Journal of Carcinogenesis, 2005; 4: 15-15 (más artículos en esta revista)

La apoptosis inducida por el tibetano remedio a base de hierbas PADMA 28 en las células T derivadas de la leucemia linfocítica línea celular CEM-C7H2

BioMed Central
Marcel Jenny (marcel.jenny @ uibk.ac.at) [1], Wolfgang Schwaiger (wolfgang.schwaiger @ uibk.ac.at) [1], David Bernhard (david.bernhard @ uibk.ac.at) [2] , Oliver A Wrulich (oliver.wrulich @ uibk.ac.at) [1], Daria Cosaceanu (daria.cosaceanu @ cck.ki.se) [3], Dietmar Fuchs (dietmar.fuchs @ uibk.ac.at) [ 4], Florian Ueberall (florian.ueberall @ uibk.ac.at) [1]
[1] División de Bioquímica Médica, Biocenter, la Escuela de Medicina de Innsbruck, Fritz Pregl-str. 3 6020, Innsbruck, Austria
[2-6020, Innsbruck, Austria
[3-17176, Estocolmo, Suecia
[4] División de Química Biológica, Biocenter, la Escuela de Medicina de Innsbruck, Fritz Pregl-Str. 3, 6020, Innsbruck, Austria.

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Resumen

El tibetano remedio a base de hierbas PADMA 28 revelado resultados prometedores para apoyar el tratamiento de la aterosclerosis, síndrome de Charot (claudicación intermitente), hepatitis crónica activa y la infección de las vías respiratorias. El recurso fue confirmado a estar estrechamente vinculados con anti-y pro-oxidativa propiedades in vitro. En este estudio, y la supervivencia apoptogenic efectos de PADMA 28 fueron investigados en la células T derivadas de la leucemia linfocítica línea celular CEM-C7H2.

PADMA 28 dio lugar a una concentración que dependen de la inhibición de la proliferación celular acompañada de la acumulación de células CEM-C7H2 en subG1 fase, la fragmentación de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y el organismo nuclear de la formación. El tratamiento con PADMA 28 rescatados, en cierta medida, las células que expresan el exceso de Bcl-2 de la apoptosis. Este hallazgo sugiere que el mecanismo de acción de PADMA 28 puede ser a través de interferencia con Bcl-2 desencadenó las vías de supervivencia.

Antecedentes

En su composición, PADMA 28 se corresponde en gran medida a una fórmula a base de plantas derivados de la medicina tibetana que se utilizó en Polonia en la primera mitad del siglo 20 en contra de enfermedades inflamatorias crónicas. En las dos últimas décadas, esta fórmula se ha administrado con o sin agua hervida tibia enfriado a agua caliente a un gran número de pacientes que sufren de la enfermedad oclusiva vascular periférica en Europa y revelado resultados prometedores en la claudicación intermitente [1], [2] la aterosclerosis , Y de la hepatitis B crónica activa [3].

Se informó de que tanto anti-y pro-oxidativa propiedades in vitro [4]. En ratón macrófagos PADMA 28 se encontró que inhibe la síntesis de óxido nítrico inducible (iNOS) por la disminución de iNOS mRNA y los niveles de proteína iNOS [5]. Recientemente, Neurauter et al. PADMA 28 demostrado que modula el interferón-γ inducida por la degradación del triptófano y neopterin humanos en la producción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) [6]. Otros han informado sobre su anti-inflamatorio y anti-aterogénicas propiedades [7].

Es generalmente aceptado que el mal funcionamiento de la apoptosis o suicidio celular es uno de los conmutadores de maestro en tumourigenesis [8 - 10]. La acumulación de células en fase subG1, la degradación del poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y el organismo nuclear de la formación son características de la apoptosis. En este estudio, utilizando CEM-C7H2 células de la leucemia, que investigó si y de qué manera influye en la apoptosis PADMA 28.

Bcl-2 es el miembro de la familia de genes implicados en el equilibrio entre la muerte celular y la supervivencia celular [11]. En el presente estudio, la influencia de PADMA 28 de Bcl-2 en la señalización CEM-C7H2 células deficientes en p53 y p16 funcional de señalización se estudió en un sub-CEM línea Bujard construido con el sistema en el que el gen Bcl-2 es inducida a Retirada de la tetraciclina [12].

Métodos
Sustancia de ensayo

PADMA 28 se presentó en forma de polvo como sustancia activa mezcla sin excipientes por PADMA Inc Schwerzenbach, Suiza. La mezcla de hierbas es un polvo fino polvo marrón con un olor pungente característico. Es una mezcla de una gran variedad de hierbas (403 mg de ingredientes activos): Aegle marmelos (Bengala Quince) de fruta (20 mg); Pimenta dioica (Allspice) de fruta (25 mg); Aquilegia vulgaris (Columbine) parte aérea (15 Mg); Calendula officinalis (Marigold) flor (5 mg); Elettaria cardamomum (cardamomo), frutas (30 mg); Syzygium aromaticum (Clove) yema floral (12 mg); Saussurea lappa (Saussuria) raíz (40 mg); Hedychium spicatum (Hedychium) rizoma (10 mg), Lactuca sativa (Lechuga) hojas (6 mg); Cetraria islandica (Islandia musgo) talos (40 mg); Glycyrrhiza glabra (regaliz) raíz (15 mg); Azadirachta indica (Margosa) de fruta ( 35 mg); Terminalia chebula (Myrobalan) de fruta (30 mg); Plantago lanceolata (Ribwort) parte aérea (15 mg); Polygonum aviculare (Knot-césped) parte aérea (15 mg); Potentilla aurea (Golden Cinquefoil) parte aérea ( 15 mg); Pterocarpus santalinus (Sándalo Rojo), la madera (30 mg); Sida cordifolia (Corazón de hoja Sida) parte aérea (10 mg); Valeriana officinalis (Valeriana) raíz (10 mg), y Aconitum napellus (Monkshood) tubérculo ( 1 mg). También están presentes no a base de hierbas 2 componentes: Dextrocamphora (alcanfor natural) (4 mg) y Calcii sulphas pulv. (Gipsum, 20 mg).

En paralelo, un derivado de esta mezcla, PADMA básica, también fue estudiada y sus efectos en comparación con el PADMA 28. En vista de los diferentes estándares farmacéuticos en Austria y Estados Unidos, Aconitum napellus se omite en PADMA Basic.

Dado que los datos sobre PADMA 28 fueron plenamente concordantes con las de PADMA básica sólo cifras que muestran PADMA 28 se muestran los datos.

Mandantes individuales, así como el conjunto de las mezclas se realizaron inspecciones y fabricadas de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación (GMP). La presencia de metales pesados, plaguicidas y fosfatos orgánicos fue controlado por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Cromatografía en capa, utilizando un escáner TLC-, se utilizó para cada lote de huella digital de cada componente individual (por ejemplo, aceites esenciales). Terpenos fueron supervisadas por cromatografía de gases y espectrometría de masas. Los lotes fueron rechazados cuando los resultados de las huellas dactilares difiere sustancialmente de la de material de referencia.

Líneas celulares, la cultura y las condiciones de transfección transitoria de los procedimientos

CEM-C7H2, un glucocorticoide sensible a la línea de sub-CCRF-CEM-C7 células [13], se cultivaron en medio RPMI 1640 (PAA Laboratories, Linz, Austria), complementado con el 10% de calor-suero de ternera fetal inactivado (Biochrom, Berlín , Alemania), 100 U / ml de penicilina, 100 μ g / ml estreptomicina (Bio-Whittaker, Walkersville, MD), y 2 mM L-glutamina (Serva, Heidelberg, Alemania) a 37 ° C en un ambiente humidificado de 95% de aire Y 5% de CO 2. Mono verde africano riñón fibroblastos (COS-1, 10 6 / 100 mm plato), las células se mantenían en fase logarítmica de crecimiento, en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (MEDM) suplementado con 10% inactivado por calor suero de ternera fetal, y 2 mM L-glutamina En un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2.

Dos horas después de la transfección, las células fueron lavadas con pre-calentado MEDM y mantenerse en RPMI. 24 h antes de la cosecha de las células PADMA 28 extractos o disolvente se añadieron los controles.

Disponibilidad de soluciones de PADMA 28 y PADMA básica se prepararon de etanol (EtOH 70%, v / v), metanol (MeOH), y dimethylsulfoxide (DMSO, 1:1 agua destilada) y se mantuvo a -20 ° C. Polvo PADMA 28 (400 mg) fue mezclado vigorosamente en un volumen total de 2 ml de disolvente y se agita durante 30 min a 180 rpm a 37 ° C. La mezcla fue centrifugada a 2000 × g durante 10 minutos y los sobrenadantes fueron estériles-filtrada (tamaño de poro 0,22 μ m). Las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de PADMA 28 o PADMA Básico (concentración final rango 0,4 mg / ml (1:500) - 1,0 mg / ml (1:200) disolvente).

En experimentos paralelos, efectos de la pura etanol, el metanol y el DMSO (Merck, Darmstadt, Alemania) en concentraciones comparables a la mayor concentración en los extractos diluidos PADMA 28 fueron investigados. La viabilidad de las células después de la aplicación se determinó por el método de exclusión con azul de tripan.

Fluorescencia de imágenes

48 h después de transfección, la cubierta se desliza lavado dos veces con PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,6 mM Na 2 HPO 4 × 12 H 2 O, 1,3 mM NaH 2 PO 4 × H 2 O), y las células fueron fijadas con Un 4% de solución de p-formaldehído durante 15 minutos y de ser necesario, los núcleos se tiñeron por adición de 1 μ g / ml DAPI (4 ', 6'-diamidine-2'-phenylindole dihidrocloruro, Roche Molecular Biochemicals) diluido en PBS para 10 min. Por último, la cubierta se desliza se lavaron tres veces con PBS y montadas sobre portaobjetos con Mowiol solución de montaje (Calbiochem, Suiza). Se realizaron estudios de microscopía por Olympus BX50 que cuenten con un microscopio de fluorescencia y las imágenes fueron tomadas con la cámara digital Microview TE/CCD1317-K/1 (instrumentos científicos de Princeton, EE.UU.). Se realizó el análisis de imágenes mediante el uso de las imágenes de software Metamorph (Universal Imaging Corporation).

Citometría de Flujo

Detección de apoptosis fue por FACS análisis de yoduro de propidio nuclear de las células teñidas CEM. Brevemente, 5 × 10 5 células fueron permeabilized y teñidas con 750 μ l de yoduro de propidio (50 μ g / ml en el 0,1% Triton X-100/0.1% citrato de sodio) y sometidos a análisis de la apoptosis en un FACScan (FL-2 canales, Becton Dickinson , San Jose, California, EE.UU., equipado con un láser de argón). Sobre la base de yoduro de propidio tinción, las células de la sub-G1 marcador ventana se consideraban apoptosis. Junto con yoduro de propidio nuclear de fluorescencia, dispersión de luz también se midió. Según el análisis de dispersión de luz, núcleos apoptóticos se reconocen como más pequeños (menores valores de dispersión hacia adelante) y más granulada (sideward más altos valores de dispersión). De células pequeñas partículas de los desechos y se excluyeron del análisis por adelante / sideward criterios de dispersión tal y como se describe en otro lugar [14].

PARP división

CEM-C7H2 células fueron sembradas en 100 mm de diámetro platos. Logarítmicamente creciente células fueron lavadas una vez con helado de buffer fosfato salino (PBS) y lisadas en 0,5 ml de Triton X-100 buffer de lisis (50 mM Tris / HCl, pH 7,3, 50 mM NaCl, 5 mM Na 2 HPO 4 × 12 H 2 O, 5 mM NaF, 5 mM EDTA, 50 μ g / ml de aprotinina y leupeptina ambos, y el 2% Tritón X-100) durante 20 min en hielo. Lisados fueron aclarados por centrifugación a 10,000 × g durante 10 minutos a 4 ° C después de un posterior procedimiento de sonificación. Se determinaron las concentraciones de proteínas de acuerdo a Bradford. Después de las muestras de ebullición durante 5 minutos, la igualdad de las cantidades de proteínas, se dividieron en un 10% SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida. Traslado al Immobilon-P membranas PVDF (Millipore, Viena) en 25 mM Tris / HCl, pH 7,5, 193 mM glicina, 20% (v / v) de metanol, y el 0,1% SDS a 300 mA constante durante 1 h. Después de secante, las membranas se sumergen durante 10 minutos en metanol y se lavan tres veces en TBST (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, y el 0,5% (v / v) de Tween 20). Membranas fueron bloqueadas la noche a la mañana con TBST conteniendo 5% (w / v) de leche desnatada en polvo a 4 ° C, y luego probaron con el ratón de anticuerpos anti-PARP (diluida a 1:200 en solución de bloqueo, Calbiochem, número de catálogo 30-100UG) por 1 H a temperatura ambiente. Después de lavar en TBST (4 veces durante 15 min) la blots se incubaron con peroxidasa de rábano-conjugado IgG anti-ratón (1:2000 dilución en la solución de bloqueo) de 45 minutos a temperatura ambiente. Membranas se lavaron de nuevo en TBST (4 veces, 15 min) y la inmuno-reactiva bandas se visualizaron por una mayor detección chemiluminiscence (ECL, Amersham, Viena, Austria).

Resultados

Proliferación, la inhibición y alteraciones morfológicas de las células CEM-C7H2 inducida por PADMA 28. CEM-C7H2 células fueron tratadas con diferentes concentraciones de PADMA 28. Proliferación fue determinado por el número de células en un contador Coulter. La figura 1 muestra que la aplicación de varias concentraciones de PADMA 28 (0,4 mg / ml, 1,0 mg / ml) inhibió la proliferación de las células CEM en una concentración-y tiempo-dependiente. La adición de los extractos de PBS resolverse en la misma concentraciones fueron menos eficaces que los extractos alcohólicos, lo que sugiere que los principios activos farmacológicamente de PADMA 28 se extraen mejor por unpolar disolventes. DMSO solos a las concentraciones que se aplica no tiene ningún efecto sobre la proliferación celular.

En las células cultivadas CEM tratados con PADMA 28, alteraciones morfológicas de los núcleos característica de la apoptosis fueron visibles. Esto se muestra en el panel D de la figura 2.

PADMA 28-inducida subG1 transición

El G1 y la fase G1 / S estado de la transición del ciclo celular son los puntos críticos en los que la célula evalúa si debe entrar en otro pleno ronda de la división, dejen de crecer, o morir.

De las poblaciones de células de transición de G1/Go a subG1 fase es un signo frecuente de la apoptosis. Como se muestra en la figura 3, la aplicación de 1 mg / ml PADMA 28 para 48 h resultó en la acumulación de aproximadamente el 50% de las células en fase subG1.

PARP división cinética

Activación de pre-existente a favor de las caspasas tiene lugar en una secuencia ordenada jerárquicamente a partir de la activación de las caspasas iniciador y conduce a la activación de las caspasas efectoras como la caspasa 3. Las caspasas 3 es transportada una serie de proteínas, un sustrato que se poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) [15]. PARP es un dedo de zinc-ADN vinculante enzima que detecta filamento de la DNA pausas generadas por agentes genotóxicos, como los radicales de oxígeno. PARP se activa en una fase intermedia de la apoptosis y se inactiva por proteolíticas división en una fase tardía de casapase 3 y caspasa 7. Hemos planteado la cuestión de si el tratamiento con células CEM PADMA 28 causa una caspasa 3 - o 7 mediada proteolíticas división de PARP. La figura 4 muestra este es el caso. Tratamiento de la CEM-C7H2 células durante 34 h causado una fragmentación de la PARP proteolítica, con acumulación de fragmentos de los 89 kDa (inferior bandas) y de la concomitante desaparición del mismo tamaño de 113 kDa (superior bandas) fracción (Figura 4, ranura 4, 6, y 8). Como fue el caso con efecto inhibitorio del crecimiento, PBS soluciones de PADMA 28 fueron menos eficaces que etanólica, metanólica o extractos DMSO.

PADMA 28 interfiere con la función de Bcl-2

Si una célula vive o muere es determinada en gran medida por la función de Bcl-2 [11]. Si PADMA 28 desencadena la apoptosis por interferir en favor de la supervivencia de señalización Bcl-2, debería ser posible reducir la pro-apoptóticos señal por la sobreexpresión de Bcl-2. Como se muestra en las figuras 5 / 6, PADMA 28-mediada por la inducción de la apoptosis fue disminuido (Figura 5, 6 y 8 bar) de la transitoria sobreexpresión de Bcl-2 en un CEM de células sub-línea en la que la expresión de los genes se trans - Inducida por la retirada de doxocycline (Bujard sistema, CEM C7H2 Bcl-2 TET off).

Bcl-2 de expresión está controlada, en cierta medida, por la liberación de citoquinas tipo Th1-IFN-γ [16]. Por ello, quisiera sugerir que PADMA 28 puede modular apoptogenic vías controlado por el interferón-γ.

En este contexto cabe mencionar que PADMA 28 se ha informado de modular el interferón-γ inducida por la degradación del triptófano y neopterin humanos en la producción de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos [6].

Discusión

Aquí nos muestran que PADMA 28 añade a las células T derivadas de las células en la leucemia linfática cultura tiene una pronunciada concentración y tiempo-dependiente de efecto anti-proliferativo. La inhibición de la proliferación celular se acompaña de la formación de organismo nuclear morfológico de señales de apoptosis. Además características de la apoptosis, tales como la acumulación de células en subG1 fase, y la fragmentación de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) podrían ser detectadas.

Un creciente cuerpo de evidencia que demuestra la supervivencia celular y la muerte celular están determinados en gran medida por la función de Bcl-2 miembros de la familia. Aquí nos muestran que la inducción de apoptosis por PADMA 28 se puede contrarrestarse eficazmente por sobreexpresión de la proteína en favor de la supervivencia de Bcl-2. Sobre la base de nuestros datos nos sugieren que PADMA 28 podrán actuar en un pro-apoptóticos de moda por interferir con Bcl-2 de señalización.

Expresión de Bcl-2 es, en parte, controlado por el interferón-γ [16, 17]. Una influencia de PADMA 28 sobre el interferón-γ mediada por señales quedó demostrado recientemente por Neurauter et al. [6] en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Encontraron que PADMA 28 tiene un marcado efecto en el interferón-γ-neopterin estimulado la producción y la degradación del triptófano en PBMC estimuladas [6]. Esta observación parece ser de especial importancia ya que de citoquinas inducida por la degradación del triptófano indoleamine (2,3)-dioxygenase (IDO) es un potente mecanismo para inducir la apoptosis de células T y la tolerancia a través de la privación de los aminoácidos esenciales triptófano y por la pro - Apoptóticos actividad de varios triptófano catabolites formado en esta reacción de la enzima [18]. Además, se están acumulando pruebas de que la activación de IDO pueden representar un mecanismo de escape inmune de las células tumorales [19].

Suponiendo que la estimulación de PBMC por mitogens provoca estrés oxidativo en la cultura, parece razonable sugerir que el mencionado efecto de PADMA 28 se debe a su capacidad de funcionar como antioxidante. Esta hipótesis está de acuerdo con las conclusiones que PADMA 28 iNOS disminuye los niveles de mRNA del ratón macrófagos [5], un proceso fundamental que puede contribuir a la actividad antiinflamatoria demostrada por otros [2 - 7].

Aunque PADMA 28 se ha demostrado para inhibir la proliferación de las células y causa la apoptosis de células bajo condiciones de cultivo, una gran cuestión que queda sin respuesta: ¿Hay alguna ventana terapéutica multifactorial para utilizar un remedio a base de hierbas, como la PADMA 28, como suplemento en el tratamiento de la leucemia Pacientes?

Agentes quimioterápicos son más eficaces cuando se administra en combinación (por ejemplo, CHOP, la quimioterapia multifactorial régimen compuesto de doxorrubicina, ciclofosfamida, prednisona y vincristin). Chino tradicional o de la medicina tibetana usos natural de las mezclas de hierbas y extractos de hierbas para el tratamiento del cáncer. Muchos de los remedios a base de hierbas de uso común que se han probado han dado las actividades que desaparecieron cuando los extractos fueron fraccionado en distintos componentes químicos. Estamos de acuerdo con Keith T. Curtis et al. (Nature Reviews, Drug Discovery, 2005) [20] de que un enfoque en múltiples terapéutica podría llevar a nuevas perspectivas en el descubrimiento de medicamentos y terapéutica multifactorial, que son necesarios para el tratamiento de enfermedades multifactoriales. De acuerdo con este concepto, PADMA 28, una fórmula a base de hierbas multifactorial, podría ser igualmente eficaz como un agente de quimioterapia administrada como suplemento, y / o ser capaz de reducir al mínimo los efectos secundarios tóxicos de tal régimen.

No está claro en qué medida se pueden extrapolar los resultados de nuestros experimentos con cultivos de células a los posibles efectos en los seres humanos. No todos los compuestos pueden ser absorbidos eficientemente, y existe un gradiente entre las concentraciones presentes en los extractos y las establecidas en la sangre. No obstante, se puede estimar la presencia de todos los ingredientes en el tracto gastrointestinal en concentraciones razonables, lo que hace anti-inflamatorios y pro-apoptóticos potencia más probable. Esta hipótesis se ve reforzada por el hecho de que PADMA 28 es utilizado con éxito para el tratamiento de la claudicación intermitente, la aterosclerosis, la esclerodermia, esclerosis múltiple y hepatitis crónica.

Los ensayos clínicos se necesitan para determinar si PADMA 28 puede ser utilizado eficazmente en el tratamiento de los cánceres. Sin embargo, estudios bioquímicos podrían ayudar a reducir la brecha entre convencionales y alternativos tumor estrategias de la terapia. Adicional estudios centrados en la importancia biológica de PADMA 28-mayor apoptosis celular en diversos sistemas de gran ampliar nuestra comprensión del modo de acción de este recurso. Con el fin de aclarar la función biológica de PADMA 28 en la moda molecular, la expresión de genes de perfiles de los experimentos mediante el empleo de la tecnología de Affymetrix están actualmente en curso.

Agradecimientos

Estamos en deuda con Stefan Geley por darnos la leucemia linfocítica aguda sub-líneas celulares (CEM y CEM-C7H2 y TET-off). Gracias también debido a Rajam Csordas para la lectura crítica del manuscrito y asistencia editorial. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención por el Consejo de Investigación de Austria Grant (FMF), el Centro de Investigación de Ciencia SFB F021, la proliferación de células y la muerte celular en los tumores - Mecanismos moleculares que subyacen a la interacción de la proliferación y la apoptosis.