm C18). El sistema constaba de disolvente del 95% al 0,1% de ácido fórmico, el 5% de acetonitrilo de la fase acuosa y 95% acetonitrilo, el 5% al 0,1% de ácido fórmico para la fase orgánica. Un gradiente 60/60 (el 60% orgánicos, en 60 min) funcionando al μ l l / min se utilizó la mayoría de los péptidos de elución de ~ 30% orgánicos. El LC eluyente se electrosprayed directamente en el Q-TOF utilizando el nanosprayer fuente. Los datos dependen de la digitalización se utilizó con MS y MS / MS espectros ser adquiridos durante un plazo LC. Spectra fueron procesados y encontrados deconvoluted utiliza programas con el sistema operativo Micromass, MassLynx v. 3,5.

MALDI-TOF pico Se realizaron búsquedas en las listas en contra de las bases de datos de secuencias de proteínas utilizando la matriz de Ciencia Mascotas http://www.matrixscience.com/search_form_select.html interfaz web. Deconvoluted MS / MS espectros se analizaron utilizando una versión de demostración de software PeaksStudio 3,0 (Bioinformática Solutions Inc, Canadá) para la predicción de secuencias de novo. Todas las secuencias de la proteína de cada lugar fueron utilizados como consultas en MS-BLAST como las descritas por Shevchenko et al. [33] a través de la MS-BLAST http://dove.embl-heidelberg.de/Blast2/msblast.html interfaz web.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

Damos las gracias al Dr Brian Bradley de la Universidad de Maryland Baltimore County, el doctor Ogunseitan delegados de la Universidad de California, Irvine, y Mike Schwalbach de la Universidad del Sur de California por sus comentarios sobre este manuscrito. Los autores gracias Murray V. Johnston de la Universidad de Delaware de la prestación de los servicios de la UD instalación de la espectrometría de masas. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias, Observatorios Programa microbiana (MCB-0132070, MCB-0238515, MCB-0537041, 0536982-MCB), INBRE programa del Centro Nacional para Recursos de Investigación (NIH subvención P20 RR16472-04) , Y el apoyo a JMG de NSF DBI-0096578.